El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Hola y bienvenidos al Grupo de Biología Estructural y Funcional de Membranas. Mi nombre es Martin Caffery. Este es otro de una serie de artículos sobre la cristalización de proteínas de membrana para la determinación estructurada utilizando el método de fase cúbica in meso o lípica.

En el primer artículo, JoVE 1 7 1 2, demostramos cómo se prepara la fase cúbica cargada de proteínas y cómo la fase misa viscosa y pegajosa se dispensa manualmente en placas sándwich de vidrio para ensayos de cristalización. Este artículo de video describirá los métodos para usar un robot de cristalización in meso. Un robot ofrece las ventajas de la velocidad, la exactitud, la miniaturización de precisión y la capacidad de trabajar durante períodos prolongados en condiciones incómodas, como en la oscuridad o a bajas temperaturas.

Los robots, cuando se usan correctamente, pueden mejorar en gran medida la productividad de la investigación de la estructura y función de las proteínas de membrana. En este artículo de vídeo, demostramos el uso de tres robots disponibles en el mercado. El primer robot se desarrolló en el grupo de biología estructural y funcional de membranas, y se describe en detalle en la referencia uno.

Los otros dos están disponibles recientemente y se incluyen aquí para completarlos. La preparación de la placa de cristalización, la configuración para realizar una prueba de cristalización de forma robótica comienza con la preparación de la placa base de la placa de cristalización sándwich de vidrio descrita en detalle en referencia a la placa base, primero se debe aislar y el espaciador de doble varilla perforado que crea los pocillos debe aplicarse a la placa. Aquí se muestran los materiales necesarios para ello.

Incluyen una placa base de cristalización de vidrio, una solución espaciadora perforada de doble varilla, un rodillo o pañuelos de papel brayer y un vaso de precipitados de agua UE. El plato se coloca sobre una toalla de papel sobre una mesa de trabajo. Se aplican unas gotas de solución silenciosa y luego se distribuyen uniformemente sobre la superficie de la placa con un pañuelo de papel.

La placa se lava para eliminar el exceso de solución sumergiéndola completamente en un vaso de precipitados con agua. El plato se retira del vaso de precipitados y se coloca sobre una toalla de papel seca. Con el lado silizado hacia arriba y su superficie expuesta se seca limpiando ligeramente con toallas de papel.

A continuación, se retira la cubierta protectora del espaciador de doble varilla perforado y se aplica el espaciador a la superficie aislada de la placa de vidrio. Es importante que el espaciador esté colocado correctamente en la placa base con la esquina superior izquierda y los dos lados adyacentes del espaciador y la placa coincidentes. Se utiliza un rodillo o brayer para aplanar el espaciador en la placa base y crear un sello hermético entre ellos.

Entre paréntesis, observamos que las placas aisladas completas con espaciadores perforados están disponibles comercialmente como se describe en la sección de referencia. Una vez preparada la placa base de cristalización, pasamos a la configuración y al uso del robot in meso. Como se observa a continuación, demostramos el uso de tres en robots meso.

En todos los casos mostrados, los robots se configuran y utilizan en una sala con temperatura controlada a 20 grados centígrados en el meso robot one, el primer robot en meso que se muestra en este vídeo. El artículo fue desarrollado en el laboratorio del IP y ahora está disponible comercialmente. Los detalles completos se pueden encontrar en la sección de referencias.

Aquí se muestran los materiales y el equipo necesarios para configurar un ensayo de cristalización de forma robótica. Incluyen un cuaderno de laboratorio, un cuaderno cargado de proteínas, recién preparado como se describe en el artículo 1 7 1 2 y alojado en una jeringa Hamilton. Placas base silosizadas con espaciadores y cubreobjetos a juego, botella de agua y pañuelos desechables, y el robot in miso.

La primera vista es del robot con la cubierta despejada. La siguiente vista es del robot completo con estación de parque humidificador, placa base de cristalización y bloque de pozo profundo que contiene soluciones precipitantes. Comenzamos la configuración colocando la placa base en la cubierta del robot.

Tiene su propia plataforma, claramente marcada con posiciones de pozo para fines de alineación de la placa base. La placa debe estar claramente etiquetada para fines de identificación. El bloque de 96 pocillos que contiene soluciones precipitantes está asegurado en su propia plataforma en la cubierta del robot junto a la placa de cristalización.

El bloque se abre despegando con cuidado la tapa de plástico del techo. El flujo de humedad del humidificador se dirige a fluir sobre y a través de la placa base en la cubierta del robot Configuración del robot. El robot se inicializa siguiendo las instrucciones del fabricante.

No demostraremos esto en detalle aquí porque los protocolos exactos cambiarán con el tiempo. Esencialmente, lo que sucede durante la inicialización es que el brazo dispensador de masa en el robot está provisto de posiciones de referencia en tres direcciones ortogonales, x, Y y Z. A continuación, la fase meza cargada de proteínas en una jeringa Hamilton completa con aguja dispensadora se conecta al brazo uno de los robots Los detalles completos de cómo preparar la fase meza y la jeringa se describen en Jo del Artículo 1 7 1 2 y en la referencia uno, La punta de la aguja de la jeringa dispensadora ahora debe estar alineada con la parte inferior y el centro del pocillo superior en la esquina izquierda de la placa de cristalización. Esto corresponde al identificador de pozo A uno que se alinea con la parte inferior del pozo A uno como el primer orden del día.

Esto se hace ajustando la altura o la coordenada Z después de dispensar el brazo mientras observo qué tan cerca está la punta de la aguja del fondo del pozo. El hecho de que la punta esté tocando el fondo del pocillo se puede juzgar moviendo la placa con la mano de un lado a otro en la plataforma mientras se ajusta ligeramente la altura del brazo dispensador, la coordenada Z del brazo dispensador donde la punta entra en contacto con la placa se ingresa a la computadora de dispensación está programada para tener lugar con la punta de la aguja a varios micrómetros de esta posición Z de referencia, que corresponde a la superficie de la placa base. A continuación, el robot se activa para seguir una serie de pasos indicados por el usuario para colocar la punta de la aguja en el centro del pozo A uno.

La coordenada XY de referencia del brazo dispensador donde se centra la punta se almacena en el ordenador que controla el robot. Se utiliza para definir el centro de los pozos restantes en la placa. Una vez establecidas estas coordenadas de referencia en el ordenador, se indica al brazo dispensador de ayuda que vuelva a su posición inicial, cebando la jeringa.

Ahora se debe cebar la jeringa dispensadora. Esto se hace para garantizar que la guasia fresca llene la aguja dispensadora y que el primer pocillo del plato reciba su complemento completo de gala. Hay un comando de cebado en el programa que ejecuta la activación del robot.

Hace que el émbolo de la jeringa avance escalonadamente bajo el control del usuario. Mientras esto sucede, se examina la punta de la aguja para que aparezca la fase de meza extruida y se retira con un pañuelo. Esto completa el proceso de cebado que ejecuta el robot.

El robot ahora está listo para funcionar en modo automático iniciando la carrera. El programa Robot XAP inicia una ronda de pasos de lavado donde las puntas de dispensación de precipitante en el brazo dos del robot se lavan y se preparan para aspirar soluciones precipitantes desde el bloque de pozo profundo activando la función de dispensación en el robot pone en movimiento, la carga secuencial de pozos con semillas cargadas de proteínas mase primeros ocho pozos a la vez, seguido de soluciones precipitantes entre entregas. El brazo dispensador de mica vuelve a una posición de estacionamiento en la que el extremo de la aguja se coloca en una esponja humedecida para evitar que la goma de la punta se seque.

Más comúnmente, los valores utilizados en los ensayos de cristalización realizados en la membrana. El grupo de biología estructural y funcional está compuesto por 50 nanolitros de mosa y 800 nanolitros de solución precipitante. El programa que ejecuta el robot en esta demostración se ha configurado para que los dos brazos se muevan simultáneamente.

De esta manera, es posible completar la carga de una placa de 96 pocillos con masa y precipitante en cinco minutos. Inmediatamente, la placa se llena y los brazos del robot vuelven a sus posiciones de estacionamiento. La placa se retira de la cubierta del robot y se coloca sobre una superficie sólida plana.

Se coloca suavemente un cubreobjetos sobre la placa base en contacto con la superficie pegajosa superior del espaciador. Es importante asegurarse de que los 96 pocillos estén completamente cubiertos, que el vidrio de cobertura esté alineado en escuadra con la placa base y que ninguno de los vidrios de cobertura se extienda más allá de la huella de la placa base. Se utiliza un rodillo o brayer para crear un sello hermético y uniforme entre el vidrio de cobertura y el espaciador.

La placa debe inspeccionarse en esta etapa para asegurarse de que la configuración haya salido como debería. Lo que uno está buscando es un huevo frito en una sartén. En cada pocillo, la yuga del huevo corresponde a la fase meza.

La clara del huevo es la solución precipitante, y el borde de la sartén es el perímetro de la cristalización. Bueno, idealmente, los tres son concéntricos. La placa ahora está lista para ser colocada en un área de almacenamiento con temperatura controlada para el crecimiento de cristales.

Si no se van a instalar más placas, el bloque de precipitante debe retirarse de la cubierta del robot, sellarse adecuadamente y volver a almacenarse. La jeringa que contiene la malasa se retira del brazo dispensador del robot, se desmontan sus diversas partes, incluida la aguja dispensadora y el ferial. Lavado cuidadosamente con metanol y secado en preparación para el próximo uso en Meso robot dos mosquitos LCP.

El siguiente clip de vídeo muestra el robot mosquito LCP que se puede utilizar en la configuración de ensayos de cristalización in meso. Incorpora un sistema de dispensación de fase meph similar al descrito anteriormente en este artículo. Sin embargo, para el robot uno, el precipitante se dispensa con puntas desechables.

Aquí se muestra el instrumento en sí. Incluye una cubierta sobre la que la placa de cristalización y el bloque precipitante colocan una cámara acristalada para el control de la humedad. En esta vista, se han abierto las ventanas de la cámara de humedad, un carrete con puntas dispensadoras, un brazo dispensador de mosaca, un sensor basado en láser para establecer la ubicación de la aguja dispensadora de fase meph.

Una plataforma elevada sobre la que se asienta la placa de cristalización, una plataforma hundida para sostener el bloque de criba precipitante. En esta secuencia, el robot ha visto pasar por una secuencia de acciones de inicialización cuando se enciende el instrumento. El software de programación se utiliza para configurar el instrumento para trabajar con placas de cristalización particulares y bloques de precipitante, y para dispensar volúmenes establecidos de masa y precipitante en una secuencia específica.

Dichos detalles son proporcionados por el fabricante y no se mostrarán aquí. El uso del robot para configurar una placa de cristalización comienza de la siguiente manera, una jeringa Hamilton completa con aguja y llena de maíz cargada de proteínas se prepara como se describe anteriormente en meso robot uno y en Jo de 1 7 1 2. La jeringa se sujeta en su posición debajo del brazo dispensador del robot.

Las coordenadas X e y de la aguja en la jeringa dispensadora se establecen utilizando el sensor láser montado en la plataforma. Este es un paso importante que se requiere para garantizar que la micasa se dispense con precisión en el centro de cada pocillo en la placa de cristalización. Con solo tocar un botón en el panel de control, la jeringa está preparada para expulsar la micción de la punta de la aguja.

A continuación, se retira la masa extruida con un pañuelo de papel en preparación para el uso del robot para cargar pozos antes de montar la placa de cristalización en la cubierta del robot. La superficie de la plataforma se humedece con unas gotas de agua para mantener la placa en su lugar. Por capilaridad, la cubierta protectora se retira de la placa y la placa se coloca firmemente en su plataforma para garantizar una buena adherencia.

Hay tres fiduciales en la plataforma sobre los que se centran los tres pozos de las esquinas pronto para garantizar la colocación adecuada de la placa con respecto a la punta de la aguja dispensadora, el instrumento ahora está listo para entrar en un ciclo de configuración. Esto comienza con un segundo paso de cebado en el que Mease se dispensa en una pequeña placa de vidrio inmediatamente antes de pasar a cargar la placa con mease. En esta secuencia, vemos que el robot primero carga con mease, una columna vertical de ocho pocillos en la placa, y luego usa las puntas desechables para dispensar la solución precipitante sobre el bolo de mease.

Este proceso se repite 11 veces a lo largo de la placa hasta que se llenan todos los pocillos. Todo el proceso tarda unos cinco minutos en completarse. En este video en particular, se dispensaron 50 nanolitros de Mease y 800 nanolitros de solución precipitante en cada pocillo.

La placa llena se retira de la plataforma del robot colocado en un banco. Se aplica el cubreobjetos y la placa se sella con un sujetador como se describe anteriormente en el robot miso uno. La placa correctamente etiquetada ahora se puede colocar en un entorno de temperatura controlada para el crecimiento de cristales en el robot Meso tres, el Griffin LCP.

Este último clip de vídeo muestra el robot Griffin LCP en uso en pruebas de meso cristalización. El Griffin incorpora un sistema de dispensación de fase meph similar al descrito anteriormente para el robot uno. En este caso, sin embargo, las 96 soluciones precipitantes se dispensan simultáneamente.

Aquí se muestra el instrumento en sí. Incluye una cubierta sobre la que se asientan la placa de cristalización y el bloque precipitante, un brazo dispensador de mosca y un cabezal de punta Phoenix 96. Para dispensar soluciones precipitantes, el robot en acción se muestra en esta secuencia de video final.

La cabeza de la punta 96 se carga primero con solución precipitante. Se proporciona un retardo definido por el usuario para facilitar la aspiración de precipitantes viscosos. La fase MEA se dispensa secuencialmente en los 96 pocillos en un proceso que tarda aproximadamente un minuto en completarse.

Por último, el cabezal de punta 96 dispensa las 96 soluciones precipitantes simultáneamente sobre los bolos de fase MEA en los pozos de cristalización. Todo el proceso de carga de placas se completa en dos minutos. La placa llena se retira de la cubierta del robot y la placa se sella con un cubreobjetos y se almacena en condiciones de temperatura controlada para el crecimiento de cristales.

Los siguientes pasos en el proceso general de determinación estructurada por cristalografía macromolecular son recolectar y enfriar los cristales, y registrar y procesar la difracción de rayos X a partir de ellos. Estos temas se tratan en artículos de trabajo separados en esta serie.I.