De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado In situ La hibridación

El objetivo general de este procedimiento es mapear las sondas de ADN a los cromosomas de politeno de mosquitos utilizando una preparación de cromosomas de alta presión, seguida de hibridación fluorescente automatizada en C dos e imágenes automatizadas. Esto se logra preparando primero las tiras de cromosomas de politeno utilizando un método de alta presión. El siguiente paso del procedimiento es preparar sondas fluorescentes mediante el marcaje del ADN genómico retroactivo con el fluorocromo utilizando un protocolo de traducción de Nick.

El tercer paso es realizar la hibridación fluorescente en C dos utilizando sistemas automatizados de tinción de portaobjetos. El paso final es escanear y fotografiar los cromosomas marcados utilizando un sistema automático de imágenes fluorescentes. En última instancia, las imágenes pueden mostrar la localización de una sonda de ADN marcada con fluorescencia en el policromosoma.

La principal ventaja de esta técnica o de los métodos existentes, como un protocolo de hibridación in situ manual estándar, es que el protocolo de mapeo físico de mayor rendimiento produce resultados más consistentes y reduce drásticamente el tiempo de manipulación. Este protocolo comienza con la disección de las hembras de media gravedad y oly aproximadamente 25 horas después de la alimentación con sangre para recolectar sus ovarios cuando están en la etapa tres de Christopher. En esta etapa, el área transparente con células nodrizas dentro de los folículos debe tener una forma redonda, recoger los ovarios de cinco hembras y fijarlos en 500 microlitros de solución de ruido de automóvil modificada recién hecha.

A continuación, pueden almacenarse a temperatura ambiente durante un máximo de 24 horas o durante más tiempo a menos 20 grados centígrados. A continuación, justo antes de hacer los portaobjetos de disección de ovarios, prepare la solución de ruido del automóvil y el ácido propiónico al 50%. Coloque cada par de ovarios en una gota de solución fresca para ruido de automóvil en un portaobjetos libre de polvo bajo un microscopio de disección.

Divida los ovarios con la aguja de disección. Transfiera todas las piezas del ovario a seis portaobjetos limpios con ácido propiónico al 50%. Separe los folículos entre sí con agujas de disección.

A continuación, limpie los pañuelos restantes con una toalla de papel. Agregue otra gota de ácido propónico al 50% y espere de tres a cinco minutos. La leyenda dice que los folículos se asientan en un 50% de ácido propónico durante tres a cinco minutos y mejora significativamente la propagación de los cromosomas.

A continuación, aplique un cubreobjetos y espere un minuto más para extender los núcleos. Envuelva el portaobjetos con papel de filtro y plástico. Ajuste una Dremel entre tres y 5.000 RPM, y durante aproximadamente un minuto, gire ligeramente una punta de dremel giratoria contra el cubreobjetos.

Confirme la calidad de la propagación con un microscopio de fase y aplique la dremel durante más tiempo si es necesario, para aplanar los cromosomas. Coloque un segundo cubreobjetos adyacente al primero, luego coloque los cubreobjetos con otro microscopio. A continuación, envuelva los portaobjetos con una lámina de plástico y con papel de filtro, coloque los portaobjetos de envoltura en un tornillo de banco para exprimir los portaobjetos entre 85 y 120 libras de pulgada.

Después de aplanar los cromosomas en los seis portaobjetos, desenvuelva los portaobjetos y retire los portaobjetos adicionales para aplanar aún más los cromosomas. Incubar los portaobjetos a 55 grados centígrados durante 10 a 15 minutos en un sistema de hibridación por desnaturalización de portaobjetos. A continuación, sumerja un portaobjetos en nitrógeno líquido durante al menos 15 segundos o hasta que el burbujeo se haya detenido.

A continuación, retire rápidamente el cubreobjetos con una cuchilla de afeitar e inmediatamente coloque el portaobjetos en etanol frío al 50% durante cinco minutos. Repita este proceso para cada diapositiva secuencialmente. Deshidratar los portaobjetos en un baño de etanol al 70%, al 90% y al 100%.

Sumérgelos en cada baño durante cinco minutos. Finalmente, después de que los portaobjetos se sequen al aire, están listos para que los peces se manchen. Un dispositivo automatizado realiza la mayoría de los pasos del procedimiento, excepto el etiquetado de la sonda.

Por lo tanto, antes de cargar el dispositivo, prepare la sonda fluorescente etiquetando el ADN con el fluorocromo utilizando un protocolo de traducción NIC comercial con la sonda preparada, cargue los portaobjetos y los reactivos en los portaobjetos automatizados. Sistema de tinción y programe el sistema para realizar los siguientes pasos. Primero, suministre 800 microlitros de un XPBS durante 20 minutos.

En segundo lugar, seca las diapositivas. En tercer lugar, fije los portaobjetos con 450 microlitros de formalina al 4% en un XPBS durante un minuto. A continuación, lave los portaobjetos con etanol al 100% durante un segundo, dos y dos minutos.

Una vez después del baño de etanol, vuelva a secar los portaobjetos. Ahora calienta los portaobjetos a 45 grados centígrados durante dos minutos para evitar que burbujeen. A continuación, aplique 20 microlitros de la sonda de ADN, seguidos de una gota de aceite mineral y un cubreobjetos a continuación, en la naturaleza, los cromosomas a 90 grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, configure los portaobjetos para que se hibriden a 42 grados centígrados durante 14 horas. Después de la hibridación, el fraguado de rigurosidad se lava durante dos minutos a 42 grados centígrados, seguido de cuatro aplicaciones consecutivas de un segundo de dos XSSC y secado. A continuación, aplique 800 microlitros de 0,4 XSSC a 42 grados centígrados durante 10 minutos dos veces, seguido de un lavado más y dos XSSC a 25 grados centígrados durante 10 minutos.

Ahora aplica la mancha 50 microlitros de yo-yo uno seguido de aceite mineral y cubre los cubreobjetos. Incuba los portaobjetos a 25 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, retire los cubreobjetos.

Lave los portaobjetos en dos XSSC cuatro veces durante un segundo por lavado y seque los portaobjetos con un soplador. Por último, aplique 15 microlitros de reactivo antidecoloración de oro prolongado en cada portaobjetos y coloque nuevos cubreobjetos. Encienda el sistema de escaneo automatizado Accord plus, comenzando con la fuente de alimentación Olympus U-R-F-L-T para una bombilla halógena.

Luego la computadora y, por último, el microscopio con un accesorio de cámara. Ahora abra primero el paquete de software dúo, configure un escaneo previo de 10 veces. Haga clic en el botón en línea, ingrese un nuevo ID de caso y asigne un ID de diapositiva.

Haga clic en el punto etiquetado como bf. Esta es la opción de campo claro. Seleccione una opción de escaneo para 10 veces el escaneo previo.

Seleccione 2.500 x círculo, 10.000 x círculo o rectángulo. Haga clic en establecer y ejecutar. Y luego, está bien, siga las instrucciones para ajustar el escaneo correctamente y luego haga clic en finalizar.

Para iniciar el escaneo, presione la pestaña principal para volver a la pantalla principal. Ahora haga clic en el botón fuera de línea, busque el ID del caso y el ID de la diapositiva que se asignó. Y haga clic en sin conexión.

Escanee en el cuadro negro en el área superior izquierda. Haga clic en una flecha y seleccione 10 x pre-escaneo. Utilice las flechas para recorrer las imágenes escaneadas después de encontrar una imagen de interés.

Haga doble clic en la pantalla en el centro de la región objetivo y presione snap. Esto apuntará a una imagen para capturarla más adelante después de seleccionar todos los objetivos. Haga clic con el botón derecho en cada imagen, haga clic en clasificar, seleccione 10 x pre-escaneo y seleccione polytan.

Regrese al menú principal y configure el escaneo previo de 40x. Vuelva a seleccionar en línea y seleccione una diapositiva. Cambie BF a ffl y cambie el nombre de la tarea a revisit dash X 40 dash rg.

Cambie la sección justo debajo de la última configuración para volver a visitar el guión todo. A continuación, ejecute el programa y siga las indicaciones. Para configurar la automatización, haga clic en el botón Iniciar coincidencia de vistas para que coincidan con imágenes de 10x y 40x.

Haga clic en finalizar para iniciar el escaneo. Una vez hecho esto, haz clic en clasificar y mira las imágenes. Las preparaciones de cromosomas politanos de células nodrizas ováricas de la anomalía femenina de Gambia se realizaron utilizando la técnica de alta presión.

Este método no daña ni cambia la mayor parte de la estructura cromosómica. Aplana los cromosomas doblados y, por lo tanto, revela bandas finas ocultas que no se ven en las preparaciones regulares. El cromosoma se sondeó con clones de ADN retrospectivo obtenidos de la anomalía S Gambia y Tam back library.

La biblioteca se generó a partir de machos y hembras primero en larva estrella de la cepa de plaga S Gambia anomalía. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar un mapeo físico automatizado de alto rendimiento para facilitar el rápido desarrollo de ensamblajes de genomas basados en cromosomas.