Name: Mezcladores de microfluidos para el estudio plegamiento de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprende a fabricar mezcladores microfluídicos para estudiar el plegamiento de proteínas mediante espectroscopía de fluorescencia. Esta técnica permite mezclar soluciones en ~8 microsegundos sin turbulencia.

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Este trabajo es apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias FIBR (NSF EF-0623664) y IDBR (NSF DBI-0754570). Este trabajo fue parcialmente financiado por fondos de la National Science Foundation Grant FIBR 0623664 administrado por el Centro para la Biofotónica, una Ciencia NSF y el Centro de Tecnología, gestionado por la Universidad de California en Davis, conforme al Acuerdo Cooperativo PHY 0120999. La investigación de Lisa Lapidus, Ph.D. está apoyado en parte por un premio a la Trayectoria en la interfaz de la Ciencia con cargo al Fondo Burroughs Welcome.

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<li>Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+focusing+on+a+silicon+chip%3A+Mixing+nanoliters+in+microseconds%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds.</a> Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).</li>
<li>DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Downhill+Folding+of+lambda-Repressor+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).</li>
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<li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li>
<li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

La mezcla rápida ha sido un objetivo de desarrollo para el campo de plegamiento de las proteínas durante muchos años, ya que hace tiempo se reconoce que los procesos moleculares de las biomoléculas se producen en escalas de tiempo que van desde picosegundos a los segundos. Convencionales de flujo detenido mezcladores tienen tiempos muertos de 5.1 ms, el cual está limitado principalmente por la turbulencia. Turbulentos mezcladores de flujo continuo con tiempos de mezcla de 30-300 mS se han desarrollado durante los últimos 15 años por un pequeño número de grupos, pero generalmente requieren altas velocidades de flujo para lograr estos tiempos de mezcla y por lo tanto, utilizan una gran cantidad de la muestra 6.8. Este protocolo se describe el uso de chips de microfluidos de mezcla para lograr una rápida dilución en el régimen de flujo laminar. Hay múltiples ventajas para trabajar dentro de este régimen, pero un uno primaria es la capacidad para simular el proceso de mezcla con alta precisión que permite una para modificar la respuesta de mezcla. T-mezcladores desarrollados por otros grupos con un simple geometríaetries han demostrado tiempos de mezcla de 100-200 mS que estaban limitados principalmente por el tamaño de los canales 9-10. Por escalar el tamaño de los canales a Knight micras 10 reduce el tiempo de mezcla a 10 ~ 11 mS. Yao y Bakajin mostraron que pequeños cambios en la geometría podría conducir a mejoras significativas en el tiempo de mezclado 4. Sin embargo, ese trabajo muestra que la aceleración de la mezcla también se puede llevar a más lentas fases también. El diseño utilizado en este trabajo 12 a 13 es un compromiso entre los dos mejores diseños en la referencia 4 para minimizar la descomposición más lenta exponencial de la concentración de desnaturalizante y también para hacer que la característica más reproducible en el grabado DRIE. Ha habido una cierta controversia en el campo de la mezcla ultrarrápida sobre la definición del tiempo de mezclado. Es importante reconocer la diferencia entre &quot;tiempo de mezcla&quot; y &quot;tiempo muerto&quot;. El tiempo muerto se define en un mezclador turbulento como el tiempo durante el cual un MEDIDASt no se pueden hacer y de hecho puede ser significativamente más largo que el tiempo de mezcla real. Se determina típicamente por hacer varias mediciones de una reacción de pseudo primer orden bimolecular (tales como enfriamiento de triptófano fluorescencia por N bromosuccinate) a diversas concentraciones. Los decaimientos exponenciales observados están equipados para converger en un solo valor supone que t = 0 s y el tiempo entre dicho punto y el primer punto medido es el tiempo muerto. Para mezcladores de flujo laminar, las mediciones se pueden hacer durante el proceso de mezclado así que no hay tiempo muerto, sólo un tiempo de mezclado. El tiempo de mezclado es simplemente el tiempo para combinar dos soluciones hasta uniformidad suficiente se alcanza. Hemos definido previamente el tiempo de mezcla para ser un tiempo 90/10, el tiempo para la concentración de desnaturalizante para disminuir de 90% a 10% del valor sin mezclar. Sin embargo, la forma de la curva de mezcla no es perfectamente simétrico con la cola de la caries que tiene un componente exponencial pequeño. Además, el plegamiento de proteínas tiene unaltamente no lineal dependencia de la concentración de desnaturalizante de modo que a menudo plegable puede comenzar incluso si el desnaturalizante sólo se reduce por dos veces. Por lo tanto, se han definido más recientemente el tiempo de mezcla como el tiempo para reducir la concentración desnaturalizante en un 80%. Ciertamente otras definiciones se pueden utilizar dependiendo de los requerimientos del experimento. El uso de este mezclador para estudiar el plegamiento de proteínas ha revelado consistentemente resultados sorprendentes. Plegado de citocromo C y apomyoglobin han sido estudiados para tener varios escalones plegables y los primeros resultados con los mezcladores de flujo continuo mostraron colapso que se produzca en el plazo de tiempo ~ 100 mS 10,14-15. Nuestras mediciones con este mezclador mostraba que había un mínimo de 2 pasos en esta escala de tiempo, un muy rápido, probablemente no específica, colapso (medida por fluorescencia Trp cambio espectral) dentro del tiempo de mezcla del mezclador seguido por una fase más lenta (como medido por el enfriamiento del total de emisiones Trp) que es probable que el frimero formación de la estructura nativa 5. También hemos observado un proceso de 50 mS en el dominio B1 de la proteína L, el vuelco a la interpretación convencional de que esta proteína es una carpeta de 2 estados 13. Una ventaja de este mezclador rápido es que se puede investigar el plegamiento de las proteínas más rápidas plegables que han sido por lo general sólo medible por nanosegundos salto de T-instrumentos. T-salto requiere típicamente observación de plegado / desplegado relajación cerca de la temperatura de fusión de la proteína y por lo tanto, nunca sigue el plegamiento de toda la población. Con este mezclador hemos visto en el plegamiento de las γ-represor (λ 6-86) tanto con las emisiones totales Trp y desplazamiento espectral y no han encontrado evidencia de que la proteína no tiene ningún obstáculo para doblar en condiciones de fuerte plegables que no eran accesibles a T anteriores -salta las medidas 12. Finalmente hemos medido el plegado de la pieza de cabeza villina HP-35, una de tél más rápidas carpetas todavía midió y se encontró que la tasa de plegado medido después de la mezcla es de ~ 5 veces más lento que medido por T-salto en las mismas condiciones 16. Esto sugiere que la cinética de plegado depende de las condiciones de partida, el vuelco una suposición importante en el campo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> AZ P4110 Fotoresinas </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K para desarrolladores </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PRS Baker 2000 fotosensible separador </td><td> Avantor Performance Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond Tecnologías </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 oblea cubierta de m </td><td> SENSOR Servicios de preparación </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espesor: 0,5 mm ± 0,025 mm Tolerancias estándar (a menos que) Acabado de la superficie: SI: 4-8a; SII: 8-12a Pisos: Un Primaria SEMI-STD; un escriba Limpio y pulido, las dos caras </td></tr><tr><td> 170 oblea cubierta de m </td><td> SENSOR Servicios de preparación </td><td> 7980 2G Obleas </td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Espesor: 0,17 mm ± 0,025 mm Tolerancias estándar (a menos que) Acabado de la superficie: SI: 4-8a; SII: 8-12a Pisos: Un Primaria SEMI-STD; un escriba Limpio y pulido, las dos caras </td></tr><tr><td> Grabador profunda iones reactivos para los óxidos </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Láser de ion argón </td><td> Cambridge láser Laboratorios </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> l = 258 nm </td></tr><tr><td> Láser de ion argón </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> l = 488 nm </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Objetivo </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0,5 NA </td><td> l = 258 nm </td></tr><tr><td> Microscopio Objetivo </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> l = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad Labs Ciudad </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Traducción motorizado Etapa </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-serie 12-6436 </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Photon Contador </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monocrómetro </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Andor Technology </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Hidrocloruro de guanidina (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

mezcladores de microfluidos para el estudio plegamiento de proteínas

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

El proceso por el cual una proteína se pliega en su conformación nativa es de gran importancia para la biología y la salud humana y aún poco conocidos. Una razón para esto es que plegado tiene lugar en un amplio rango de escalas de tiempo, de nanosegundos a segundos o más, dependiendo de la proteína 1. Convencionales de flujo detenido mezcladores han permitido la medición de la cinética de plegado a partir de alrededor de 1 ms. Recientemente hemos desarrollado un mezclador de microfluidos que diluye desnaturalizante ~ 100 veces en ~ 8 mS 2. A diferencia de un mezclador de flujo detenido, este mezclador opera en el régimen de flujo laminar en el que la turbulencia no se produce. La ausencia de la turbulencia permite la simulación numérica precisa de todos los flujos dentro de la mesa de mezclas con un acuerdo excelente para experimentar 3-4. El flujo laminar se logra para números de Reynolds Re ≤ 100. Para soluciones acuosas, esto requiere geometrías micras escala. Nosotros utilizamos un sustrato duro, tal como el silicio o silicio fundidoCA, para hacer micras canales 5-10 ancho y profundo 10 micras (Ver Figura 1). Las dimensiones más pequeñas, en la entrada a la zona de mezcla, son del orden de 1 micra de tamaño. El chip se sella con un vidrio delgado o cubreobjetos de sílice fundida para el acceso óptico. Las velocidades típicas del flujo total son lineales aproximadamente 1 m / s, dando Re ~ 10, pero el consumo de proteínas es sólo ~ 0,5 nl / s ó 1,8 l / h. La concentración de proteína depende del método de detección: Para triptófano fluorescencia la concentración típica es de 100 micras (1 para Trp / proteína) y para FRET la concentración típica es de ~ 100 nM. El proceso de plegado se inicia por dilución rápida de desnaturalizante de 6 M a 0,06 M de hidrocloruro de guanidina. La proteína en desnaturalizante alta fluye hacia abajo un canal central y se reunieron a ambos lados en la región de mezcla por tampón desnaturalizante sin mover ~ 100 veces más rápido (ver Figura 2). Esta geometría causa constricción rápida del flujo de proteína en un estrechochorro ~ 100 nm de ancho. La difusión de las moléculas desnaturalizantes de luz es muy rápida, mientras que la difusión de las moléculas de proteína pesados ​​es mucho más lenta, se difunden a menos de 1 micra de 1 ms. La diferencia en la constante de difusión del desnaturalizante y los resultados de proteínas en dilución rápida del desnaturalizante de la corriente de la proteína, lo que reduce la concentración efectiva del desnaturalizante alrededor de la proteína. El chorro de proteína fluye a una velocidad constante por el canal de observación y la fluorescencia de la proteína durante el plegado puede observarse usando un microscopio confocal de barrido 5.

En este trabajo se explica la fabricación y el uso de un mezclador de microfluidos capaz de mezclar dos soluciones en ~ 8 mS. También demuestran el uso de estos mezcladores con detección espectroscópica utilizando fluorescencia UV y la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET).

Mezcladores de microfluidos para el estudio plegamiento de proteínas

El proceso mediante el cual una proteína se pliega en su conformación nativa es sumamente relevante para la biología y la salud humana, aunque todavía se comprende poco. Una razón...

El objetivo general de este procedimiento es mezclar rápidamente dos soluciones para iniciar una reacción bioquímica a escala de microsegundos. Esto se logra primero fabricando un mezclador microfluídico. El segundo paso consiste en unir un chip a un cubreobjetos para sellar los canales.A continuación, el chip se monta en una placa base que contiene los depósitos de solución. El paso final consiste en obtener imágenes de la solución mezclada mediante microscopía de fluorescencia confocal. En última instancia, la reacción bioquímica se registra a escala de tiempo de microsegundos al convertir la distancia a lo largo del canal de salida en tiempo.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la mezcla por parada de flujo es que la mezcla no está limitada por la turbulencia y ocurre en unos pocos microsegundos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento de proteínas, como ¿cuándo ocurre el colapso hidrofóbico? Quien demostrará el procedimiento será Ling Woo, una investigadora postdoctoral de mi laboratorio, para comenzar la fabricación de chips de mezcla microfluídicos.Primero, limpie cuatro obleas de sílice FU de una pulgada con solución de piraña fresca según se describe en el protocolo escrito que acompaña a este video. A continuación, utilice un horno de deposición química de vapor a baja presión para aplicar un recubrimiento de polisilicio de aproximadamente un micrón de espesor por cada 10 micrones de profundidad previstos para los canales microfluídicos finales. Después de un tratamiento adicional de las obleas según se describe en el texto, aplique por centrifugado una capa de 900 nanómetros de espesor de un fotoresist Z 52 14, seguido de un prehorneado a 90 grados Celsius directamente sobre una placa calefactora durante un minuto o en un horno a 110 grados Celsius durante 30 minutos.Después de alinear una máscara fotográfica, realice un contacto duro y al vacío exponiendo primero la resistencia fotosensible a luz ultravioleta durante varios segundos. A continuación, revele el patrón en la resistencia fotosensible según se indica en el protocolo escrito. Inspeccione las características en la oblea con un microscopio y realice un horneado duro a 115 grados Celsius directamente sobre una placa calefactora durante dos minutos.A continuación, desgasifique las obleas con Asher o plasma de oxígeno durante 2,5 minutos a una potencia de RF de 100 vatios. Utilice un grabador iónico reactivo profundo para grabar la capa de polisílice completamente hasta la sílice fundida debajo. Retire la fotoresina restante y trate la oblea según lo indicado en el texto.Mida la profundidad del grabado para asegurarse de que atraviese completamente el recubrimiento de poli. Utilizando un grabador iónico reactivo profundo con capacidad de óxido, grabe la sílice fundida hasta una profundidad de aproximadamente 10 micrones por cada micrón de espesor del recubrimiento de poli. Limpie la oblea con el ashing de matriz durante cuatro minutos, con una potencia de RF de 100 vatios, y elimine el polisilicio con un grabador de fluoruro de xenón antes de perforar agujeros en la oblea. Aplique por centrifugación una nueva capa de un micrón de resistencia fotolitográfica para proteger los canales durante los manipulados posteriores.Luego monte la oblea con el lado de las características hacia abajo sobre una placa de vidrio sacrificial utilizando Aqua Bond 55. Tenga cuidado de mantener el bonder libre de burbujas con un taladro de punta de diamante controlado por computadora más frío y una solución limpiadora micro 90. Esto evita que pequeños fragmentos de vidrio se adhieran a los canales, lo que podría obstruir el chip durante su uso.Proceda a perforar orificios de entrada y salida en cada chip. Enjuague la oblea con agua desionizada utilizando una jeringa para inyectar agua en cada orificio. Luego, sumérjala en agua jabonosa durante una hora tras retirar la foto.Resistente y adhesivo como se describe en el texto. Enjuague la oblea con agua desionizada y agua jabonosa tibia. Enjuague cada orificio nuevamente con una jeringa, evitando las estructuras grabadas después de hacer pasar nitrógeno sobre la oblea.Continúe secando en una estufa al vacío ajustada a 120 grados Celsius. Inspeccione los orificios para asegurarse de que estén libres de partículas y repita los pasos de limpieza según sea necesario. Los siguientes pasos deben realizarse en la sala limpia.Mida la profundidad de los canales con un perfilador de superficie óptico o mecánico. Limpie la oblea y un cubreobjetos de sílice fundida como se describe en el texto en un cuarto limpio. Seque completamente la oblea con gas nitrógeno durante al menos cinco minutos.Luego, coloque el oblea con la cara de las características hacia arriba sobre una pila de tres a cuatro toallitas de sala limpia colocadas sobre una superficie dura y plana, como un pequeño panel de vidrio. Repita el procedimiento con el cubreobjetos. Tome el cubreobjetos por el borde e inviértalo de manera que la cara pulida quede mirando hacia abajo sobre el oblea.Alinee cuidadosamente los bordes planos, deje caer el cubreobjetos sobre la oblea y permita que se asiente; mueva ligeramente en horizontal únicamente para ajustar el alineamiento. Presione hacia abajo con un dedo en el centro de la oblea. Se debería observar un frente de unión que comienza a propagarse hacia afuera.Si es necesario, aplique presión adicional en otras posiciones alrededor de la oblea para avanzar el frente de unión. Después de colocar las obleas selladas en un horno de alta temperatura programado con el perfil de temperatura indicado en el texto, corte la oblea con una sierra cortadora de obleas en chips individuales. La placa base para sostener el chip mezclador y las soluciones puede estar hecha de plástico como lexan o plexiglás, o de aluminio.Para el control de temperatura, fije el chip al colector mediante pequeñas juntas tóricas y sujételo en su lugar con un anillo de retención que permita una vista óptica clara del centro del chip. Las ranuras para las juntas tóricas deben ser más superficiales que las estándar para garantizar un buen acoplamiento sin aplicar demasiada presión sobre el chip. Una vez montado el chip, añada soluciones a los depósitos central y laterales, teniendo cuidado de liberar cualquier burbuja atrapada en el fondo de los pozos.Coloque el colector en un microscopio invertido y examine la región de mezcla mediante la salida del ocular o de la cámara. Una linterna incandescente colocada encima del colector proporcionará suficiente luz. Utilice un colorante o una solución con alto índice de refracción en el canal central para visualizar el chorro.Dado que los volúmenes utilizados en este mezclador son tan pequeños, el flujo puede controlarse mediante presión de aire aplicada por encima de los pozos de la solución. Para visualizar el chorro, comience con la presión del canal lateral en cero libras por pulgada cuadrada y aumente lentamente hasta igualar la presión del canal central. Si un canal lateral está obstruido, el chorro será empujado contra una de las paredes del canal de salida.Si aparece un tapón visible, puede eliminarse aplicando presión o vacío al canal de salida con una jeringa. Si la proteína u otro material orgánico obstruye el chip, puede limpiarse mediante remojo y solución piraña durante la noche. Introduzca un haz láser recubierto en un microscopio de investigación utilizando un espejo dicróico dentro o justo fuera del microscopio.Alinee el láser de forma que el enfoque pueda verse en el ocular o en la cámara aproximadamente cerca de la región de mezcla. La fluorescencia de la proteína en el mezclador es recogida por el objetivo y enviada a través del espejo dicróico, enfocada por una lente hacia un diafragma y proyectada sobre un contador de fotones. Escanee el chip utilizando un escáner piezoeléctrico en las direcciones x e y para obtener una imagen de la región de mezcla.Seleccione una posición en el chorro y realice un barrido en X e Y para encontrar el enfoque en el centro del canal verticalmente. La profundidad de campo del microscopio es mucho menor que la profundidad del canal, y la velocidad de flujo es uniforme en el canal excepto dentro de un micrómetro de las paredes. Por lo tanto, la resolución temporal de la fluorescencia observada está determinada principalmente por el tamaño del punto confocal.Escanea horizontalmente dentro del canal de salida en incrementos de 100 micrones a lo largo del chorro, observando durante aproximadamente un milisegundo por posición. Mueve la platina del microscopio entre 80 y 90 micrones a lo largo del chorro para capturar tiempos posteriores. Alternativamente, la luz puede detectarse mediante un espectrógrafo y un CCD después del espejo dicróico, utilizando una lente para enfocar la luz sobre la rendija de entrada.Dado que la recopilación de datos es más lenta que con el contador de fotones, normalmente se obtiene primero una imagen del chorro con el contador de fotones y luego se miden puntos a lo largo del chorro con el espectrógrafo. Los datos del contador de fotones se analizan sumando de tres a cinco píxeles alrededor del chorro en cada posición para crear una gráfica de intensidad frente a distancia. El tiempo se calcula a partir de la distancia utilizando una velocidad calculada basada en las presiones aplicadas.Como paso final, analice los datos del espectrógrafo utilizando uno de los métodos descritos en el texto. Aquí se muestra un gráfico de contorno de la intensidad en la región de mezcla medida por el contador de fotones. El fondo en el canal de salida fuera del chorro debe estar cerca del nivel de ruido del detector y normalmente no se resta.Un fondo más elevado puede indicar un alineamiento deficiente o que la proteína se está adhiriendo a las paredes del canal. Por el contrario, un chorro que parece doblado o torcido, especialmente cerca de la región de mezcla, indica un grabado deficiente de las boquillas. Se muestra un espectro resuelto en el tiempo de la proteína ACell, proteína de unión al coenzima A o A CBP, marcada con Alexa 4 88 y Alexa 6 47.Los rectángulos verde y rojo muestran las longitudes de onda designadas como canales donador y aceptador, respectivamente. Estos datos han sido corregidos por fondo para eliminar la carga oscura y la señal del láser. La señal de fondo se tomó con la presión del canal central ajustada a cero libras por pulgada cuadrada.El tiempo de mezcla puede medirse mediante la determinación de una reacción rápida que sea mucho más rápida que la mezcla, como la atenuación de la fluorescencia de triptófano por yoduro de potasio. Dado que el chorro es más pequeño que la resolución óptica del microscopio, se produce una gran disminución de intensidad en la región de mezcla. A medida que se forma el chorro, esta respuesta del instrumento puede eliminarse realizando una medición de control en la que no cambien las condiciones de la solución.La relación entre experimentos de mezcla y no mezcla de la fluorescencia de la N-acetil triptofano amida se muestra en esta figura. La línea indica la concentración predicha de yoduro de potasio a partir de modelado y simulaciones multiphysics de consola. El tiempo de mezcla, medido como el tiempo necesario para que la concentración disminuya un 80 %, es de ocho microsegundos.Este gráfico muestra los cambios en la transferencia de energía por resonancia de Förster (fret) en la proteína A CBP tras la dilución del agente desnaturalizante de seis a 0,06 molar. Estos datos no requieren un experimento control. Dado que el valor de fret ya es una razón y la respuesta del instrumento ya ha sido eliminada, el salto rápido cerca de T igual a cero representa un cambio rápido en la señal de fret dentro del tiempo de mezclado.Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del plegamiento de proteínas exploraran los primeros pasos en la formación de la estructura proteica.

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Bioengineering

Bioingeniería

Aquí, describimos un procedimiento que emplea la técnica de Schlieren a microescala para medir la falta de homogeneidad de la mezcla en un dispositivo microfluídico. A través de la calibración, la distribución del gradiente de concentración se puede derivar de la imagen de micro-schlieren.

Analizando Mezcla falta de homogeneidad en un dispositivo de microfluidos por Microscale Schlieren Técnica

Este protocolo describe en detalle cómo fabricar y operar dispositivos de microfluidos para la recogida de datos de difracción de rayos x a temperatura ambiente. Además, describe cómo supervisar la cristalización de proteínas por la dispersión ligera dinámica y obtenidos de cómo procesar y analizar datos de difracción.

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

Demostramos la fabricación y el uso de un dispositivo de microfluidos que permite múltiples partículas seguimiento medidas de microrheology para estudiar los efectos reológicos de transiciones de fase repetidos sobre materia blanda.

La combinación de la microfluídica y Microrheology para determinar las propiedades reológicas de materia blanda durante las transiciones de fase repetido

Este trabajo detalla el protocolo de fabricación de chips microfluídicos desarrollado para la cristalización de proteínas en chip con el método de diálisis y experimentos de difracción de rayos X in situ. El proceso de microfabricación permite integrar una membrana de diálisis de celulosa regenerada semipermeable con cualquier corte de peso molecular, entre dos capas del chip.

Cristalización de proteínas en chip por microdiálisis para estudios de difracción de rayos X in situ

El protocolo presentado aquí describe el uso de Spotiton, un novedoso sistema robótico, para entregar dos muestras de interés en una rejilla de nanocables auto-absorbentes que se mezclan durante un mínimo de 90 ms antes de la vitrificación en criógeno líquido.

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este protocolo combina la fotometría de masas con un novedoso sistema de microfluídica para investigar las interacciones proteína-proteína de baja afinidad. Este enfoque se basa en la dilución rápida de complejos altamente concentrados en solución, lo que permite mediciones de baja afinidad y amplía la aplicabilidad de la fotometría masiva.

Análisis de la formación de complejos proteicos a concentraciones micromolares mediante el acoplamiento de microfluídica con fotometría de masas

Aquí se presenta la fabricación de un dispositivo bicapa basado en polidimetilsiloxano (PDMS) para la producción de bibliotecas combinatorias en emulsiones de agua en aceite (tapones). El hardware y el software necesarios para automatizar la producción de enchufes se detallan en el protocolo, y también se demuestra la producción de una biblioteca cuantitativa de enchufes fluorescentes.

Dispositivo microfluídico bicapa para la producción de tapones combinatorios

Este protocolo detalla el diseño y la fabricación de un dispositivo microfluídico adecuado para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos. La síntesis de técnicas de microfabricación, control de flujo automatizado y modelado computacional permite un sistema flexible ideal para sondear el citoesqueleto celular in vitro.

Desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos

En este artículo se presenta un método basado en microfluídica para el confinamiento de partículas basado en el flujo hidrodinámico. Demostramos atrapando partículas estables en un punto de estancamiento de líquido mediante un mecanismo de control de retroalimentación, lo que permite el confinamiento y la micromanipulación de partículas arbitrarias en un microdispositivo integrado.

Una de microfluidos basada en hidrodinámica trampa para las partículas individuales

Aprende a fabricar mezcladores microfluídicos para estudiar el plegamiento de proteínas mediante espectroscopía de fluorescencia. Esta técnica permite mezclar soluciones en ~8 microsegundos sin turbulencia.

Mezcladores de microfluidos para el estudio plegamiento de proteínas

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