Establecimiento de cultivos de enriquecimiento microbianos eucariotas a partir de un estratificado químicamente lago de la Antártida y evaluación del potencial de carbono de fijación

El objetivo general de este procedimiento es producir cultivos de enriquecimiento de protesta a partir del lago antártico Bonnie y medir la fijación de carbono como parte de un indicador inicial de la diversidad metabólica. Esto se logra primero tomando muestras de las profundidades del agua del lago Bonnie que corresponden a picos conocidos en protestas y fitoplancton. A continuación, las muestras de agua del lago se inoculan en varios medios de crecimiento y se incuban en una cámara de crecimiento equipada con un regulador de temperatura y luces durante cuatro a seis semanas.

Los cultivos se pueden transportar según sea necesario a cuatro grados centígrados. El siguiente paso es extraer lisados celulares crudos de los cultivos de enriquecimiento. El paso final de este procedimiento es evaluar el potencial de fijación de carbono en el lisado celular utilizando un ensayo de radioisótopos para la ribulosa de cinco coactividad de bifosfato, carboxilasa, oxigenasa o Rubis.

En última instancia, las culturas a favor del enriquecimiento muestran una variación del potencial de fijación de carbono en la comunidad de protesta natural. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre la ecología microbiana de los lagos. Por ejemplo, el papel de los eucariotas microbianos en el ciclo del carbono en varias etapas en los lagos estratificados de la Antártida.

Aunque el muestreo de la columna de agua para las generaciones posteriores de cultivos de enriquecimiento es una técnica utilizada con frecuencia, este método contiene modificaciones para operar en un ambiente extremadamente frío donde pueden ocurrir complicaciones imprevistas. La primera vez que tuve esta idea para este método fue cuando estaba pensando en formas de probar el ensayo Redisco en muestras de lagos naturales. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de muestreo son difíciles de imaginar porque los sitios de muestreo se encuentran en un entorno extraño para muchos investigadores.

Las muestras se recolectan del lago Bonnie, uno de los numerosos lagos permanentemente cubiertos de hielo ubicados en los valles secos de McMurdo en la Antártida Optica un día antes de tomar muestras de la columna de agua, elegir y preparar el sitio de muestreo. Esto permitirá que las capas estratificadas de la columna de agua se reformen después de la perturbación debida a la perforación y el derretimiento de los agujeros de hielo. Identifique la ubicación del sitio de perforación por GPS para acceder a la columna de agua.

Comience perforando un agujero a través del hielo con un aga Jiffy Ice unido a una extensión de vuelo Jiffy de cuatro pulgadas y una broca de corte para evitar que el taladro se congele en el agujero. Trate de evitar perforar en el agua líquida deteniendo la perforación aproximadamente de cuatro a seis pulgadas por encima de la parte superior de la columna de agua. El orificio de perforación debe ensancharse de un diámetro de seis pulgadas a dos pies para el muestreo.

Esto se logra mediante el uso de un modelo de fundidor de orificio de mar caliente que hace circular polietilenglicol calentado a través de un orificio de tubería de cobre. El derretimiento suele tardar hasta 18 horas el día anterior a la toma de muestras de la columna de agua. Asegúrese de que todo el equipo requerido y los recipientes de almacenamiento de muestras estén ensamblados en el sitio de muestreo.

Los materiales de muestreo incluyen una botella de UCIN de cinco a 10 litros de capacidad, un cabrestante con cable calibrado en profundidad, suficientes botellas de muestra para cada profundidad de muestreo, un mensajero y refrigeradores para el transporte de muestras. Comience el muestreo temprano en el día, alrededor de las 5:00 a.m., ya que el filtrado del agua del lago debe completarse el día del muestreo. Usando un muestreador de kin conectado a un cabrestante manual calibrado.

Recoja muestras de agua de uno a cinco litros de las profundidades deseadas para este estudio. Las profundidades de muestreo son de seis metros, 15 metros y 18 metros medidos desde el nivel de agua simétrico PI en el pozo de hielo. Almacene las muestras del lago en refrigeradores y transpórtelas desde el sitio de la muestra hasta el laboratorio de campo.

Usando un trineo unido a un televisor A, las muestras deben procesarse o estabilizarse en el laboratorio de campo. Inmediatamente después del muestreo, el cultivo de cultivos de enriquecimiento debe comenzar una vez que las muestras se hayan transportado al laboratorio de campo. Concentra de 0,5 a un litro de agua de lago en un tamaño de poro de 47 milímetros y 0,45 micras.

POLYETHERS filtra la sulfona mediante filtración suave. Si se desea la diversidad de la comunidad natural, filtre una segunda muestra en 47 milímetros. Tamaño de poro de 0,45 micras.

Los filtros de sulfona POLYETHERS congelan rápidamente los filtros en nitrógeno líquido. Transfiera cada filtro a un tubo halcón estéril de 50 mililitros que contiene alrededor de 20 mililitros de agua de lago filtrada. Se recoge a partir de la misma profundidad de muestreo que el filtro.

Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo celular estéril de 25 centímetros cuadrados para enriquecerlo en diferentes medios de cultivo. Configure varias réplicas para cada profundidad de muestreo. Complemente cada matraz de cultivo con 50 soluciones estériles de los siguientes medios de cultivo, albahaca negrita, medio, BG 11 y F dos.

Si se requiere el cultivo de organismos atróficos mixtos, se deben instalar dos recipientes suplementados y agregar dos o tres granos de arroz estéril a uno de los matraces de cultivo de incubación a baja temperatura y menor resplandor en una incubadora de crecimiento a temperatura controlada durante al menos cuatro semanas antes del envío al laboratorio de los EE. UU. para su envío a los EE. UU. Transfiera los cultivos de enriquecimiento a tubos Falcon estériles de 50 mililitros. Solicite los requisitos de envío de no congelar y mantener fresco en la solicitud de envío. A su llegada a los EE. UU., transfiera cinco mililitros de cada cultivo de enriquecimiento a 45 mililitros de medio de crecimiento apropiado en un medio de crecimiento de 125 mililitros.

El cerrojo estéril puede estar tapado con una esponja estéril. Manteniendo los cultivos de enriquecimiento como cultivos en pie en una cámara de crecimiento ambiental a temperatura controlada de cuatro grados Celsius y menor radiancia, transfiera los cultivos a medios frescos cada 30 días. Para comenzar el procedimiento de extracción de lisado celular, filtre cinco litros de cultivo de enriquecimiento en un filtro watman GFF de 25 milímetros utilizando una aspiradora suave.

A continuación, corte el filtro en cuatro o cinco secciones con unas tijeras de acero estériles. A continuación, utilice pinzas estériles para transferir las piezas a un tubo de rosca de dos mililitros lleno. Un quinto del camino lleno con 0,1 milímetros de diámetro.

Perlas de sílice de circonio. Agregue 1,25 mililitros de tampón de extracción de filtro al tubo y luego interrumpa las celdas con una mini cuenta de abalorios durante 30 segundos en un ajuste de velocidad de 48 y luego hielo durante un minuto. Repita el 32º batido de cuentas dos veces más con incubaciones de hielo de un minuto entre el batido de cuentas para evitar el calentamiento de la centrífuga de muestras.

La lechada del filtro se agita durante dos minutos a 3000 veces G a cuatro grados centígrados. Para formar una capa suelta de fibras de filtro GFF y desechos de la pared celular. Retirar un cuasi de 200 microlitros de la snat y sumergir en 800 microlitros de acetona helada al 90%.

Transfiera el snat restante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mida la clorofila A extraíble en un espectrofotómetro a valores de longitud de onda de 6 64 nanómetros y 6 47 nanómetros de centrífuga. El resto del SUP natante durante dos minutos a 15.000 veces G a cuatro grados centígrados.

Transfiera el S a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros mientras evita la pellets de membranas celulares insolubles y las fibras de filtro GFF restantes. Este lisado de células solubles se puede utilizar ahora en el ensayo de actividad de la carboxilasa rubis, que se demostrará a continuación. Para comenzar este ensayo, transfiera 125 microlitros de cada lisado soluble a un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 1,5 que se haya enfriado en hielo.

Para muestras de control negativo, agregue 125 microlitros de lisado soluble a un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 1,5 mililitros, pero no agregue sustrato. Posteriormente, ejecute reacciones duplicadas para todas las muestras y controles negativos. Prepare 10 mililitros de tampón de ensayo, fresco y enfríe con hielo.

Es decir, suficiente tampón de ensayo para todas las muestras y controles negativos en un tubo de cinco mililitros. A partir de aquí, todos los pasos deben realizarse bajo una campana extractora. Agregue bicarbonato de sodio marcado con C 14 al tampón asignado y mantenga el tampón en hielo.

Extraer 10 microlitros del tampón de ensayo que contiene C 14 y diluirlo en un mililitro de tampón de ensayo invertido. Para mezclar, agregue 100 microlitros de la mezcla diluida a tres mililitros de cóctel de conteo de dos centelleos seguros bios en un vial de centelleo e invierta para mezclar. La medida C 14 recuentos con un Beckman LS 6, 500 recuentos de contracentelleo deben ser superiores a 18, 000 recuentos por minuto antes de continuar con el ensayo.

Cuando se haya añadido suficiente bicarbonato de sodio marcado con C 14 al tampón de ensayo, mueva los tubos de reacción a un baño seco, preajustado a 25 grados centígrados e incube durante tres a cinco minutos. A continuación, añada 100 microlitros de tampón de ensayo a los lisados e incube a 25 grados centígrados durante cinco minutos. Después de cinco minutos, agregue bifosfato de ribulosa a cada muestra y deje que la reacción continúe durante cinco a 10 minutos a 25 grados centígrados.

Para detener la reacción, agregue 100 microlitros de centrífuga de ácido probiótico al 100% durante una hora a 2000 veces G para expulsar el C 14 no incorporado. Finalmente, transfiera el volumen total de las muestras a viales de centelleo que contengan tres mililitros de bios. El cóctel de conteo seguro de dos centelleos determina los recuentos por minuto de ácido estable.

Productos finales por conteo de centelleo. El cultivo de enriquecimiento se utilizó para aislar nuevos brotes fototróficos adaptados al frío y mezclar atróficos del lago Bonnie antártico a tres profundidades. Se utilizaron varios tipos de medios de crecimiento para seleccionar una mayor diversidad de organismos, negritas, medio de albahaca o BBMF dos si, medio marino y medio BG 11.

La concentración de nutrientes y la radiación fotosintéticamente activa o PAR que se muestran en esta tabla representan las condiciones en el momento de la recolección de la muestra. La inspección visual de los cultivos de enriquecimiento mediante microscopía óptica reveló que los cultivos estaban dominados por protestas fototróficas, como lo indica la presencia de pigmento de clorofila en la mayoría de las células. Los cultivos también albergaron una variedad de morfologías celulares dependiendo de la profundidad de muestreo de la que se tomó el inóculo y el tipo de medio utilizado en el cultivo.

Se midieron las tasas máximas de actividad de la carboxilasa catalizada por la enzima rubis en los cultivos enriquecidos como indicador de la fijación de carbono. Clorofila potencial. También se monitoreó una abundancia como una estimación de la biomasa fototrófica de protesta, como se muestra aquí.

A pesar del cultivo de todos los cultivos a la misma temperatura, el régimen de luz, el potencial de fijación de carbono y la biomasa fototrófica varían drásticamente entre los cultivos de enriquecimiento. Se observó la máxima actividad de rubis O en los cultivos de enriquecimiento cuatro y seis, creciendo en los medios BBM, y los cultivos de enriquecimiento 13 y 14 creciendo en los medios BG 11. En contraste, los cultivos 1921 y 23 enriquecidos en el medio de crecimiento F dos exhibieron actividades máximas de carboxilasa que fueron de cuatro a 34 veces más bajas.

Estas diferencias no se debieron a niveles más bajos de biomasa en los dos cultivos F, ya que la actividad de la carboxilasa se expresó sobre una base de clorofila a. Además, un análisis de correlación de Pearson reveló que la coactividad de rubis no se correlacionó con la concentración de clorofila a. Los cultivos BBM se inocularon con agua de lago desde seis metros y 15 metros.

El foro cinco de enriquecimiento tuvo los niveles más altos de clorofila A, mientras que todos los demás cultivos exhibieron clorofila A relativamente baja, independientemente de la actividad de la enzima rubis. Una vez dominadas, las técnicas de muestreo del lago tardan unas dos horas en realizarse. Dependiendo de la cantidad de muestras que se tomen, el ensayo de carboxilasa también tarda dos horas cuando se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el ensayo de actividad enzimática heterótrofa, para responder a preguntas adicionales, como qué heterótrofo a profundidad se produce. Bien, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar muestras de lagos, enriquecerlas para producir y analizar la actividad de la carboxilasa rubis.