Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

La espectroscopia Raman es una técnica adecuada para el contacto no, libre de marca análisis de las células vivas, las construcciones de ingeniería de tejidos y tejidos nativos. Fuente específicos de huellas espectrales pueden ser generados y analizados utilizando el análisis multivariado.

El objetivo general de este procedimiento es monitorear las células y el tejido a través de un método sin contacto y sin marcadores. Esto se logra a través de la espectroscopia ramen, una tecnología basada en láser que detecta la dispersión inelástica de la luz monocromática, produciendo un patrón espectral típico para cada muestra biológica en función de su composición bioquímica inherente utilizando un microscopio de fluorescencia estándar acoplado a un espectrómetro ramen. La comparación directa de imágenes de campo claro y fluorescencia con espectros de ramen se utiliza para monitorear numerosas muestras biológicas.

A cada vibración química se le asigna una banda Raman específica, y la intensidad máxima se correlaciona con la cantidad de enlaces moleculares presentes. Se detectan similitudes y diferencias de los conjuntos de datos espectrales. Mediante el empleo de un análisis multivariante, los espectros resultantes se pueden utilizar para comprobar la integridad de los tejidos después de la recolección de una biopsia o para demostrar la esterilidad de las células aisladas.

Además, esta técnica permite la caracterización e identificación de diferentes tipos celulares in vitro. En última instancia, la espectroscopia de ramen es una técnica prometedora basada en láser para la ingeniería de tejidos y aplicaciones clínicas A través de análisis sin etiquetas sin contacto, Daniel Cabal Barrio, técnico, y Miriam Tala, estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de rutina existentes, como la histología y la inmunofluorescencia, es que no se requiere procesamiento de muestras.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el estado de una sola célula y los componentes de la matriz, también se puede aplicar a tejidos y órganos multicelulares. Para preparar espectros de ramen personalizados, se acopla un microscopio de fluorescencia estándar a un espectrómetro de ramen que permite la comparación directa de imágenes de fluorescencia con espectros de ramen. La configuración básica consta de un láser de diodo de 784 nanómetros, un filtro de muesca para la separación del ramen, luz dispersa de la luz de excitación, un microscopio y un espectrógrafo con un dispositivo de carga acoplada optimizado para la detección de información espectral.

Para controlar la función del láser, inicie el software o el consuelo y ajuste la temperatura de la cámara CCD a menos 60 grados centígrados para minimizar el ruido causado por las corrientes inducidas térmicamente en la cámara. Coloque una oblea de silicio en la platina del microscopio para el procedimiento de calibración. Encienda el láser y ajuste la potencia a 85 milivatios.

Utilice la celda de software B para enfocar el láser en la oblea hasta que aparezca XY. Mida la oblea de silicio con un único tiempo de integración de un segundo. Usando un objetivo aéreo de 60 X, cambie la unidad del eje X de número de píxeles a ramen.

El cambio en el software y/o Soli varía el enfoque láser del pico de silicio en el número de onda 520 en el espectro recogido. Con el fin de encontrar la intensidad máxima posible para esta banda de ramen, la cantidad mínima de recuentos debe ser superior a 11, 000 para tener una calibración exitosa antes de la medición espectral, prepare las muestras biológicas como se indica en el protocolo escrito. Acompañando a este vídeo, todas las mediciones se realizan a temperatura ambiente.

Utilizando un objetivo de inmersión en agua de 60 x con una apertura numérica de 1,2, los espectros deben recogerse utilizando 10 integraciones por 10 segundos para un total de 100 segundos por medición. Para realizar la medición de una célula adherente, coloque un plato con fondo de vidrio que sostenga las células en la platina del microscopio. Para obtener una mejor señal y garantizar la reproducibilidad, enfoque el láser en el núcleo de la célula, apague la luz del microscopio y comience a recolectar el espectro.

Mida un espectro de referencia del fondo cada 10 espectros moviendo el foco láser al lado de la celda. Es importante tener en cuenta que al cambiar el enfoque, se debe recopilar un nuevo fondo para cada profundidad de enfoque. Alternativamente, para medir las células y la suspensión, transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a un plato con fondo de vidrio.

Después de colocarlo en la platina del microscopio, enfoque el láser en el centro de la célula, apague la luz del microscopio y comience a recolectar el espectro nuevamente. Mida un espectro de referencia del fondo cada 10 espectros moviendo el foco láser al lado de la celda. Para medir los espectros de los tejidos nativos, coloque la muestra en un plato con fondo de vidrio.

La región de interés debe estar orientada hacia el fondo del plato. Llene el plato con suficiente PBS para cubrir la muestra. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra para evitar cualquier movimiento de la misma.

Durante las mediciones, ajuste el enfoque láser en la estructura de interés y comience a recopilar los espectros. Recopile un espectro de referencia del fondo cada 10 espectros moviendo el foco láser fuera de toda el área de tejido, siempre recopilando un nuevo fondo para cada profundidad de enfoque para la medición espectral de secciones criogénicas marcadas con inmunofluorescencia. Sección muestras de tejido fresco congelado.

Con un criométodo estándar, móntelos en cubreobjetos recubiertos de sílice. Tiñir las secciones criogénicas siguiendo un protocolo rutinario de inmunofluorescencia, empleando solo un breve paso de fijación y utilizando los anticuerpos adecuados para la detección de la proteína de interés. Mediciones de ramen enfocándose en el área donde se produce la fluorescencia.

Para demostrar los experimentos de degradación de la elastina, los ventriculares de las valvas de la válvula aórtica porcina disecadas se colocan mirando hacia el fondo del vaso. Plato inferior. Mida el tejido nativo como un control no incubado en 30 puntos aleatorios en toda la superficie del tejido.

Al centrarse en las estructuras fibrilares, se dividió la muestra en dos secciones y se colocaron en tubos separados de 2,5 mililitros llenos de dos mililitros de una solución de elastasa. Incuba el tejido durante 15 o 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire los tejidos del tubo de einor y lave cuidadosamente con PBS para detener completamente la reacción enzimática.

Mida cada muestra en 30 puntos aleatorios, centrándose en las estructuras fibrilares. El procesamiento de espectros Raman comienza con el tratamiento previo de los espectros generados mediante el software Opus. En primer lugar, reste el espectro de fondo correspondiente de los espectros recopilados para reducir las señales de interferencia del vidrio y el medio, así como para evitar las variaciones causadas por los cambios en el enfoque.

Durante las mediciones, reduzca los espectros a la región del número de onda entre 401, 800, que ofrece la mayor cantidad de información si es necesario. Normalice los espectros a la normalización máxima del pico, tenga en cuenta las fluctuaciones de intensidad en las fallas sistemáticas, simplificando la detección de cambios estructurales en los espectros de la muestra. Realice una corrección de línea de base para aumentar la comparabilidad entre diferentes experimentos.

Analice los espectros Raman mediante el análisis de componentes principales o PCA con el software posicionador. Este análisis multivariante detecta diferencias y similitudes dentro de los conjuntos de datos espectrales. Cada espectro se traza como un solo punto en un espacio multidimensional en función de los recuentos recopilados para cada cambio de ramen.

Cada componente principal, abreviado PC, describe una cierta cantidad de la información total contenida en los datos originales. El primer PC es el que contiene la mayor fuente de variación. Cada uno de los siguientes PC contiene en orden menos información que el anterior.

Cada variable tiene una puntuación y una carga en cada PC.By trazar PC, se pueden exponer importantes correlaciones de muestra. Las cargas describen la contribución de cada variable analizada al ACP. Etiquete, cada grupo de mediciones mediante la creación de rangos de filas para cada grupo de muestras, utilice la siguiente configuración básica para la validación cruzada de PCA, el algoritmo Nip Al, sin rotación e inicie el análisis.

Estos ajustes dependen de los espectros. Por último, los espectros de ramen crudo PCA generados a partir de células adherentes a menudo revelan una baja relación señal/ruido y una baja intensidad general de la señal. El enfoque del láser debe establecerse cerca del fondo de vidrio, lo que enmascara la señal de muestra real.

En consecuencia, la señal de muestra puede minimizarse o incluso eliminarse durante una sustracción de fondo posterior. Por el contrario, las células y la suspensión permiten la detección de información espectral más detallada. Sin embargo, los espectros de las células adherentes y en suspensión exhiben los mismos picos principales diferenciándose solo en sus intensidades, entidades para la caracterización de diferentes tipos de células dentro de una suspensión, no se requiere tratamiento previo.

Aquí se muestran los espectros Raman medios y las desviaciones estándar de los fibroblastos humanos, las células madre mesenquimales, los condrocitos y los queratinocitos medidos en suspensión. Todos los espectros de ramen tienen una estructura similar, con picos que se originan a partir de biomoléculas típicas como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Para estos tipos de células, la región espectral entre los números de onda 601 y 800 contiene la información espectral más relevante mediante la cual se pueden detectar claras diferencias entre los diferentes tipos de células.

Ejemplar: una región espectral muestra claras diferencias estructurales, que son asignables a las vibraciones moleculares del colágeno y los lípidos. Por el contrario, los análisis morfológicos no son adecuados para la identificación y distinción de la mayoría de las células. Si bien la diferencia entre los condrocitos y las células de la piel es observable, los fibroblastos y las células madre mesenquimales son difíciles de separar.

Utilizando únicamente microscopía de campo claro para la asignación de tejido nativo a un espectro específico de huellas dactilares, se generaron espectros Raman a partir de proteínas puras disponibles comercialmente y secciones criogénicas teñidas inmunohistológicamente. Aquí, se identificaron espectros de huellas dactilares de fibras elásticas dentro de tejidos nativos comparándolos con secciones criogénicas liofilizadas, de elastina e inmunofluorescentes marcadas con un anticuerpo contra la elastina. Sin embargo, dado que la elastina presenta una alta autofluorescencia, que se refleja en los espectros Raman, el análisis de datos es un desafío para reducir la falla sistemática debido a las propiedades específicas de la muestra, como la autofluorescencia, y el procesamiento adecuado de los conjuntos de datos es crucial.

En el análisis de datos. La normalización se utilizó para eliminar la intensidad de señal significativamente mayor de la proteína elastina pura, lo que dio como resultado espectros Raman comparables. La elastina es una de las proteínas de la matriz extracelular más estables del cuerpo y, por lo tanto, es muy difícil de degradar. Aquí.

Se indujo la degradación de elastina en valvas valvular aórticas porcinas sanas mediante la realización de una digestión enzimática aplicando el análisis multivariado, se identificaron diferencias significativas de PCA entre los espectros Raman de las muestras tratadas enzimáticamente y los controles nativos. Estas diferencias espectrales se observaron en el espectro de carga en los números de onda 861, 1003 y 1, 664, los cambios estructurales esperados en las fibras que contienen elastina debido a los tiempos de exposición prolongados a la elastasa se reflejaron en puntuaciones separables más distintas. Los grupos que se muestran aquí son puntuaciones de la comparación entre fibras elásticas de control no tratadas y degradadas enzimáticamente dentro del tejido nativo. Estos cambios estructurales esperados también son evidentes en las valvas de la válvula aórtica porcina teñidas del corazón, como se visualiza en este recuadro al comparar el control no tratado con las muestras de tejido que se expusieron a la enzima elastasa integradora de elastina durante 30 minutos.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores en los campos de la biología celular y de la matriz, así como en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos, realicen no solo análisis del fenotipo celular en tiempo real, sino también para identificar interacciones cruciales entre la célula y la matriz celular en Z dos dentro de un entorno nativo.