Visualización y análisis de flujo de la sangre y del consumo de oxígeno en la microcirculación hepática: Aplicación a un Modelo de cuadro de hepatitis aguda

Se desarrolló un sistema óptico para visualizar la microcirculación hepática con eritrocitos marcados fluorescentes y para medir la presión parcial de oxígeno en los microvasos con imágenes de fosfoterapia asistidas por láser. Este método se puede utilizar para investigar mecanismos fisiológicos y patológicos mediante el análisis de la estructura microvascular, el diámetro, la velocidad del flujo sanguíneo y la tensión de oxígeno. En la microcirculación hepática, la sangre fluye desde las CE portales a las CE centrales, creando un gradiente de oxígeno entre las dos.

La concentración de oxígeno en el hígado afecta tanto a la expresión enzimática como a la patología, realizando análisis de flujo sanguíneo y medición de oxígeno. Temas importantes de investigación. Nuestro método experimental consiste en la administración intravenosa de glóbulos rojos marcados con fluorescente.

Con el fin de visualizar la microcirculación utilizando fluorescencia para la medición de la presión parcial de oxígeno, administramos porfirina de paladio por vía intravenosa, que emite fosforescente en el torrente sanguíneo cuando es excitada por un láser en un grado que depende de la concentración de oxígeno circundante. Este proceso permite el análisis cuantitativo del oxígeno, la medición de la presión parcial de la microcirculación hepática mostró una presión parcial de oxígeno portal y venal central de 59.8 y 38.9 milímetros de mercurio respectivamente, demostrando una medición efectiva de la concentración de oxígeno. A continuación, aplicamos esta metodología a un modelo de hepatitis.

Encontramos una presión parcial de oxígeno elevada en las CE portales sinusoidales y centrales, pero una diferencia de presión disminuida entre las CE portales y centrales. Es probable que esto se deba a la disminución del consumo de oxígeno en el área central de Ven debido a la necrosis de los hepatocitos. Estos resultados muestran que nuestra metodología de utilizar un sistema óptico para medir la hemodinámica hepática y el consumo de oxígeno es capaz de dilucidar los mecanismos de diversas enfermedades hepáticas en la microcirculación hepática.

El gradiente de oxígeno es un parámetro esencial que involucra la expresión de enzimas en las regiones periportal y paracentral, tipos de enfermedades hepáticas relacionadas con microdistribuciones, por lo que es importante cuantificar el flujo sanguíneo y el consumo de oxígeno. Para aclarar los mecanismos, la ventaja de nuestro método es que la medición óptica continua y sin contacto puede cuantificar el flujo sanguíneo, los diámetros de los vasos blastos y el gradiente de oxígeno en la microcirculación hepática. Se extrajo sangre entera de un ratón donante y los eritrocitos se lavaron dos veces con PBS por centrifugación a 400 G durante cinco minutos.

A continuación, disuelva dos miligramos de FITC en un mililitro, 100 milimolares de hidrogenofosfato de sodio DI antes de filtrar a través de una membrana de poros de 0,2 micras. A continuación, coloque una solución FITC de un mililitro en un tubo de ensayo junto con una solución diestra de 0,15 mililitros y tres milimolares, un fosfato de hidrógeno sódico DI de 0,25 mililitros y 180 milimolares y un fosfato de hidrógeno sódico DI de 1,5 mililitros y 100 milimolares y toque para mezclar. Manténgalo a temperatura ambiente durante dos horas antes de lavar los glóbulos rojos manchados dos veces con PBS.

A continuación, coloque una pequeña cantidad de suspensión de glóbulos rojos en un portaobjetos de vidrio y confirme tanto la apariencia normal de los glóbulos rojos como la fluorescencia suficiente, suspenda 0,1 mililitros de glóbulos rojos en 0,9 mililitros de PBS y manténgalo cuatro grados centígrados hasta que lo use a continuación, disuelva 500 miligramos de BSA en 10 mililitros de PBS. A continuación, añada 30 miligramos de paladio porfirina y agite la centrífuga durante la noche, la solución para eliminar cualquier paladio porfirina no disuelta y filtre la natina SUP a través de una membrana po de 0,2 micras elocuente, un mililitro de filtrado en tubos de ensayo y almacene a menos 20 grados centígrados. Tenga cuidado de evitar la congelación y descongelación repetidas.

Para visualizar la microcirculación microscópicamente, corte un orificio de 20 milímetros de diámetro en una placa de plástico y cubra el orificio con una cubierta de vidrio cuadrada de 30 milímetros hacia un lado. Extienda el lóbulo hepático principal sobre una placa de plástico en posición prona después de canular una vena de la cola. A continuación, use varias secciones de tres milímetros por ocho milímetros de envoltura de plástico para alimentos para cubrir el área que rodea el lóbulo para evitar el movimiento de la respiración y el secado.

Visualice la circulación hepática con un microscopio de transmisión y confirme que no hay estasis del flujo sanguíneo en el campo de visión durante al menos 15 minutos. Para observar el flujo sanguíneo, inyecte gradualmente. Señale dos mililitros de glóbulos rojos marcados con fluorescencia.

Para medir la presión parcial de oxígeno, inyecte 0,2 mililitros de solución de paladio y porfirina. Los glóbulos rojos marcados con FITC representarán el 50 de todos los glóbulos rojos en circulación en la región visualizada, excitarán el FITC al irradiarlo con una lámpara de mercurio que pasa a través de un filtro de paso de banda de 450 a 490 nanómetros y registrarán la fluorescencia con una cámara CCD. La fosforescencia de paladio y porfirina es relativamente débil y requiere un detector de alta sensibilidad y una habitación oscura.

Los picos de absorción de paladio porfirina son de alrededor de 410 y 532 nanómetros, y se recomienda la segunda longitud de onda armónica de 532 nanómetros. Esta longitud de onda es producida por un láser de pulso YAG de neodimio, conecta el rayo láser a un microscopio invertido y se ajusta de tal manera que el haz ilumina el centro del plano focal. La resolución espacial del láser depende del tamaño del punto, que se puede ajustar haciendo pasar el haz a través de un agujero de alfiler.

Conecte un filtro de paso largo y un tubo fotomultiplicador al microscopio para detectar la fosforescencia. El PMT debe ser sensible a las longitudes de onda rojas, especialmente alrededor de 700 nanómetros. Muestree la señal fosforescente y calcule la constante de tiempo de desintegración aplicando una función exponencial.

En este experimento, muestreamos 500 puntos a 200 kilohercios. Para calibrar, prepare dos soluciones de porfirina de paladio con una presión parcial de oxígeno de 150 y cero milímetros de mercurio cada una. Para la solución de cero milímetros de mercurio, agregue 1% de sodio dihi a las muestras para crear la condición en la que el oxígeno esté ausente durante la calibración.

Mantenga un pH de la muestra de 7,4 y una temperatura de 37 grados centígrados. Coloque el ratón en la platina del microscopio y ajuste los microvasos para los que desea visualizar la microcirculación hepática hasta el punto del punto láser de ratones rápidos con acceso libre al agua durante la noche, inyecte paracetamol a 200 miligramos por kilogramo intraperitoneal 24 horas después de la inyección, anestesiar al ratón y exponer el hígado con una incisión mediana. Si hay hepatitis, será fácilmente visible a simple vista a través de la necrosis en la región paracentral.

Nuestra medición de la presión parcial de oxígeno y los microvasos hepáticos en ratones mostró presiones medias de oxígeno para los portales, los suelos sinusales y las vees centrales de 59,8, 48,2 y 38,9 milímetros de mercurio respectivamente. En otras palabras, el gradiente de oxígeno desde la CE portal hasta la central indica una liberación suficiente de oxígeno de los glóbulos rojos a medida que pasan a través de los sinusoides. Preparamos ratones con hepatitis inducida por acetaminofén para medir los microvasos hepáticos.

Como modelo de patología de ejemplo, encontramos que las presiones parciales de oxígeno en las V portales, las E sinusoidales y centrales fueron más altas en el grupo de acetaminofén en comparación con los ratones normales. La diferencia de presión parcial de oxígeno entre las veas portal y central fue de 20,9 milímetros de mercurio para los ratones normales y de 16,9 milímetros de mercurio para los ratones modelo de hepatitis. La diferencia de presión parcial de oxígeno entre las veas portal y central fue de 20,9 milímetros de mercurio para los ratones normales y de 16,9 milímetros de mercurio para los ratones modelo de hepatitis.

El gradiente de oxígeno en la microcirculación hepática surge principalmente debido al suministro de oxígeno desde la vena portal que es consumido por los hepatocitos, la necrosis de los hepatocitos en el área venal central causada por el paracetamol resulta en una disminución del consumo de oxígeno, microcirculación aguas abajo y, por lo tanto, problemas relacionados con la hemodinámica. El suministro y el consumo de oxígeno están involucrados en muchas formas de enfermedad hepática. Se realizó un modelo de hepatitis aguda y se encontró un aumento de la tensión de oxígeno en los microvasos.

Nuestro sistema óptico se puede utilizar para investigar mecanismos fisiológicos y patológicos mediante el análisis de la estructura microvascular, la distribución del flujo y el consumo de oxígeno.