Establecimiento de cultivos de enriquecimiento microbianos eucariotas a partir de un estratificado químicamente lago de la Antártida y evaluación del potencial de carbono de fijación

El objetivo general de este procedimiento es producir cultivos de enriquecimiento de protistas a partir del Lago Bonnie antártico y medir la fijación de carbono como parte de un indicador inicial de diversidad metabólica. Esto se logra primero mediante el muestreo de profundidades del agua del lago en el Lago Bonnie que corresponden a picos conocidos de protistas y fitoplancton. Las muestras de agua del lago luego se inoculan en diversos medios de crecimiento y se incuban en una cámara de crecimiento equipada con regulador de temperatura y luces durante cuatro a seis semanas.

Los cultivos pueden transportarse según sea necesario a cuatro grados Celsius. El siguiente paso consiste en extraer lisados celulares crudos de los cultivos de enriquecimiento. El paso final de este procedimiento es evaluar el potencial de fijación de carbono en el lisado celular mediante un ensayo con radioisótopos para la ribulosa uno cinco bifosfato, carboxilasa, oxigenasa, o actividad RubisCo.

En última instancia, los cultivos de enriquecimiento de pro muestran una variación en el potencial de fijación de carbono en la comunidad natural de protestas. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre la ecología microbiana de lagos. Por ejemplo, el papel de los eucariotas microbianos en el ciclo del carbono en diversas etapas de lagos antárticos estratificados.

Aunque el muestreo de la columna de agua para generaciones sucesivas de cultivos de enriquecimiento es una técnica utilizada con frecuencia, este método incluye modificaciones para operar en un entorno extremadamente frío donde pueden surgir complicaciones imprevistas. Tuve por primera vez esta idea para este método cuando pensaba en formas de probar el ensayo Redisco en muestras naturales de lagos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del muestreo son difíciles de imaginar porque los sitios de muestreo se encuentran en un entorno ajeno a muchos investigadores.

Las muestras se recogen del lago Bonnie, uno de los numerosos lagos cubiertos permanentemente de hielo ubicados en los valles secos de McMurdo en la Antártida, un día antes de muestrear la columna de agua. Esto permitirá que las capas estratificadas de la columna de agua se reestablezcan tras la perturbación causada por la perforación y el derretimiento del agujero en el hielo. Identifique la ubicación del sitio de perforación mediante GPS para acceder a la columna de agua.

Comience perforando un agujero a través del hielo con un aga de hielo Jiffy conectado a una extensión de vuelo Jiffy de cuatro pulgadas y una broca cortadora para evitar que la perforadora se congele dentro del agujero. Trate de evitar perforar dentro del agua líquida deteniendo la perforación aproximadamente de cuatro a seis pulgadas por encima de la parte superior de la columna de agua. El agujero perforado debe ensancharse desde un diámetro de seis pulgadas hasta dos pies para el muestreo.

Esto se logra mediante el uso de un fundidor de agujeros de modelo térmico que circula polietilenglicol calentado a través de un agujero de tubería de cobre. La fusión suele tardar hasta 18 horas el día anterior a la toma de muestras de la columna de agua. Asegúrese de que todo el equipo necesario y los recipientes para almacenamiento de muestras estén reunidos en el sitio de muestreo.

Los materiales para el muestreo incluyen una botella NICU con capacidad de cinco a 10 litros, un torno con cable calibrado en profundidad, suficientes frascos de muestra para cada profundidad de muestreo, un mensajero y neveras para el transporte de las muestras. Comience el muestreo temprano en el día, aproximadamente a las 5:00 AM, ya que el filtrado del agua del lago debe completarse el mismo día del muestreo. Utilice un muestreador cinemático conectado a un torno manual calibrado.

Recolecte muestras de agua de uno a cinco litros desde las profundidades deseadas para este estudio. Las profundidades de muestreo son seis metros, 15 metros y 18 metros, medidas desde el nivel de agua simétrico del PI en el agujero de hielo. Almacene las muestras de lago en neveras portátiles y transpórtelas desde el sitio de muestreo hasta el laboratorio de campo.

Utilizando un trineo conectado a un A TV, las muestras deben procesarse o estabilizarse en el laboratorio de campo. Inmediatamente después de la toma de muestras, se debe iniciar el cultivo de cultivos de enriquecimiento una vez que las muestras hayan sido transportadas al laboratorio de campo. Concentre de 0,5 a un litro de agua de lago en un filtro de 47 milímetros con tamaño de poro de 0,45 micrones.

Filtros de sulfona de POLIÉTER mediante filtración suave. Si se desea la diversidad de la comunidad natural, filtre una segunda muestra en un filtro de 47 milímetros con tamaño de poro de 0.45 micrones.

Los filtros de sulfonato de poliéter se congelan rápidamente en nitrógeno líquido. Transfiera cada filtro a un tubo falcon estéril de 50 mililitros que contenga aproximadamente 20 mililitros de agua de lago filtrada, recolectada desde la misma profundidad de muestreo que el filtro.

Transfiera la suspensión celular a un matraz estéril de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados para enriquecimientos en diferentes medios de cultivo. Prepare múltiples réplicas para cada profundidad de muestreo. Suplemente cada matraz de cultivo con 50 x soluciones estériles de los siguientes medios de cultivo: bold basil, medio BG 11 y F dos.

Si se requiere el cultivo de organismos mixtos atróficos, prepare dos recipientes suplementados con F2 y agregue dos o tres granos de arroz estéril a uno de los frascos de cultivo, que se incubará a baja temperatura y baja radiación en un incubador de crecimiento con temperatura controlada durante al menos cuatro semanas antes del envío al laboratorio de EE. UU. Transfiera los cultivos de enriquecimiento a tubos estériles Falcon de 50 mililitros. Solicite en la solicitud de envío que no se congele y que se mantenga frío. Al llegar a EE. UU., transfiera cinco mililitros de cada cultivo de enriquecimiento a 45 mililitros de medio de crecimiento apropiado en un frasco de 125 mililitros.

Matraz erlenmeyer estéril tapado con una esponja estéril. Mantenga los cultivos de enriquecimiento como cultivos estáticos en una cámara de crecimiento ambiental con control de temperatura a cuatro grados Celsius y transfiera por radiación reducida los cultivos a medio fresco cada 30 días. Para iniciar el procedimiento de extracción de lisado celular, filtre cinco litros de cultivo de enriquecimiento en un filtro Watman GFF de 25 milímetros utilizando vacío suave.

A continuación, corte el filtro en cuatro o cinco secciones con tijeras de acero estériles. Luego use fórceps estériles para transferir los trozos a un tubo con tapón roscado de dos mililitros lleno hasta un quinto de su capacidad con una solución de 0,1 milímetros de diámetro.

Perlas de sílice de circonia. Añada 1,25 mililitros de tampón de extracción con filtro al tubo y luego rompa las células utilizando un mini agitador de perlas durante 30 segundos a una velocidad de 48 y después en hielo durante un minuto. Repita la agitación con perlas otras dos veces, con incubaciones de un minuto en hielo entre cada agitación, para evitar el calentamiento de la muestra durante la centrifugación.

Filtre la suspensión durante dos minutos a 3000 veces G a cuatro grados Celsius. Para formar un coágulo suelto de fibras del filtro GFF y restos de pared celular. Retire una alícuota de 200 microlitros del sobrenadante y sumérjala en 800 microlitros de acetona al 90% fría con hielo.

Transfiera el sobrenadante restante a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Mida la clorofila A extractable en un espectrofotómetro a longitudes de onda de 664 nanómetros y 647 nanómetros. Centrifugue el sobrenadante restante durante dos minutos a 15 000 ×g a cuatro grados Celsius.

Transfiera el S a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 mililitros evitando el precipitado de membranas celulares insolubles y las fibras restantes del filtro GFF. Este lisado celular soluble puede utilizarse ahora en el ensayo de actividad de rubisco carboxilasa, que se demostrará a continuación. Para comenzar este ensayo, transfiera 125 microlitros de cada lisado soluble a un tubo de microcentrífuga de tapón roscado de 1,5 mililitros que haya sido enfriado en hielo.

Para muestras de control negativo, agregue 125 microlitros de lisado soluble a un tubo microcentrífugo de tapón roscado de 1,5 mililitros, pero no agregue sustrato. Posteriormente, realice reacciones por duplicado para todas las muestras y controles negativos. Prepare 10 mililitros de tampón de ensayo, fresco y enfríe en hielo.

Añada suficiente tampón de ensayo para todas las muestras y los controles negativos a un tubo de cinco mililitros. A partir de este momento, todos los pasos deben realizarse bajo una campana extractora. Añada bicarbonato de sodio marcado con C 14 al tampón asignado y mantenga el tampón en hielo.

Retire 10 microlitros del tampón de ensayo que contiene C 14 y dilúyalos en un mililitro de tampón de ensayo invertido. Para mezclar, añada 100 microlitros de la mezcla diluida a tres mililitros del cóctel de conteo centelleador Bios Safe Two en un vial de centelleo e invierta para mezclar. Mida las cuentas de C 14 con un contador Beckman LS 6,500; las cuentas de centelleo deben superar las 18,000 cuentas por minuto antes de continuar con el ensayo.

Cuando se haya agregado suficiente bicarbonato de sodio marcado con C 14 al tampón de ensayo, transfiera los tubos de reacción a un baño seco preajustado a 25 grados Celsius e incube durante tres a cinco minutos. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de ensayo a los lisados e incube a 25 grados Celsius durante cinco minutos. Después de cinco minutos, añada ribulosa bisfosfato a cada muestra y permita que la reacción continúe durante cinco a 10 minutos a 25 grados Celsius.

Para detener la reacción, agregue 100 microlitros de ácido probiótico al 100 % y centrifugue durante una hora a 2000 ×g para eliminar el C14 no incorporado. Finalmente, transfiera el volumen total de las muestras a viales de centelleo que contengan tres mililitros de bios. Guarde dos viales con la mezcla de centelleo y determine las cuentas por minuto del ácido estable.

Productos finales mediante recuento por centelleo. Se utilizó el cultivo de enriquecimiento para aislar nuevos protistas fototróficos y mixotróficos adaptados al frío del lago antártico Bonnie a tres profundidades. Se emplearon varios tipos de medios de crecimiento para seleccionar una mayor diversidad de organismos: medio BBMF dos si, medio marino y medio BG 11.

La concentración de nutrientes y la radiación fotosintéticamente activa o PAR mostradas en esta tabla representan las condiciones en el momento de la recolección de las muestras. La inspección visual de los cultivos enriquecidos mediante microscopía óptica reveló que los cultivos estaban dominados por protistas fototróficos, indicado por la presencia de pigmento de clorofila en la mayoría de las células. Los cultivos también albergaban una variedad de morfologías celulares dependiendo de la profundidad de muestreo de la cual se tomó el inóculo y del tipo de medio utilizado en el cultivo.

Se midieron las tasas máximas de actividad de carboxilasa catalizada por la enzima rubis en los cultivos enriquecidos como un indicador de la fijación de carbono. También se monitoreó la abundancia potencial de clorofila. A como una estimación de la biomasa de protistas fototróficos, como se muestra aquí.

A pesar del cultivo de todos los cultivos bajo la misma temperatura, el potencial de fijación de carbono y la biomasa fototrófica varían drásticamente entre los cultivos de enriquecimiento. Se observó una actividad máxima de rubis O en los cultivos de enriquecimiento cuatro y seis creciendo en medio BBM, y en los cultivos de enriquecimiento 13 y 14 creciendo en medio BG 11. En contraste, los cultivos 1921 y 23 enriquecidos en medio de crecimiento F dos mostraron actividades máximas de carboxilasa que fueron de cuatro a 34 veces más bajas.

Estas diferencias no se debieron a niveles más bajos de biomasa en los cultivos F2, ya que la actividad de la carboxilasa se expresó en función de la clorofila a. Además, un análisis de correlación de Pearson reveló que la actividad de rubisco no se correlacionó con la concentración de clorofila a. Los cultivos de BBM se inocularon con agua del lago de seis metros y 15 metros de profundidad.

El recipiente de enriquecimiento número cinco presentó los niveles más altos de clorofila A, mientras que todos los demás cultivos mostraron clorofila a relativamente baja independientemente de la actividad de la enzima rubis. Una vez dominadas, las técnicas de muestreo de lagos tardan aproximadamente dos horas en realizarse. Dependiendo de la cantidad de muestras tomadas, el ensayo de carboxilasa también tarda dos horas cuando se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el ensayo de actividad enzimática heterótrofa, para responder preguntas adicionales, como a qué profundidad ocurre el heterótrofo. Bien, después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo recolectar muestras de lagos, enriquecerlas para su producción y ensayar la actividad de la carboxilasa rubis.