Mezcladores de microfluidos para el estudio plegamiento de proteínas

El objetivo general de este procedimiento es mezclar rápidamente dos soluciones para iniciar una reacción bioquímica a escala de microsegundos. Esto se logra primero fabricando un mezclador microfluídico. El segundo paso consiste en unir un chip a un cubreobjetos para sellar los canales.

A continuación, el chip se monta en una placa base que contiene los depósitos de solución. El paso final consiste en obtener imágenes de la solución mezclada mediante microscopía de fluorescencia confocal. En última instancia, la reacción bioquímica se registra a escala de tiempo de microsegundos al convertir la distancia a lo largo del canal de salida en tiempo.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la mezcla por parada de flujo es que la mezcla no está limitada por la turbulencia y ocurre en unos pocos microsegundos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento de proteínas, como ¿cuándo ocurre el colapso hidrofóbico? Quien demostrará el procedimiento será Ling Woo, una posdoctoranda de mi laboratorio, para comenzar la fabricación de chips de mezcla microfluídicos.

Primero, limpie cuatro obleas de sílice FU de cuatro pulgadas con una solución de piranha fresca, como se describe en el protocolo escrito que acompaña a este video. A continuación, utilice un horno de deposición química de vapor a baja presión para aplicar un recubrimiento de polisilicio de aproximadamente un micrómetro de espesor por cada 10 micrómetros de profundidad previstos para los canales microfluídicos finales. Tras un tratamiento adicional de las obleas, como se describe en el texto, aplique por centrifugación una capa de 900 nanómetros de espesor de un fotoresist Z 52 14, seguido de un horneado suave a 90 grados Celsius directamente sobre una placa calefactora durante un minuto o en un horno a 110 grados Celsius durante 30 minutos.

Después de alinear una máscara fotográfica, realice un contacto duro y al vacío exponiendo primero la resistencia fotosensible a luz ultravioleta durante varios segundos. A continuación, revele el patrón en la resistencia fotosensible según se indica en el protocolo escrito. Inspeccione las características en la oblea con un microscopio y realice un horneado duro a 115 grados Celsius directamente sobre una placa calefactora durante dos minutos.

A continuación, desgasifique las obleas con Asher o plasma de oxígeno durante 2,5 minutos a una potencia de RF de 100 vatios. Utilizando un grabador iónico reactivo en profundidad, grabe la capa de polisílice completamente hasta alcanzar la sílice fundida debajo. Retire la fotoresina restante y trate la oblea según lo indicado en el texto.

Mida la profundidad del grabado para asegurarse de que atraviese completamente el recubrimiento de poli. Utilizando un grabador iónico reactivo profundo con capacidad de óxido, grabe la sílice fundida hasta una profundidad de aproximadamente 10 micrones por cada micrón de espesor del recubrimiento de poli. Limpie la oblea con el ashing de matriz durante cuatro minutos, con una potencia de RF de 100 vatios, y elimine el polisilicio con un grabador de fluoruro de xenón antes de perforar agujeros en la oblea. Aplique por centrifugación una nueva capa de un micrón de resistencia fotolitográfica para proteger los canales durante los manipulados posteriores.

Luego monte la oblea con la cara de características hacia abajo sobre una placa de vidrio sacrificial utilizando Aqua Bond 55. Tenga cuidado de mantener el unidor libre de burbujas, utilizando una perforadora de punta de diamante controlada por computadora y refrigerada con solución limpiadora micro 90. Esto evita que pequeños fragmentos de vidrio se adhieran a los canales, lo que podría obstruir el chip durante su uso.

Proceda a perforar orificios de entrada y salida en cada chip. Enjuague la oblea con agua desionizada utilizando una jeringa para inyectar agua en cada orificio. Luego, sumérjala en agua jabonosa durante una hora tras retirar la foto.

Resistente y adhesivo como se describe en el texto. Enjuague la oblea con agua desionizada y agua jabonosa tibia. Enjuague cada orificio nuevamente con una jeringa, evitando las estructuras grabadas después de hacer pasar nitrógeno sobre la oblea.

Continúe secando en un horno al vacío ajustado a 120 grados Celsius. Inspeccione los orificios para asegurarse de que estén libres de partículas y repita los pasos de limpieza según sea necesario. Los siguientes pasos deben realizarse en la sala limpia.

Mida la profundidad de los canales con un perfilador de superficie óptico o mecánico. Limpie la oblea y un cubreobjetos de sílice fundida como se describe en el texto en un cuarto limpio. Seque completamente la oblea con gas de nitrógeno durante al menos cinco minutos.

Luego, coloque el oblea con la cara de las características hacia arriba sobre una pila de tres a cuatro toallitas de sala limpia colocadas sobre una superficie dura y plana, como un pequeño panel de vidrio. Repita el procedimiento con el cubreobjetos. Sujete el cubreobjetos por el borde e inviértalo de manera que la cara pulida quede mirando hacia abajo sobre el oblea.

Alinee cuidadosamente los bordes planos, coloque la cubeta sobre la oblea y déjela asentarse; mueva horizontalmente solo para ajustar el alineamiento. Presione hacia abajo con un dedo en el centro de la oblea. Se debe observar un frente de unión que comienza a propagarse hacia afuera.

Si es necesario, aplique presión adicional en otras posiciones alrededor de la oblea para avanzar el frente de unión. Después de colocar las obleas selladas en un horno de alta temperatura programado con el perfil de temperatura indicado en el texto, corte la oblea con una sierra cortadora de obleas en chips individuales. La placa base para sostener el chip mezclador y las soluciones puede estar hecha de plástico como lexan o plexiglás, o de aluminio.

Para el control de temperatura, fije el chip al manifold mediante pequeñas juntas tóricas y sujételo en su lugar con un anillo de retención que permita una vista óptica clara del centro del chip. Las ranuras para las juntas tóricas deben ser más superficiales que las estándar para garantizar un buen acoplamiento sin aplicar demasiada presión sobre el chip. Una vez montado el chip, agregue soluciones a los depósitos central y laterales, teniendo cuidado de liberar cualquier burbuja atrapada en el fondo de los pozos.

Coloque el colector en un microscopio invertido y examine la región de mezcla mediante la salida del ocular o de la cámara. Una linterna incandescente colocada encima del colector proporcionará suficiente luz. Utilice un colorante o una solución con alto índice de refracción en el canal central para visualizar el chorro.

Dado que los volúmenes utilizados en este mezclador son tan pequeños, el flujo puede controlarse mediante presión de aire aplicada por encima de los pozos de la solución. Para visualizar el chorro, comience con la presión del canal lateral en cero libras por pulgada cuadrada y aumente lentamente hasta igualar la presión del canal central. Si un canal lateral está obstruido, el chorro será empujado contra una de las paredes del canal de salida.

Si aparece un tapón visible, puede eliminarse aplicando presión o vacío al canal de salida con una jeringa. Si la proteína u otro material orgánico obstruye el chip, puede limpiarse mediante remojo y solución piraña durante la noche. Introduzca un haz láser recubierto en un microscopio de investigación utilizando un espejo dicróico dentro o justo fuera del microscopio.

Alinee el láser de forma que el enfoque pueda verse en el ocular o en la cámara algo cerca de la región de mezcla. La fluorescencia de la proteína en el mezclador se recoge mediante el objetivo y se dirige a través del espejo dicróico, enfocada por una lente, hacia un diafragma y se proyecta sobre un contador de fotones. Escanee el chip utilizando un escáner piezoeléctrico en las direcciones x e y para obtener una imagen de la región de mezcla.

Seleccione una posición en el chorro y realice un barrido en X e Y para encontrar el enfoque en el centro del canal verticalmente. La profundidad de campo del microscopio es mucho menor que la profundidad del canal, y la velocidad de flujo es uniforme en el canal excepto dentro de un micrómetro de las paredes. Por lo tanto, la resolución temporal de la fluorescencia observada está determinada principalmente por el tamaño del punto confocal.

Escanea horizontalmente dentro del canal de salida en incrementos de 100 micrones a lo largo del chorro, observando durante aproximadamente un milisegundo por posición. Mueve la platina del microscopio entre 80 y 90 micrones a lo largo del chorro para capturar tiempos posteriores. Alternativamente, la luz puede detectarse mediante un espectrógrafo y un CCD después del espejo dicróico, utilizando una lente para enfocar la luz sobre la rendija de entrada.

Dado que la recopilación de datos es más lenta que con el contador de fotones, normalmente primero se obtiene una imagen del chorro con el contador de fotones y luego se miden puntos a lo largo del chorro con el espectrógrafo. Los datos del contador de fotones se analizan sumando de tres a cinco píxeles alrededor del chorro en cada posición para crear una gráfica de intensidad frente a distancia. El tiempo se calcula a partir de la distancia utilizando una velocidad calculada basada en las presiones aplicadas.

Como paso final, analice los datos del espectrógrafo utilizando uno de los métodos descritos en el texto. Aquí se muestra un gráfico de contorno de la intensidad en la región de mezcla medida por el contador de fotones. El fondo en el canal de salida fuera del chorro debe estar cerca del nivel de ruido del detector y normalmente no se resta.

Un fondo más elevado puede indicar un alineamiento deficiente o que la proteína se está adhiriendo a las paredes del canal. Por el contrario, un chorro que parece doblado o torcido, especialmente cerca de la región de mezcla, indica un grabado deficiente de las boquillas. Se muestra un espectro resuelto en el tiempo de la proteína ACell, proteína de unión a coenzima A o A CBP, marcada con Alexa 4 88 y Alexa 6 47.

Los rectángulos verde y rojo muestran las longitudes de onda designadas como canales donador y aceptador, respectivamente. Estos datos han sido corregidos por fondo para eliminar la carga oscura y la señal del láser. La señal de fondo se tomó con la presión del canal central ajustada a cero libras por pulgada cuadrada.

El tiempo de mezcla puede medirse mediante la observación de una reacción rápida que sea mucho más rápida que la mezcla, como la atenuación de la fluorescencia de triptófano por yoduro de potasio. Debido a que el chorro es más pequeño que la resolución óptica del microscopio, se produce una gran disminución de intensidad en la región de mezcla. A medida que se forma el chorro, esta respuesta del instrumento puede eliminarse realizando una medición de control en la que no cambien las condiciones de la solución.

La relación entre experimentos de mezcla y no mezcla de la fluorescencia de la N-acetil triptofano amida se muestra en esta figura. La línea indica la concentración predicha de yoduro de potasio a partir de modelado y simulaciones multiphysics de consola. El tiempo de mezcla, medido como el tiempo necesario para que la concentración disminuya un 80 %, es de ocho microsegundos.

Este gráfico muestra los cambios en la transferencia de energía por resonancia de Förster (fret) en la proteína A CBP tras la dilución del agente desnaturalizante desde seis hasta 0,06 moles. Estos datos no requieren un experimento control. Dado que el valor de fret ya es una razón y la respuesta del instrumento ya ha sido eliminada, el salto rápido cerca de T igual a cero representa un cambio rápido en la señal de fret dentro del tiempo de mezclado.

Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del plegamiento de proteínas exploraran los primeros pasos en la formación de la estructura proteica.