El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

Existe una necesidad urgente de contar con una enumeración asequible de CD cuatro para monitorear la enfermedad por VIH en regiones con recursos limitados. Este video demuestra una prueba de cribado de bajo costo y uso cercano al paciente, en la cual se determinan los conteos de CD cuatro basándose en la presencia del inhibidor de proteinasa Alfa uno PI en la saliva. Para ello, primero se da al sujeto o paciente un caramelo de limón para estimular la exudación de líquido seroso hacia la saliva.

La saliva se recoge en un vaso de muestra y se transfiere a una placa de ensayo de 96 pocillos. Luego, se añade una cantidad saturante de la proteinasa elastasa pancreática porcina a la saliva, donde se une e inhibe la alfa uno pi. A continuación, se añade el sustrato colorimétrico para elastasa.

Cualquier elastasa no ligada restante escinde el sustrato, lo que provoca un cambio de color de transparente a amarillo. Se añade azul Kumasi a los pocillos para teñir las proteínas totales, y se realizan mediciones colorimétricas utilizando un lector de microplacas. Finalmente, se determina la relación entre alfa-1 antitripsina y proteína total, y se utiliza para evaluar con precisión los recuentos de CD4 según un valor de índice.

Existen varias ventajas de esta técnica frente al método existente, que es la citometría de flujo. El ensayo se puede realizar en campo sin necesidad de recolectar sangre, lo cual es traumático y costoso, sin usar anticuerpos monoclonales, que son costosos, sin requerir formación técnica ni necesidad de refrigeración o transporte de muestras. Este método supera una barrera crítica para la intervención del SIDA y debería tener un impacto importante en los costos y resultados de salud de los pacientes, así como en la frecuencia de transmisión del VIH, todos los cuales tienen un gran impacto en la economía global.

Este método puede proporcionar información sobre cómo la Alpha y la PI regulan el número de células T CD4 mediante la adhesión y la migración, pero también puede aplicarse a otros sistemas, como la forma en que otros inhibidores proteicos regulan la adhesión y la migración celular de otros tipos celulares. Tuvimos la idea inicial de este método cuando descubrimos que la PI alfa 1 era tan baja en pacientes infectados con VIH, que en realidad limita la cantidad de células T CD4 que llegan a la sangre. Comience este protocolo preparando las soluciones de trabajo necesarias para cada microplaca que vaya a utilizarse.

Prepare 60 mililitros de tris 0,05 molar, tampón salino o TBS a un pH de 7,8. Además, para cada microplaca, prepare seis mililitros de elastasa pancreática porcina tipo uno o PPE. Agite bien la suspensión de PPE y luego dilúyala en TBS hasta una concentración de aproximadamente 0,01 unidades por mililitro.

A continuación, prepare una solución stock de 0,1 molar del sustrato colorimétrico SA tres NA en DMSO. Esta solución stock debe usarse inmediatamente o almacenarse a menos 20 grados Celsius si se va a utilizar inmediatamente. Prepare seis mililitros de una solución de trabajo para cada microplaca diluyéndola uno en 100 en TBS. Finalmente, prepare una solución stock de azul brillante de Coomassie R dos 50 al 10 % en TBS y úsela inmediatamente o almacénela a menos 20 grados Celsius si se va a utilizar inmediatamente.

Prepare seis mililitros para cada microplaca diluyendo el stock uno en 1000 en TBS. Al manipular saliva, es importante tomar precauciones adecuadas, como usar guantes y una bata de laboratorio, con el sujeto de investigación o paciente en posición erecta. Coloque un SGO en la boca para estimular la exudación sérica.

El papel del paciente con VIH en esta demostración lo desempeña un asistente de investigación. Un caramelo de limón sin azúcar es adecuado para pacientes con VIH tipo uno, quienes con frecuencia son edéntulos e incapaces de masticar chicle; tráguelo según sea necesario durante los primeros tres minutos y recoga la saliva de toda la boca en un recipiente para muestra durante los siguientes tres minutos. Esto proporcionará aproximadamente dos mililitros de saliva.

Si la saliva no se va a utilizar inmediatamente, congélela y almacénela a menos 80 grados Celsius el día del procesamiento; luego descongele la muestra a 37 grados Celsius. Una vez descongelada, la saliva puede almacenarse a dos a cuatro grados Celsius durante un máximo de tres días. Cada muestra y control se sembrarán por triplicado en una placa de fondo plano de 96 pocillos para preparar el ensayo con 130 microlitros de TBS en cada uno de los pocillos de muestra y de control.

Luego evite la mucina, que es viscosa y no contiene exudado sérico. Transfiera 20 microlitros de saliva a cada uno de los tres pozos de prueba y a los tres pozos de control negativo. A continuación, agregue 20 microlitros de TBS a los pozos de control positivo mezclando mediante pipeteo.

En este paso, es importante evitar generar remolinos que produzcan burbujas al pipetear la saliva, así como evitar pipetear las partículas sólidas y el moco. A continuación, agite suavemente la solución de trabajo de elastasa pancreática PO o PPE para mezclarla bien, y luego añada 50 microlitros de la muestra y de los pozos de control positivo a los pozos de control negativo.

Añada 50 microlitros de TBS. No es necesario mezclar, ya que el volumen añadido es suficientemente grande para permitir una distribución uniforme en la mezcla de saliva. Incube la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Tras la incubación, añada 50 microlitros de la solución de trabajo del sustrato de elastasa SA tres NA a cada pozo. Luego incube durante 45 minutos adicionales a 23 grados Celsius. Después de 45 minutos transcurridos, añada 50 microlitros de la solución de trabajo de Kumasi blue a cada pozo.

Luego lea la absorbancia en un lector de microplacas a 405 nanómetros para detectar el corte de SA tres NA y a 595 nanómetros para detectar el azul de kumasi, que representa el contenido total de proteína. Para calcular el índice alfa uno PI, primero utilice la siguiente fórmula para obtener la absorbancia normalizada para cada longitud de onda dividiendo la diferencia entre el promedio de la muestra y el promedio del control negativo por la diferencia entre el promedio del control positivo y el promedio del control negativo. Luego, para obtener el índice alfa uno PI, divida la absorbancia normalizada a 405 nanómetros por la absorbancia normalizada a 595 nanómetros, como se muestra aquí, para determinar si la prueba alfa podría ser adecuada para usarse como una prueba de cribado en el punto de atención para monitorear los conteos de CD cuatro en regiones endémicas con recursos limitados.

Se recolectó saliva estimulada de 20 mujeres y 11 hombres con VIH-1 que asistieron a una clínica para atención rutinaria en Camerún. De acuerdo con observaciones preliminares durante el desarrollo del test alfa utilizando saliva recolectada en la ciudad de Nueva York, el índice alfa-1 PI y la saliva recolectada en Camerún se correlacionaron con los recuentos de CD4 con un valor de R cuadrado de 0,91 y un valor de P inferior a 0,0001. La relación fue definida por una curva sigmoidea de tres parámetros, lo cual es consistente con la relación dosis-respuesta. Los intervalos de confianza y predicción del 95 % se representan con líneas azules y rojas, respectivamente.

En un estudio previo, determinamos que las células T CD4 positivas presentan ciclos sinusoidales con una periodicidad de 23 ± 3,5 días en sujetos con VIH-1 y en sujetos con la versión heredada del déficit de alfa-1 PI, PIZZ. Aquí se muestra un ejemplo representativo del análisis por curva sinusoidal generada por computadora del ciclo de CD4 en un control sano no infectado por el VIH que exhibe una periodicidad de 27 días. El análisis por curva sinusoidal generada por computadora de los cambios en células T CD4 positivas en seis sujetos arrojó valores de amplitud pico a pico y eje de oscilación como se esperaría. El eje de oscilación se correlacionó con la amplitud con un valor de R² de 0,96 y un valor p de 0,009.

En pacientes con recuentos bajos de linfocitos T CD4 positivos, los cambios cíclicos en el recuento de células T CD4 fueron pequeños, y en pacientes con recuentos altos de células T CD4 positivas, los cambios cíclicos fueron grandes, porque la línea de regresión representada aquí estima el eje de oscilación, y el eje de oscilación se encuentra correlacionado con la amplitud. La amplitud puede calcularse a partir de la línea de regresión para estimar cuánto por encima y por debajo de dicha línea se esperaría que variaran las células T CD4 positivas debido al ciclo. Al superponer la amplitud calculada y el intervalo de confianza, se observó que la amplitud indicada por la línea verde se encuentra dentro del intervalo de confianza del 95 % indicado por la línea azul.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 90 minutos, desde el momento de la recolección de saliva hasta obtener el número de células CD4 para el paciente. Este procedimiento está destinado a utilizarse como una prueba de cribado para monitorear los conteos de CD4. Si un paciente muestra cambios importantes en los conteos de CD4, entonces se debe realizar un seguimiento mediante citometría de flujo para asegurar que las mediciones de los conteos de CD4 sean válidas y para ayudar en las decisiones de tratamiento.

En la siguiente etapa del desarrollo, el ensayo en microplaca se transformará en una tecnología de tira reactiva, lo que permitirá realizar pruebas sin necesidad de instrumentos ni electricidad. Es poco probable que el VIH se transmita a través de la saliva, pero los pacientes con VIH a menudo presentan otras enfermedades infecciosas como tuberculosis y hepatitis C; por ello, no olvide que trabajar con saliva, al igual que con sangre, puede ser extremadamente peligroso debido a partículas infecciosas desconocidas. Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y otros equipos de protección personal, durante la realización de este procedimiento.