Visualización y análisis de flujo de la sangre y del consumo de oxígeno en la microcirculación hepática: Aplicación a un Modelo de cuadro de hepatitis aguda

Se desarrolló un sistema óptico para visualizar la microcirculación hepática con eritrocitos marcados con fluorescencia y para medir la presión parcial de oxígeno en los microvasos mediante imágenes de fosfo con asistencia láser. Este método puede utilizarse para investigar mecanismos fisiológicos y patológicos mediante el análisis de la estructura microvascular, el diámetro, la velocidad del flujo sanguíneo y la tensión de oxígeno. En la microcirculación hepática, la sangre fluye desde los ES portales hasta los Es centrales, creando un gradiente de oxígeno entre ambos.

La concentración de oxígeno en el hígado afecta tanto la expresión enzimática como la patología, convirtiendo el análisis del flujo sanguíneo y la medición del oxígeno en temas importantes de investigación. Nuestro método experimental consiste en la administración intravenosa de glóbulos rojos marcados con fluorescencia.

Con el fin de visualizar la microcirculación utilizando fluorescencia para la medición de la presión parcial de oxígeno, administramos por vía intravenosa pofirina de paladio, que emite fosforescencia en la corriente sanguínea cuando es excitada por un láser en un grado dependiente de la concentración de oxígeno circundante. Este proceso permite el análisis cuantitativo del oxígeno; la medición de la presión parcial en la microcirculación hepática mostró una presión parcial de oxígeno portal y central de 59,8 y 38,9 milímetros de mercurio, respectivamente, demostrando una medición efectiva de la concentración de oxígeno. A continuación, aplicamos esta metodología a un modelo de hepatitis.

Encontramos una presión parcial de oxígeno elevada en los sinusoides ES portales y en los ES centrales, pero una diferencia de presión reducida entre los ES portales y centrales. Esto probablemente se deba a una disminución del consumo de oxígeno en la zona venosa central debido a la necrosis de hepatocitos. Estos resultados demuestran que nuestra metodología, que utiliza un sistema óptico para medir la hemodinámica hepática y el consumo de oxígeno, es capaz de elucidar los mecanismos de diversas enfermedades hepáticas en la microcirculación hepática.

El gradiente de oxígeno es un parámetro esencial que interviene en la expresión de enzimas en las regiones periportales y paracentrales, así como en diversos tipos de enfermedades hepáticas relacionadas con distribuciones microscópicas, por lo que es importante cuantificar el flujo sanguíneo y el consumo de oxígeno. Para esclarecer los mecanismos, la ventaja de nuestro método radica en que permite mediciones ópticas continuas y sin contacto, capaces de cuantificar el flujo sanguíneo, los diámetros de los vasos sanguíneos y el gradiente de oxígeno en la microcirculación hepática. Se extrajo sangre completa de un ratón donante y los eritrocitos se lavaron dos veces con PBS mediante centrifugación a 400 G durante cinco minutos.

A continuación, disuelva dos miligramos de FITC en un mililitro de fosfato monosódico de sodio desionizado 100 milimolar, antes de filtrar a través de una membrana con poros de 0,2 micrones. Luego coloque una solución de un mililitro de FITC en un tubo de ensayo junto con 0,15 mililitros de una solución de dextrano 3 milimolar, 0,25 mililitros de fosfato monosódico de sodio desionizado 180 milimolar y 1,5 mililitros de fosfato monosódico de sodio desionizado 100 milimolar, y agite suavemente para mezclar. Incube a temperatura ambiente durante dos horas antes de lavar los glóbulos rojos teñidos dos veces con PBS.

A continuación, coloque una pequeña cantidad de suspensión de GR en un portaobjetos de vidrio y confirme tanto la apariencia normal de los GR como la fluorescencia suficiente. Suspender 0,1 mililitro de GR en 0,9 mililitros de PBS y mantenerlo a cuatro grados Celsius hasta su uso. A continuación, disuelva 500 miligramos de albúmina sérica bovina en 10 mililitros de PBS. Luego agregue 30 miligramos de porfirina de paladio y agite durante la noche. Centrifugue la solución para eliminar cualquier porfirina de paladio no disuelta y filtre el sobrenadante a través de una membrana de poro de 0,2 micrones. Aliquote un mililitro del filtrado en tubos de ensayo y almacene a menos 20 grados Celsius. Tenga cuidado de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.

Para visualizar microscópicamente la microcirculación, corte un orificio de 20 milímetros de diámetro en una placa de plástico y cubra el orificio con un cubreobjetos cuadrado de 30 milímetros por lado. Extienda el lóbulo hepático principal sobre una placa de plástico en posición prona tras canular una vena de la cola. A continuación, utilice varias secciones de film plástico para alimentos de tres milímetros por ocho milímetros para cubrir la zona que rodea el lóbulo y evitar el movimiento provocado por la respiración y la desecación.

Visualice la circulación hepática con un microscopio de transmisión y confirme que no hay estasis del flujo sanguíneo en el campo de visión durante al menos 15 minutos. Para observar gradualmente el flujo sanguíneo, inyecte punto dos mililitros de glóbulos rojos marcados con fluorescencia.

Para medir la presión parcial de oxígeno, inyecte 0,2 mililitros de solución de porfirina de paladio. Los glóbulos rojos marcados con FITC representarán un cincuentavo del total de glóbulos rojos en circulación en la región visualizada; excite el FITC irradiándolo con una lámpara de mercurio que pase a través de un filtro de banda pasante de 450 a 490 nanómetros y registre la fluorescencia con una cámara CCD. La fosforescencia de la porfirina de paladio es relativamente débil y requiere un detector de alta sensibilidad y una habitación oscura.

Los picos de absorción de la porfirina de paladio se sitúan alrededor de 410 y 532 nanómetros, y se recomienda la longitud de onda del segundo armónico de 532 nanómetros. Esta longitud de onda es producida por un láser de pulso de neodimio YAG; conecte el haz láser a un microscopio invertido y ajústelo de modo que el haz ilumine el centro del plano focal. La resolución espacial del láser depende del tamaño del punto, que puede ajustarse haciendo pasar el haz a través de un diafragma de orificio.

Conecte un filtro de paso largo y un tubo fotomultiplicador al microscopio también para detectar la fosforescencia. El PMT debe ser sensible a longitudes de onda rojas, especialmente alrededor de 700 nanómetros. Muestree la señal fosforescente y calcule la constante de tiempo de decaimiento aplicando una función exponencial.

En este experimento, muestreamos 500 puntos a 200 kilohercios. Para calibrar, prepare dos soluciones de porfirina de paladio con una presión parcial de oxígeno de 150 y cero milímetros de mercurio, respectivamente. Para la solución de cero milímetros de mercurio, agregue 1% de dihi sodio a las muestras para crear la condición en la que el oxígeno está ausente durante la calibración.

Mantenga un pH de la muestra de 7,4 y una temperatura de 37 grados Celsius. Coloque el ratón sobre la platina del microscopio y ajuste los microvasos para los cuales desea visualizar la microcirculación hepática al punto del haz láser. Los ratones con acceso libre al agua durante la noche reciben una inyección intraperitoneal de acetaminofén a 200 miligramos por kilogramo. Veinticuatro horas después de la inyección, anestesie al ratón y exponga el hígado mediante una incisión mediana. Si existe hepatitis, será fácilmente visible a simple vista mediante la necrosis en la región paracentral.

Nuestra medición de la presión parcial de oxígeno y de microvasos hepáticos en ratones mostró presiones medias de oxígeno para las venas portales, los senos sinusoides y las venas centrales de 59,8, 48,2 y 38,9 milímetros de mercurio, respectivamente. En otras palabras, el gradiente de oxígeno desde las venas portales hasta las venas centrales indica una liberación suficiente de oxígeno por los glóbulos rojos a medida que pasan a través de los sinusoides. Preparamos ratones con hepatitis inducida por acetaminofén para medir los microvasos hepáticos.

Como modelo de patología, descubrimos que las presiones parciales de oxígeno en las venas portales, los sinusoides y las venas centrales eran más altas en el grupo con acetaminofén en comparación con los ratones normales. La diferencia de presión parcial de oxígeno entre las venas portales y centrales fue de 20,9 milímetros de mercurio en ratones normales y de 16,9 milímetros de mercurio en ratones con el modelo de hepatitis. La diferencia de presión parcial de oxígeno entre las venas portales y centrales fue de 20,9 milímetros de mercurio en ratones normales y de 16,9 milímetros de mercurio en ratones con el modelo de hepatitis.

El gradiente de oxígeno en la microcirculación hepática surge principalmente debido al suministro de oxígeno proveniente de la vena porta que es consumido por los hepatocitos; la necrosis de hepatocitos en la zona venosa central causada por el acetaminofén provoca una disminución del consumo de oxígeno, de la microcirculación aguas abajo y, por lo tanto, problemas relacionados con la hemodinámica. El suministro y el consumo de oxígeno están implicados en muchas formas de enfermedad hepática. Creamos un modelo de hepatitis aguda y encontramos un aumento de la tensión de oxígeno en los microvasos.

Nuestro sistema óptico puede utilizarse para investigar mecanismos fisiológicos y patológicos mediante el análisis de la estructura microvascular, más que la distribución del flujo y el consumo de oxígeno.