El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Hola y bienvenidos al Grupo de Biología Estructural y Funcional de Membranas. Mi nombre es Martin Caffery. Este es otro artículo de una serie de JO sobre la cristalización de proteínas de membrana para la determinación estructural mediante el método en meso o en fase cúbica lípida.

En el primer artículo, JoVE 1 7 1 2, demostramos cómo se prepara la fase cúbica cargada con proteínas y cómo se dispensa manualmente la fase viscosa y pegajosa de misa en placas de vidrio tipo sándwich para ensayos de cristalización. Este artículo en video describirá métodos para utilizar un robot de cristalización en meso. Un robot ofrece las ventajas de velocidad, exactitud, precisión, miniaturización y la capacidad de trabajar durante períodos prolongados en condiciones incómodas, como en la oscuridad o a bajas temperaturas.

Cuando se utilizan adecuadamente, los robots pueden mejorar considerablemente la productividad en la investigación de la estructura y función de proteínas de membrana. En este artículo en video, demostramos el uso de tres robots disponibles comercialmente. El primer robot fue desarrollado en el grupo de biología estructural y funcional de membranas, y se describe en detalle en la referencia uno.

Los otros dos recientemente han estado disponibles y se incluyen aquí por completitud. Preparar la placa de cristalización configurando un ensayo de cristalización de forma robótica comienza por preparar la placa base del dispositivo de cristalización de doble vidrio descrito en detalle; en referencia a la placa base, primero debe silanizarse y debe aplicarse a la placa el espaciador perforado de doble cara que crea los pozos. Los materiales necesarios para esto se muestran aquí.

Incluyen una placa base de cristalización de vidrio, un espaciador adhesivo doble perforado, solución de inmersión, un rodillo o barrena, papeles absorbentes y un vaso de precipitados con agua UE. La placa se coloca sobre una toalla de papel en la superficie de un banco de laboratorio. Se aplican unas gotas de solución silente y luego se distribuyen uniformemente sobre la superficie de la placa con un papel absorbente.

Se elimina la solución de silanización en exceso del plato sumergiéndolo completamente en un vaso de precipitados con agua. El plato se retira del vaso de precipitados y se coloca sobre una toalla de papel seca, con el lado silanizado hacia arriba, y su superficie expuesta se seca limpiando suavemente con toallas de papel.

A continuación, se retira la cubierta protectora del espaciador perforado de doble cara y se aplica el espaciador sobre la superficie silanizada de la placa de vidrio. Es importante colocar correctamente el espaciador sobre la placa base, haciendo coincidir la esquina superior izquierda y los dos lados adyacentes del espaciador con los de la placa. Se utiliza un rodillo o cubeta para alisar el espaciador sobre la placa base y crear un sello hermético entre ambos.

Entre paréntesis, señalamos que las placas con silos, completas con espaciadores perforados, están disponibles comercialmente, como se describe en la sección de referencias. Tras preparar la placa base para cristalización, pasamos a continuación a configurar y utilizar el robot in meso. Como se indica a continuación, demostramos el uso de tres robots in meso.

En todos los casos mostrados, los robots se configuran y utilizan en una habitación con temperatura controlada ajustada a 20 grados Celsius en meso robot uno, el primero de los robots meso que se demuestra en este video. El artículo fue desarrollado en el laboratorio del investigador principal y ahora está disponible comercialmente. Se pueden encontrar detalles completos en la sección de referencias.

Los materiales y el equipo necesarios para configurar un ensayo de cristalización de forma robótica se muestran aquí. Incluyen un cuaderno de laboratorio, una muestra cargada con proteína, recién preparada según se describe en JoVE Artículo 1 7 1 2 y alojada en una jeringa Hamilton. Placas base silanizadas con espaciadores y cubreobjetos correspondientes, botella de agua y toallas de papel, y el robot In Miso.

La primera vista muestra al robot con su plataforma limpia. La siguiente vista muestra al robot completo con la estación de estacionamiento del humidificador, la placa base para cristalización y el bloque de pocillos profundos que contiene las soluciones de precipitante. Comenzamos la configuración colocando la placa base sobre la plataforma del robot.

Tiene su propia plataforma, claramente marcada con posiciones de pozos para fines de alineación de la placa base. La placa debe etiquetarse de forma clara para propósitos de identificación. El bloque de 96 pozos que contiene las soluciones precipitantes se fija en su propia plataforma sobre la plataforma del robot, junto a la placa de cristalización.

El bloque se abre retirando cuidadosamente su tapa superior de plástico. La corriente de humedad del humidificador se dirige para que fluya sobre y a través de la placa base en la plataforma del robot al configurar el robot. El robot se inicializa siguiendo las instrucciones del fabricante.

No demostraremos esto en detalle aquí porque los protocolos exactos cambiarán con el tiempo. Esencialmente, lo que ocurre durante la inicialización es que se proporcionan al brazo dispensador de mease del robot posiciones de referencia en tres direcciones ortogonales, x, Y y Z. A continuación, se fija al brazo uno del robot una jeringa Hamilton con la fase de meza cargada de proteína, completa con aguja dispensadora; los detalles completos sobre cómo preparar la fase de meza y la jeringa se describen en el artículo 1 7 1 2 de JoVE y en la referencia uno. Ahora, la punta de la aguja de la jeringa dispensadora debe alinearse con la parte inferior y el centro del pocillo superior situado en la esquina izquierda de la placa de cristalización. Esto corresponde al identificador del pocillo A uno, alineándose primero con la parte inferior del pocillo A uno como primer paso.

Esto se realiza ajustando la altura o la coordenada Z del brazo dispensador mientras se observa qué tan cerca llega la punta de la aguja al fondo del pocillo. Que la punta apenas toque el fondo del pocillo puede evaluarse moviendo manualmente la placa de un lado a otro sobre la plataforma, al mismo tiempo que se ajusta ligeramente la altura del brazo dispensador; la coordenada Z del brazo dispensador en el punto donde la punta toca la placa se introduce en la computadora. La dispensación se programa para realizarse con la punta de la aguja situada a varios micrómetros de esta posición Z de referencia, que corresponde a la superficie de la placa base. A continuación, se activa el robot para que realice una serie de pasos indicados por el usuario con el fin de posicionar la punta de la aguja en el centro del pocillo A1.

La coordenada de referencia XY del brazo dispensador, donde se centra la punta, se almacena en la computadora que controla el robot. Se utiliza para definir el centro de los demás pozos en la placa. Tras establecer estas coordenadas de referencia en la computadora, se le indica al brazo dispensador mease que regrese a su posición inicial, cebando la jeringa.

La jeringa de dispensación debe purgarse ahora. Esto se hace para asegurar que la enzima fresca llene la aguja de dispensación y que el primer pocillo de la placa reciba su cantidad completa de enzima. Existe un comando de purgado en el programa que activa al robot.

Hace que el émbolo de la jeringa avance paso a paso bajo el control del usuario. Mientras esto ocurre, se examina la punta de la aguja para verificar la aparición de mease extruida; la fase meza se elimina con un tejido. Esto completa el proceso de cebado del robot.

El robot ya está listo para funcionar en modo automático iniciando la corrida. El programa XAP del robot inicia una serie de pasos de lavado en los que se limpian las puntas dispensadoras de precipitante ubicadas en el brazo dos del robot y se preparan para aspirar soluciones de precipitante desde el bloque de pocillos profundos; activar la función de dispensación en el robot pone en marcha la carga secuencial de los pocillos con mease cargado de proteína, primero ocho pocillos a la vez, seguido de soluciones de precipitante entre cada entrega. El brazo dispensador de mease regresa a una posición de estacionamiento en la que el extremo de la aguja se coloca en una esponja humedecida para evitar que el mease en la punta se seque.

Lo más común es que los valores utilizados en los ensayos de cristalización realizados en el grupo de biología estructural y funcional sean 50 nanolitros de mease y 800 nanolitros de solución precipitante. El programa que controla el robot en esta demostración se ha configurado de modo que ambos brazos se muevan simultáneamente.

De este modo, es posible completar la carga de una placa de 96 pocillos con el agente precipitante y el tampón en cinco minutos. Inmediatamente después de que la placa se llena, los brazos robóticos regresan a sus posiciones de reposo. Se retira la placa de la plataforma del robot y se coloca sobre una superficie sólida y plana.

Se coloca suavemente un cubreobjetos sobre la placa base, en contacto con la superficie adhesiva superior del espaciador. Es importante asegurarse de que los 96 pocillos estén completamente cubiertos, de que el cubreobjetos esté alineado cuadradamente con la placa base y de que ninguna parte del cubreobjetos sobresalga del perímetro de la placa base. Se utiliza un rodillo o una plancha para crear un sello firme y uniforme entre el cubreobjetos y el espaciador.

En esta etapa, se debe inspeccionar la placa para asegurarse de que el montaje se haya realizado correctamente. Lo que se busca es una apariencia similar a un huevo frito en una sartén. En cada pocillo, la yema del huevo corresponde a la fase meza.

La clara del huevo es la solución precipitante, y el borde de la sartén es el perímetro de la cristalización. Bueno, idealmente, los tres son concéntricos. Ahora la placa está lista para colocarse en un área de almacenamiento con temperatura controlada para el crecimiento de cristales.

Si no se van a preparar más placas, el bloque de precipitante debe retirarse de la plataforma del robot, sellarse adecuadamente y devolverse al almacenamiento. La jeringa que contiene el mease se retira del brazo dispensador del robot, desmontando sus distintas piezas, incluyendo la aguja dispensadora y el ferial. Se lava cuidadosamente con metanol y se seca para prepararla para el próximo uso en el robot In Meso con dos mosquito LCP.

Este siguiente clip muestra el robot LCP para mosquitos que puede utilizarse en el montaje de ensayos de cristalización en mesofase. Incorpora un sistema de dispensación de fase similar al descrito previamente en este artículo. Sin embargo, para el robot uno, el precipitante se dispensa utilizando puntas desechables.

El instrumento en sí se muestra aquí. Incluye una plataforma sobre la cual se colocan la placa de cristalización y el bloque de precipitante, y una cámara con ventanas para el control de la humedad. En esta vista, las ventanas de la cámara de humedad han sido abiertas, así como un carrete con puntas de dispensación, un brazo dispensador de mease, y un sensor basado en láser para establecer la ubicación de la aguja dispensadora de la fase meph.

Una plataforma elevada sobre la cual se coloca la placa de cristalización y una plataforma hundida para sujetar el bloque de solución precipitante. En esta secuencia, el robot ha ejecutado una serie de acciones de inicialización al encenderse el instrumento. Se utiliza un software de programación para configurar el instrumento para trabajar con placas de cristalización y bloques de precipitante específicos, y para dispensar volúmenes determinados de enzima y precipitante en una secuencia especificada.

Dichos detalles son proporcionados por el fabricante y no se mostrarán aquí. El uso del robot para preparar una placa de cristalización comienza de la siguiente manera: se prepara una jeringa Hamilton completa con aguja y llena con la mezcla cargada de proteína según se describió anteriormente en el protocolo del robot in meso uno y en JoVE 1 7 1 2. La jeringa se sujeta en posición debajo del brazo dispensador del robot.

Las coordenadas X e Y de la aguja en la jeringa de dispensación se establecen utilizando el sensor láser montado en la base. Este es un paso importante que se requiere para asegurar que la mease se dispense con precisión en el centro de cada pocillo de la placa de cristalización. Con solo tocar un botón en el panel de control, se prepara la jeringa para expulsar la mease desde la punta de la aguja.

El exceso de masa se retira luego con un tejido, en preparación para usar el robot que cargará los pocillos antes de montar la placa de cristalización sobre la plataforma del robot. La superficie de la plataforma se humedece con unas gotas de agua para mantener la placa en su lugar. Por capilaridad, se retira la cubierta protectora de la placa y se coloca firmemente sobre su plataforma para asegurar una buena adherencia.

Hay tres puntos de referencia en la plataforma sobre los cuales están centrados los pozos de las esquinas para garantizar una colocación adecuada de la placa con respecto a la punta de la aguja dispensadora; ahora el instrumento está listo para iniciar un ciclo de configuración. Este proceso comienza con un segundo paso de cebado, en el que se dispensa mease sobre una pequeña placa de vidrio, inmediatamente antes de pasar a cargar la placa con mease fresco. En esta secuencia, se observa cómo el robot primero carga mease en una columna vertical de ocho pozos de la placa, y luego utiliza las puntas desechables para dispensar la solución precipitante encima del bolo de mease.

Este proceso se repite 11 veces a lo largo de la longitud de la placa hasta que todos los pocillos están llenos. El proceso completo tarda aproximadamente cinco minutos en completarse. En este video en particular, se dispensaron 50 nanolitros de Mease y 800 nanolitros de solución precipitante en cada pocillo.

La placa llena se retira de la plataforma del robot colocada sobre una mesa. Se aplica el cubreobjetos y la placa se sella con un sujetador como se describió anteriormente en el robot Miso uno. La placa debidamente etiquetada ya puede colocarse en un ambiente controlado por temperatura para el crecimiento de cristales en el robot Meso tres, el LCP Griffin.

Este último clip de video muestra al robot Griffin LCP en uso mientras configura ensayos de cristalización en mesofase. El Griffin incorpora un sistema de dispensación de fase Meph similar al descrito anteriormente para el robot uno. En este caso, sin embargo, se dispensan simultáneamente las 96 soluciones de precipitante.

El instrumento en sí se muestra aquí. Incluye una plataforma sobre la cual se colocan la placa de cristalización y el bloque de precipitante, un brazo dispensador de mease y una cabeza de puntas Phoenix 96. Para dispensar soluciones de precipitante, el robot en funcionamiento se muestra en esta secuencia final de video.

Primero, se carga la cabeza de 96 puntas con la solución precipitante. Se proporciona un retraso definido por el usuario para facilitar la aspiración de precipitantes viscosos. La fase de MEA se dispensa secuencialmente en los 96 pozos en un proceso que tarda aproximadamente un minuto en completarse.

Por último, la cabeza de 96 puntas dispensa simultáneamente las 96 soluciones de precipitante encima de las bolitas de fase MEA en los pozos de cristalización. Todo el proceso de carga de la placa se completa en dos minutos. La placa llena se retira del soporte del robot, se sella con un cubreobjetos y se coloca en almacenamiento bajo condiciones controladas de temperatura para el crecimiento de cristales.

Los siguientes pasos en el proceso general de determinación estructural mediante cristalografía macromolecular consisten en cosechar y enfriar criogénicamente los cristales, así como registrar y procesar la difracción de rayos X proveniente de ellos. Estos temas se tratan en artículos de trabajo separados en esta serie.I.