Name: Una más rápida, de alta resolución, APMt-GFP-ensayo basado en la fusión mitocondrial Adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a medir la fusión mitocondrial en múltiples células simultáneamente usando GFP fotoactivable y microscopía confocal. Este método automatizado proporciona datos de alta resolución para estudiar dinámicas mitocondriales en diabetes.

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Damos las gracias al Centro Tufts para Investigación de Neurociencia, P30 NS047243 (Jackson), la afinidad de las mitocondrias de Investigación Cooperativa (mtARC) apoyado por el Centro para la Investigación Biomédica Evans Interdisciplinario de la Universidad de Boston Medical Campus, Link Corporation Medicina, y Zeiss para apoyar este trabajo.

1. Imagen de preparación de la placa <ol><li> Cultura INS1 células en RPMI medios que contienen 10% de suero fetal bovino estándar, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 mM 2-mercaptoetanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM de HEPES, 2 mM de ácido pirúvico, y 11 mM de glucosa a 80% de confluencia. </li><li> Trypsinize los cultivos celulares INS1 con 0,05% de tripsina y la placa de ellos en poli-D-lisina placas recubiertas de imagen de fondo (cubreobjetos% de confluencia 30-40). </li><li> Permita que las placas para llegar a 60-80% de confluencia (~ 2 días) y añadir matriz mitocondrial específica (COXVIII) adenoviral PA-GFP durante 24 horas (MOI = 5). Cambio de los medios de comunicación y permiten a las células a crecer durante otros 2 días antes de la imagen. </li><li> En el día de formación de imágenes, añadir 7-15 TMRE nM a las placas de imagen, y equilibrar durante al menos 45 minutos. </li><li> Durante este tiempo su vez en la incubadora (fase superior incubadora se ha utilizado aquí) y permitir que el microscopio se equilibre a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora. Encienda el 5% de CO 2. </li&gt; </ol> 2. Los parámetros de imagen para el Zeiss LSM 710 Microscopio Confocal <ol><li> Después de que el microscopio tiene equilibrada, en la pestaña de adquisición, haga clic en &quot;Mostrar herramientas manuales&quot;, abra la imagen creada del panel, y seleccione &quot;modo de canal&quot; y cambiar el seguimiento de cada &quot;cuadro&quot;. </li><li> En el panel de trayectoria de la luz, elija LSM y el modo de canal. Trabajo desde el icono de la muestra hacia arriba, seleccione &quot;Trasero&quot;, MBS 690 +, y MBS 488. En la parte inferior del panel, elige &quot;T-PMT&quot; para permitir la visualización del campo brillante o canal DIC. </li><li> Terminar de ajustar los parámetros de ruta de acceso de luz mediante el establecimiento de la gama para el tinte de las buenas prácticas agrarias de 490-540 nm y 580-700 nm para el tinte TMRE. </li><li> En el modo de adquisición, el uso de 512 × 512 píxeles de exploración de campo, 4x promedio, y elegir un factor de zoom (que usted puede desear para mantener constante para fines de calibración). </li></ol> 3. Optimización de los parámetros de imagen <ol><li> Uso de la apocromático plan de 100x (1,4 NA) lente del objetivo, focnosotros en las células con la luz halógena no, la luz fluorescente, para proteger a la mitocondria de fototoxicidad. </li><li> Pantalla para PA-GFP células que expresan con un agujero lo más abierto y escaneo para encontrar las células que son más brillantes de color verde. </li><li> Buscar la menor potencia del láser de 2 fotones necesarios para activar el PA-GFP y optimizar los parámetros de imagen para garantizar que la señal no saturar el detector. Compruebe que la señal PA-GFP colocalizes con la señal de TMRE para unos pocos z-series. La pérdida de la señal TMRE indica despolarización mitocondrial o fototoxicidad, y las células exhibiendo estas características no debe ser utilizado para el análisis. </li><li> Buscar una celda PA-GFP expresar y especificar un factor de zoom. </li><li> Ajuste el rango de la serie Z para recoger 6 rebanadas (de este rango se necesitan para satisfacer todas las 10 celdas a menos que específica-z de enfoque se fija en cada posición). </li><li> Guarde el método de imagen para cada celda (la celda 1, celda 2, etc.) </li></ol> 4. Ajuste el AutomatizarParte D del programa y designar a las 10 celdas que usted seguirá para el ensayo de fusión mitocondrial 1 Hora <ol><li> En el panel izquierdo de la ventana MultiTime, seleccione la opción &quot;ahorro&quot; del panel, y especifique la ubicación donde los archivos se guardarán. </li><li> En la &quot;Adquisición&quot; del panel, cargar el método de adquisición salvo para la celda 1 en la configuración de escaneo y marca la casilla de pila z. Además, puede seleccionar &quot;marca Z-media de la pila de z&quot;. </li><li> En el &quot;bloques&quot; del panel, seleccione &quot;solo bloque en cada lugar&quot;. Haga clic en &quot;bloques&quot; add para cada intervalo que debe medirse. </li><li> En el &quot;timing&quot; del panel, seleccione &quot;Intervalo de espera&quot; y tipo &quot;0&quot; en el &quot;intervalo de espera antes de bloque en la ubicación de sólo la primera&quot;. Bloques 2-4 tendrá &quot;15 minutos&quot; en esta sección. </li><li> En el panel de ubicación, seleccione &quot;mover el foco al cargar la posición entre los lugares&quot; y &quot;analizar la carga de configuración cuando se &#39;mueven a la loc&#39; o hacer clic en &#39;siguiente loc&#39;. En virtud de la&quot; lista de lugares de edición &quot;, seleccione&quot; borrar todo &quot;y luego seleccione&quot; múltiples lugares motorizada etapa &quot;. </li><li> Under el &quot;blanqueo&quot; del panel, haga clic en el &quot;blanqueo&quot; y, a designar el archivo de configuración en la &quot;configuración&quot; del menú desplegable, según lo señalado en la ventana del programa principal. Luego, en el &quot;blanqueamiento&quot; de la ventana, sino el método de fotoactivación apropiado. En el panel de las regiones, elija el retorno de la inversión para esta célula en particular, y añadir este retorno de la inversión a la MultiTime por la elección &quot;región actual añadir a la lista retorno de la inversión&quot; de la ventana. Asegúrese de seleccionar el mismo lugar en el &quot;retorno de la inversión&quot; en el menú desplegable. </li></ol> Por el momento para que funcione correctamente y para que cada célula tiene un intervalo de 15 minutos, dos métodos necesitan ser salvados. En la lista de bloques, el primero tendrá la &quot;real&quot; de configuración de fotoactivación, y el resto tendrá un &quot;simulacro&quot; de configuración que no utiliza el láser de dos fotones. El primer bloque también será el único bloque que no tiene un retardo (BKIntv = 0). Por lo tanto, el método comienza con una exploración inicial, seguido por una exploración de fotoactivación. El resto de los bloques tienen un 900 seg BkIntv, yen cada momento hay dos exploraciones como en el tiempo 0 segundos, para mantener la consistencia de tiempo. <ol start="7"><li> Para cada una de las 10 celdas que deben seguirse a través del tiempo, lleve a cabo la siguiente secuencia: Encuentre un PAGFP célula que expresa-salvar su método de imagen Ubicación panel marcar la posición del portaobjetos, especificar el método de imagen Retorno de la inversión principal panel elija una región de interés para Bleach fotoactivado del panel de ahorro de retorno de la inversión específica y también carga en la caja de retorno de la inversión: Borrar el retorno de la inversión y restablecer el zoom de exploración a 1 Encuentra la celda de al lado y establecer el zoom Repita el proceso para los próximos 9 celdas </li></ol> Compruebe que cada lugar el escenario y todos los bloques tienen el método de imagen apropiado (la configuración de análisis) asociados. También asegúrese de que el primer bloque en cada ubicación se corresponde con el método de fotoactivación adecuada, mientras que el resto contiene un &quot;simulacro&quot; método. Finalmente, seleccione &quot;Ejecutar&quot;. 5. Analizar la intensidad de señal PA-GFP <ol><lI&gt; para las células en las que la señal de las buenas prácticas agrarias-fotoactivable colocalizes con la señal de TMRE rojo, restar el fondo en las imágenes PAGFP (aquí usamos MetaMorph). </li><li> A continuación, exportar los datos a Excel y calcular la intensidad media de z-pilas en cada momento. Eliminar secciones ópticas que no tienen señal. </li><li> Medir la dilución de la señal en cada z pila mediante el cálculo del porcentaje de la señal fotoactivada original. </li></ol> Cada punto de datos se escanea y se registró el doble, lo que resulta en duplicado z pila información para cada punto de tiempo. Compruebe que los valores de Z-Stack están de acuerdo. Si no, lo que es indicativo de un problema (atención por ejemplo, el movimiento celular). 6. Los resultados representativos Cuando una actividad de fusión se produce entre un activado y no activado-PA-GFP mitocondria, la PAGFP dentro de la matriz mitocondrial se mezcla con la matriz no marcada y se diluye en un área mayor, disminuyendo la señalintensidad (Figura 1A). En la celda INS1, una disminución significativa en la intensidad de la señal se produce cada 15 minutos, hasta que el equilibrio de fusión mitocondrial ha sido alcanzado (aproximadamente 1 hora). Tenga en cuenta que la celda en la Figura 1B muestra colocalización casi completa de la PA-GFP y señales TMRE. En estos ensayos una concentración muy baja de TMRE (15 nM) se utiliza para ayudar a orientar la fotoactivación de PAGFP, y también para controlar la salud celular. Las células con una gran cantidad de mitocondrias despolariza tendrá colocalización incompleta de PAGFP y TMRE y no debe ser analizada, porque esto indica fototoxicidad o células en un estado moribundo. El tiempo de equilibrio para la fusión mitocondrial es usualmente de 1 hora en INS1 células, cuando ~ 15% del volumen mitocondrial se activa. A veces, incluso si un área pequeña es iluminada, la mayoría de las mitocondrias se fotoactivados debido a ser altamente red, en cuyo caso la fusión adicional es difícil de detectar. Otros tipos de células pueden mostrar diferentes momentos de equilibrio y deben ser examinados a intervalos más cortos y más de un período más largo para caracterizar la dinámica de la mitocondria. Para inhibir la fusión mitocondrial, las células se pueden colocar dentro de un entorno lipotóxico. Previamente se ha demostrado que 0,4 mM palmitato fragmentos mitocondrias, e inhibe la fusión mitocondrial 9. Este efecto puede verse en la Figura 2, donde las mitocondrias están fragmentados, pero la intensidad de la señal de la mtPAGFP no cambia tanto como en condiciones normales (Figura 1). Por lo tanto, la dilución de la señal de PA-GFP es probable que sea debido a la fusión mitocondrial en lugar de fisión. En otros tipos de células, le sugerimos que utilice otras formas conocidas para inducir la fragmentación mitocondrial, como silenciar OPA1 que es necesario para la fusión mitocondrial 14. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig1.jpg" /> Figura 1. </strong&gt; dilución Típica de la señal de PA-GFP después de la fotoactivación durante un ensayo de fusión mitocondrial. A. PA-GFP se vuelve progresivamente más tenue debido a eventos de fusión mitocondriales que conducen a la dilución de la proteína sobre un área creciente como puede verse en estas imágenes proyectadas de 6 secciones ópticas cuantificó cada 15 minutos. B. TMRE con PA-GFP muestra que las mitocondrias son activos y no despolariza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3991/3991fig2.jpg" /> Figura 2. La fusión mitocondrial inhibido con palmitato 0,4 mM disminuye la dilución del PA-GFP. A. Proyecciones de 6 secciones ópticas que muestran las mitocondrias corto con una intensidad de la señal cambia con el tiempo. Colocalización B. PA-GFP con TMRE muestra que las mitocondrias no son depolarizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

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</ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Zeiss, Inc.

Este método permite la formación de imágenes de alrededor de 10 células a la vez, si la adquisición se produce cada 15 minutos después de la fotoactivación. El número exacto de células dependerá de lo rápido que uno es capaz de localizar y marcar las células que expresan mtPAGFP dentro de la placa de cultivo, y la rapidez con que se puede configurar todos los parámetros del software. Para realizar la automatización sin problemas una capa uniforme de las células deben ser utilizados porque los designados z-stack márgenes se aplicará para todas las células. El tamaño de esta zona fotoactivación inicial regirá el tiempo de equilibrado. Para ser capaz de medir la fusión mitocondrial, es importante para fotoactivar sólo 10-20% de la red, de tal manera que la propagación de la señal al resto de la red se puede controlar con el tiempo. Si es demasiado buena parte de la red se fotoactivados, es posible que la fusión completa se producen con demasiada rapidez, y el evento no será capturado. El cuidado extremo se debe tomar paraajustar la potencia del láser del láser de dos fotones, así como la concentración TMRE para evitar fototoxicidad que conduce a la despolarización mitocondrial. Asegurarse de que la señal de mtPAGFP colocalizes con la señal de TMRE puede ayudar en la evaluación de fototoxicidad y la salud general de las células 8,15. La iluminación con luz epifluoerescent debe ser evitado. Si bien la búsqueda de células que expresan mtPAGFP, el agujero debe ser lo más abierto durante la exploración con una excitación de 488 nm de bajo poder. Ajuste de la potencia del láser de dos fotones para fotoactivar suficiente PA-GFP para medir la señal durante 1 hora, pero no a sobresaturar cualquiera de las celdas puede ser complicado 8. Sin embargo, el tiempo debe ser gastado en esta etapa debido a la optimización de programa automático se inicia, es tedioso para detenerlo, para elegir más células, y curriculum vitae. Para el control de la calidad, la adquisición de un contraste de interferencia diferencial (DIC) de la imagen (o de luz transmitida) para controlar el foco en las células puede ser muyútil y también una buena manera de detectar las burbujas formadas en el aceite de inmersión durante la exploración, lo que ocurre a veces de los movimientos de la etapa. Aunque el uso de este método mtPAGFP recoge datos sobre el movimiento unidireccional de proteínas de la matriz mitocondrial de las mitocondrias fotoactivados a los que no están etiquetados, es posible utilizar esta técnica para estudiar otros procesos. Por ejemplo, fluorocromos específicos se puede unir a las proteínas de membrana para observar su movimiento específico durante los eventos de fusión, como se ha demostrado para ABC-me, la fusión de la que se produce en una escala de tiempo diferente de la mezcla de proteínas de la matriz solubles 15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> COXIII-adenoviral PA-GFP </td><td> Lippincott-Schwartz Dr. </td><td></td></tr><tr><td> TMRE </td><td> Invitrogen </td><td> T669 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 710 confocal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table>

una más rápida, de alta resolución, apmt-gfp-ensayo basado en la fusión mitocondrial adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

La fusión mitocondrial desempeña un papel esencial en la homeostasis del calcio mitocondrial, la bioenergética, la autofagia y el control de calidad. La fusión se cuantifica en células vivas mediante la fotoconversión de GFP fotoactivable dirigido a la matriz (mtPAGFP) en un subconjunto de mitocondrias. La velocidad con la que las moléculas fotoconvertidas se equilibran en toda la población mitocondrial se utiliza como medida de la actividad de fusión. Hasta ahora, las mediciones se realizaron mediante un enfoque de lapso de tiempo en una sola célula, cuantificando el equilibrio en una célula durante una hora. Aquí, ampliamos y automatizamos un método previamente publicado en células vivas basado en el uso de mtPAGFP y una baja concentración de TMRE (15 nm). Este método implica la fotoactivación de una pequeña porción de la red mitocondrial, la adquisición de series altamente resueltas de secciones confocales cada 15 minutos durante 1 hora, y la cuantificación del cambio en la intensidad de señal. Dependiendo de varios factores, como la facilidad para encontrar células que expresan PAGFP y la señal de las regiones fotoactivadas, es posible recolectar alrededor de 10 células dentro de los intervalos de 15 minutos. Esto proporciona una mejora significativa en la eficiencia temporal de este ensayo, manteniendo al mismo tiempo la cuantificación subcelular altamente resuelta así como los parámetros cinéticos necesarios para capturar el detalle del comportamiento mitocondrial en su entorno citoplasmático nativo.
La dinámica mitocondrial desempeña un papel en muchos procesos celulares, incluyendo la respiración, la regulación del calcio y la apoptosis1,2,3,13. La estructura de la red mitocondrial afecta la función de las mitocondrias y la forma en que interactúan con el resto de la célula. Sometidas a una división y fusión constantes, las redes mitocondriales adoptan diversas formas, que van desde redes altamente fusionadas hasta estados más fragmentados. Curiosamente, se ha encontrado una correlación entre la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2A y la atrofia óptica dominante con una morfología mitocondrial alterada, específicamente redes fragmentadas4,10,13. A menudo, tras la fragmentación, las mitocondrias se desestabilizan en su potencial de membrana, y su acumulación conduce a una función celular deficiente18. Se ha demostrado que la fisión mitocondrial envía señales a la célula para avanzar hacia la apoptosis. También puede proporcionar un mecanismo mediante el cual separar mitocondrias desestabilizadas e inactivas, manteniendo así la mayor parte de la red funcional14. Por otro lado, la fusión mitocondrial permite el intercambio de proteínas de la matriz, solutos, ADN mitocondrial y el gradiente electroquímico, y parece prevenir además la progresión hacia la apoptosis9. Es necesario comprender mejor cómo la fisión y fusión mitocondriales afectan la homeostasis celular y, en última instancia, el funcionamiento del organismo, por lo que resulta imprescindible el desarrollo continuo y la optimización de los métodos para obtener información sobre estos fenómenos.
Los ensayos existentes de fusión mitocondrial han revelado diversas perspectivas sobre la fisiología mitocondrial, cada uno con sus propias ventajas. El ensayo de fusión por PEG híbrido7 mezcla dos poblaciones de células marcadas de forma diferente (mtRFP y mtYFP) y analiza la cantidad de mezcla y colocalización de fluoróforos en células fusionadas y multinucleadas. Aunque este método ha proporcionado información valiosa, no todos los tipos celulares pueden fusionarse, y las condiciones que inducen la fusión implican el uso de fármacos tóxicos que probablemente afectan el proceso normal de fusión. Más recientemente, se ha desarrollado una técnica libre de células, que utiliza mitocondrias aisladas para observar eventos de fusión basándose en un ensayo de luciferasa1,5. Dos líneas celulares humanas son modificadas para expresar ya sea la parte amino o carboxi terminal de la luciferasa de Renilla, junto con un cierre de leucina para asegurar la dimerización tras la mezcla. Se aíslan mitocondrias de cada línea celular y se fusionan. La reacción de fusión puede ocurrir sin citosol bajo condiciones fisiológicas en presencia de energía, temperatura adecuada y potencial de membrana mitocondrial interna. Curiosamente, se ha encontrado que el citosol modula el grado de fusión, demostrando que la señalización celular regula este proceso4,5. Este ensayo será muy útil para cribados de alto rendimiento destinados a identificar componentes del mecanismo de fusión, así como compuestos farmacológicos que puedan afectar la dinámica mitocondrial. Sin embargo, serán necesarios ensayos mitocondriales más detallados en células completas para complementar este ensayo in vitro y observar estos eventos en un entorno celular.
Una técnica para monitorear la dinámica mitocondrial en células completas ha estado en uso durante algún tiempo y se basa en una GFP fotoactivable dirigida a mitocondrias (mtPAGFP)6,11. Tras la expresión de la mtPAGFP, se fotoactiva una pequeña porción de la red mitocondrial (10-20 %), y se registra cada 15 minutos durante 1 hora la propagación de la señal al resto de la red mitocondrial mediante imágenes confocales con lapso de tiempo. Cada evento de fusión provoca una dilución de la intensidad de la señal, lo que permite cuantificar la tasa de fusión. Aunque la fusión y la fisión ocurren continuamente en las células, esta técnica solo monitorea la fusión, ya que la fisión no provoca una dilución de la señal de PAGFP6. La doble marcación con niveles bajos de TMRE (7-15 nM en células INS1) permite cuantificar el potencial de membrana de las mitocondrias. Cuando las mitocondrias se hiperpolarizan, incorporan más TMRE, y cuando se despolarizan, pierden el colorante TMRE. Las mitocondrias que se despolarizan ya no poseen un potencial de membrana suficiente y tienden a no fusionarse eficientemente, o no lo hacen en absoluto. Por lo tanto, las mitocondrias activas en fusión pueden rastrearse con estos niveles bajos de TMRE9,15. La acumulación de mitocondrias despolarizadas que carecen de señal de TMRE puede ser un indicio de fototoxicidad o muerte celular. Concentraciones más altas de TMRE hacen que las mitocondrias sean muy sensibles a la luz láser, por lo que debe tenerse mucho cuidado para evitar una marcación excesiva con TMRE. Si el efecto de la despolarización mitocondrial es el tema de interés, puede emplearse una técnica que utilice niveles ligeramente más altos de TMRE y luz láser más intensa para despolarizar las mitocondrias de manera controlada (Mitra y Lippincott-Schwartz, 2010). Para asegurarse de que la toxicidad debida al TMRE no sea un problema, sugerimos exponer las células cargadas (3-15 nM de TMRE) a los parámetros de imagen que se utilizarán en el ensayo (quizás 7 series de 6 secciones ópticas consecutivas) y evaluar la salud celular después de 2 horas. Si las mitocondrias aparecen demasiado fragmentadas y las células están muriendo, podrían utilizarse otros marcadores mitocondriales, como dsRED o Mitotracker red, en lugar de TMRE.
El método mtPAGFP ha revelado detalles sobre el comportamiento de la red mitocondrial que no podían visualizarse mediante otros métodos. Por ejemplo, ahora sabemos que la fusión mitocondrial puede ser completa o transitoria, en cuyo caso el contenido de la matriz puede mezclarse sin que cambie la morfología general de la red. Además, sabemos que la probabilidad de fusión es independiente de la duración del contacto y de las dimensiones del orgánulo, y que está influenciada por la motilidad del orgánulo, el potencial de membrana y la historia de actividad de fusión previa8,15,16,17.
En este manuscrito, describimos una metodología para escalar el protocolo previamente publicado utilizando mtPAGFP y TMRE 15 nM8 con el fin de examinar múltiples células simultáneamente y mejorar la eficiencia temporal de la recolección de datos sin sacrificar la resolución subcelular. Esto ha sido posible gracias al uso de una platina de microscopio automatizada y un software programable de adquisición de imágenes. El software Zen de Zeiss permite al usuario marcar y rastrear varias células designadas que expresan mtPAGFP. Cada una de estas células puede ser fotoactivada en una región específica de interés, y se pueden monitorear series de cortes confocales en busca de la señal de mtPAGFP, así como de TMRE, a intervalos determinados. Otros sistemas confocales podrían utilizarse para llevar a cabo este protocolo, siempre que dispongan de una platina automatizada y programable, y de un incubador con CO2y un medio para fotoactivar el PAGFP; ya sea un láser de múltiples fotones o un láser de diodo de 405 nm.

Fusión mitocondrial se midió mediante el seguimiento de la equilibración de photoconverted matriz orientada GFP través de la red mitocondrial en el tiempo. Hasta ahora, sólo una célula podría ser sometido a un análisis cinético hora larga a la vez. Se presenta un método que mide simultáneamente varias celdas, y acelera así el proceso de recopilación de datos.

Una más rápida, de alta resolución, APMt-GFP-ensayo basado en la fusión mitocondrial Adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal

La fusión mitocondrial desempeña un papel esencial en la homeostasis del calcio mitocondrial, la bioenergética, la autofagia y el control de calidad. La fusión se cuantifica en ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en medir la fusión mitocondrial en imágenes 3D de alta resolución de múltiples células en paralelo. Esto se logra primero expresando la GFP fotoactivable mitocondrial en las células de interés. A continuación, la GFP se activa mediante luz en una pequeña región de la población mitocondrial en cada célula.Luego, se recolectan seis secciones ópticas de cada célula cada 15 minutos hasta alcanzar el equilibrio de la señal, con el fin de evaluar el grado de fusión mitocondrial; en última instancia, se puede evaluar la dilución de la intensidad de GFP en las mitocondrias diana tras la activación fotoinducida, basándose en la cuantificación de la señal fluorescente en células que experimentan fusión mitocondrial. La principal ventaja de esta técnica es que es automatizada y, por lo tanto, permite recolectar datos de alta resolución de múltiples células más rápidamente. Aunque este método se demostrará utilizando células INS-1 y proporciona información sobre la diabetes, puede aplicarse a otros tipos celulares para estudiar el proceso de fusión mitocondrial en el envejecimiento, así como en enfermedades metabólicas y neurodegenerativas.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de automatización de imágenes no se describen en ninguna otra parte. Después de cultivar las células INS-1 hasta el 80 % de confluencia, desprenda los cultivos con tripsina al 0,05 % y siembre las células resuspendidas en placas de imágenes con fondo de cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina. Después de dos días de cultivo, agregue GFP fotoactivable dirigido a la matriz mitocondrial mediante adenovirus a las placas.Luego de cultivar las células durante 24 horas, cambie el medio y permita que las células crezcan durante dos días más. El día del análisis por imagen, agregue de siete a 15 nanomolares de TMRE a las placas de imagen y equilibre los cultivos durante al menos 45 minutos. Durante este tiempo, encienda el incubador con 5% de dióxido de carbono y el microscopio, después de que el microscopio haya alcanzado el equilibrio.Bajo la pestaña de adquisición, haga clic en mostrar herramientas manuales. Abra el panel de configuración de imágenes y luego seleccione el modo de canal y cambie. Realice un seguimiento de cada cuadro en el panel de trayectoria de luz.Seleccione el modo LSM y el modo de canal. Luego, desde el icono de la muestra, seleccione hacia arriba MBS trasero seis 90 más y MBS 4 88 en la parte inferior del panel, marque TPMT para habilitar la visualización de los canales de campo brillante o DIC. Termine de ajustar los parámetros de la trayectoria de la luz estableciendo el rango para el colorante GFP de 490 a 540 nanómetros y de 580 a 700 nanómetros para el colorante TMRE.Finalmente, abra el modo de adquisición y configure un campo de escaneo de 512 por 512 píxeles en el tamaño de cuadro, menús desplegables y un promedio de cuatro x en el menú de número de promediado. Ahora, utilizando un objetivo, enfoque las células con una luz de halógeno. Abra el diafragma de entrada al máximo y escanee para encontrar las células expresoras de GFP verde brillante fotoactivable.Elige una foto con potencia láser arbitraria, activa la célula y luego toma una serie Z de secciones ópticas a través de ella para verificar si la activación es suficiente. A continuación, ajusta el láser de 488 nanómetros para imágenes a una potencia baja sin maximizar completamente la ganancia del detector, para mantener una buena relación señal-ruido. Después de asegurarte de que la señal no esté saturada, confirma que la señal de GFP fotoactivado esté co-localizada con la señal de TMRE.Finalmente, abra el diafragma de pinhole, aumente la ganancia en el detector y luego busque una nueva célula que exprese GFP fotoactivable y especifique el factor de zoom. A continuación, configure el rango de series Z para recopilar seis cortes y guarde el método de adquisición. Ahora abra la ventana de múltiples tiempos en el panel izquierdo.Seleccione el panel de guardado y haga clic en seleccionar carpeta de imágenes para especificar la ubicación donde se guardarán los archivos. Luego, en el panel de adquisición, seleccione el método de imagen recién guardado en el menú desplegable de configuración de escaneo. A continuación, seleccione el Z medio marcado de la pila Z.Ahora abra el panel de bloques y seleccione un bloque individual en cada ubicación. A continuación, haga clic en agregar bloques para cada intervalo que se va a medir, abra el panel de temporización, seleccione el intervalo de peso y luego escriba cero en el cuadro de intervalo de peso antes del bloque solo en la primera ubicación. Después de seleccionar el panel de ubicaciones, elija mover el enfoque a la posición de carga entre ubicaciones y la configuración de escaneo de carga cuando se haga clic en LO o en el siguiente LO en la lista de edición de ubicaciones, seleccione borrar todo y luego elija la platina motorizada de múltiples ubicaciones en el panel de blanqueo, marque la casilla de blanqueo y especifique el archivo de configuración en el menú desplegable de configuración.Luego, en la ventana de blanqueo del software principal, guarde el método de activación fotográfica apropiado en el panel de la región. Seleccione la ROI para esta célula en particular y agregue esta ROI a múltiples tiempos eligiendo la opción de agregar la región actual a la lista de ROI. Asegúrese de seleccionar la misma ubicación en el menú desplegable de ROI.Finalmente, para cada una de las 10 células que se seguirán con el tiempo, realice la siguiente secuencia. Primero, al encontrar una célula, indique su posición en la platina en el panel de ubicación y especifique su método particular de configuración de escaneo en el panel de adquisición. Asegúrese de especificar la configuración de escaneo para todos los bloques.Luego, en el panel de regiones principal, seleccione la región de interés que se va a activar mediante fotoestimulación. A continuación, en el panel de blanqueo, guarde la ROI y cárguela en la ventana de ROI. Después, elimine la ROI en la ventana de regiones principal y restablezca el escaneo.Aumente el zoom a uno, finalmente encuentre la siguiente célula y configure el zoom. Después de repetir el proceso para las siguientes nueve células, verifique que cada ubicación de la platina y todos los bloques tengan la configuración de escaneo adecuada designada y que el primer bloque en cada ubicación corresponda al método de activación fotoinducible apropiado, mientras que los demás contengan un método simulado. Luego, seleccione ejecutar para las células en las que la señal de GFP activada por luz se localice principalmente junto con la señal roja de TMRE.Reste el fondo en las imágenes de GFP fotoactivado, luego configure las mediciones de región para informar la intensidad promedio. A continuación, exporte los datos a un archivo de Excel para cada corte de la pila ZS. Después de omitir los planos que no tienen señal, divida la intensidad de la pila ZS de cada punto temporal por la intensidad inicial fotoactivada y obtenga el porcentaje de la señal original en la célula INS uno.Se produce una disminución significativa en la intensidad de la señal cada 15 minutos durante una hora, hasta que se alcanza el equilibrio de la fusión mitocondrial. Como se demuestra en estas imágenes proyectadas de seis secciones ópticas cuantificadas cada 15 minutos durante un ensayo típico de fusión mitocondrial. En estos ensayos, se utiliza una concentración muy baja de TMRE para ayudar a dirigir la activación fotoinducida de GFP y para monitorear la salud celular.Téngase en cuenta que existe una casi completa colocalización de la GFP fotoactivada en verde y las señales de TMRE en rojo, y que la tinción conjunta de los colorantes demuestra que las mitocondrias están activas y no desplazarizadas a concentraciones bajas de milimolar. El palmitato fragmenta las mitocondrias e inhibe la fusión mitocondrial. Por lo tanto, como se observa en estas secciones ópticas de una célula tratada con palmitato, las mitocondrias están fragmentadas y la intensidad de señal de la GFP fotoactivable dirigida a la matriz no cambió tanto como en condiciones normales, tal como se demostró en la figura anterior.Por lo tanto, la dilución de la señal de GFP fotoactivado observada en esta figura probablemente se deba a la fusión mitocondrial y no a la fisión. Al establecer este método, tenga en cuenta la necesidad de seleccionar células en las que GFP y TMRE se colocalicen, para fotoactivar una cantidad suficiente de GFP que mantenga una señal, pero no demasiada como para que no se detecten los eventos de fusión mitocondrial, y para recopilar todo el volumen mitocondrial dentro de las secciones ópticas. Para determinar qué sucede con las redes mitocondriales en ausencia de ciertas proteínas reguladoras o moléculas de señalización, este ensayo puede realizarse en varios grupos experimentales en los que se silencien genes o se traten las células con diversos agentes. La capacidad de cuantificar la fusión mitocondrial y de analizar estadísticamente los parámetros permite el estudio de la dinámica mitocondrial en estados patológicos y posibilita el desarrollo de tratamientos terapéuticos.

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