Name: De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado In situ La hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a mapear sondas de ADN en cromosomas politén de mosquitos mediante preparación de alta presión e hibridación in situ automatizada. Este protocolo de alto rendimiento mejora la eficiencia y consistencia del mapeo físico cromosómico.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención del National Institutes of Health 1R21AI094289 otorgada a Igor V. Sharakhov. El Sistema Automatizado de Tinción de Portaobjetos Xmatrx y el Sistema de Escaneo Automatizado ACCORD PLUS fueron adquiridos con la ayuda del programa Equipment Trust Fund, del Instituto de Ciencias de la Vida Fralin, del Departamento de Entomología y del Departamento de Bioquímica de Virginia Tech.

1. Preparación de cromosomas politénicos de alta presión a partir de células nodrizas ováricas
<ol>
	<li>Disecte hembras de Anopheles semigrávidas a las 25 horas posteriores a la alimentación con sangre bajo un microscopio de disección y fije los ovarios en solución de Carnoy modificada fresca con metanol (metanol al 100%: ácido acético glacial, 3:1). En esta etapa, los ovarios se encuentran en la fase III de Christophers, cuando los folículos tienen forma ovalada y una zona transparente con células nodrizas dentro de los folículos tiene forma redonda13. Coloque los ovarios de aproximadamente cinco hembras en 500 μl de solución de Carnoy modificada en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y manténgalos a temperatura ambiente durante 24 horas. Transfiera los ovarios a -20 °C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Prepare la solución de Carnoy modificada con etanol (etanol al 100%: ácido acético glacial, 3:1) y ácido propiónico al 50% justo antes de preparar las preparaciones. Coloque un par de ovarios sobre un portaobjetos libre de polvo en una gota de solución de Carnoy modificada. Divida los ovarios en aproximadamente seis secciones con agujas de disección y colóquelas en gotas de ácido propiónico al 50% sobre portaobjetos limpios bajo un estereomicroscopio Leica MZ6. Utilice un portaobjetos diferente para cada sección.</li>
	<li>Separe los folículos mediante agujas de disección y elimine los tejidos restantes con papel de filtro o toalla de papel bajo un microscopio de disección. Añada una nueva gota de ácido propiónico al 50% sobre los folículos y déjelos reposar durante 3-5 minutos a temperatura ambiente. Coloque un cubreobjetos sobre la gota de ácido propiónico al 50%. Deje reposar la preparación durante aproximadamente 1 minuto.</li>
	<li>Envuelva el portaobjetos con papel de filtro y plástico. Utilizando una herramienta rotativa Dremel 200 con accesorio de eje flexible y punta de plástico blando ajustada entre 3000 y 5000 RPM, exprima los folículos girando la punta en círculos y presionando ligeramente el cubreobjetos para distribuir uniformemente los núcleos. Este paso debe durar aproximadamente 1 minuto. Verifique la calidad de la extensión con un microscopio de contraste de fases Olympus CX41 utilizando un objetivo de 20x.</li>
	<li>Prepare un sándwich colocando un cubreobjetos adicional al lado del cubreobjetos que cubre los cromosomas, y cúbralos con un segundo portaobjetos. Esto reduce la posibilidad de romper el portaobjetos en la morsa. Envuelva las preparaciones con una lámina plástica como la que viene en los estuches de portaobjetos y papel de filtro para mantener el sándwich y proteger el portaobjetos de arañazos causados por la morsa.</li>
	<li>Aplique presión sobre las preparaciones mediante una morsa mecánica. Una presión de 85-120 libras-pulgada es suficiente y se logra utilizando una llave de torque. Este paso es necesario para aplanar los cromosomas lo más posible.</li>
	<li>Retire el segundo portaobjetos y el cubreobjetos adicional. Someta la preparación con el cubreobjetos que cubre los cromosomas a una temperatura de 55 °C en un sistema de desnaturalización/hibridación para portaobjetos durante 10-15 minutos para aplanar aún más los cromosomas. Sumerja la preparación en nitrógeno líquido durante al menos 15 segundos y, cuando cese la ebullición, proceda a retirar rápidamente el cubreobjetos con una cuchilla. Coloque inmediatamente las preparaciones en etanol frío al 50% durante 5 minutos. Deshidrate las preparaciones en etanol al 70%, 90% y 100% durante 5 minutos cada uno. Deje secar al aire las preparaciones.</li>
</ol>
2. FISH utilizando un sistema automatizado de tinción de portaobjetos
El programa se configura con el sistema automatizado de tinción de portaobjetos Xmatrx para realizar los siguientes pasos, excepto la marcación de la sonda. El protocolo detallado de marcación por nick-translation se describe en la documentación proporcionada con la ADN polimerasa de Fermentas.
<ol>
	<li>Antes de la FISH, prepare sondas fluorescentes marcando ADN genómico de BAC con un fluorocromo mediante un protocolo de traducción por mella. Mezcle 1 μg de ADN, 0,05 mM de dATP, dCTP y dGTP no marcados y 0,015 mM de dTTP, 1 μl de dUTP marcado con Cy3 o Cy5, 0,05 mg/ml de BSA, 5 μl de tampón 10x para traducción por mella, 20 unidades de ADN polimerasa I, 0,0012 unidades de DNasa I y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 μl. La relación entre ADN polimerasa I y DNasa I se selecciona empíricamente para obtener sondas con un tamaño entre 300 y 500 pb. Incube la mezcla a 15 °C durante 1 hora.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos y los reactivos en el sistema automatizado de tinción de portaobjetos Xmatrx e inicie el programa para ejecutar los siguientes pasos. Aplique 800 μl de PBS 1x durante 20 min. Sople los portaobjetos con aire. Realice la fijación con formalina aplicando 450 μl de formalina al 4% en PBS 1x durante 1 min, seguido de lavados con etanol al 100% durante 1 segundo dos veces y durante 2 minutos una vez. Sople los portaobjetos con aire.</li>
	<li>Caliente los portaobjetos a 45 °C durante 2 min para evitar la formación de burbujas al aplicar las sondas. Aplique 20 μl de las sondas de ADN, agregue gotas de aceite mineral para evitar la evaporación de la solución de hibridación y coloque una cubierta encima. Desnaturalice los cromosomas y las sondas de ADN calentando los portaobjetos a 90 °C durante 10 min.</li>
	<li>Para la hibridación, incube los portaobjetos a 42 °C durante 14 horas con las cubiertas colocadas. La solución de hibridación consiste en 2x SSC, 100 mM de fosfato de sodio, solución de Denhardt 1x, 100 μg/ml de azida sódica y 10% de sulfato de dextrano en formamida.</li>
	<li>Para los lavados de estrictividad, caliente los portaobjetos a 42 °C durante 2 min, retire las cubiertas, lave los portaobjetos en SSC 2x durante 1 segundo cuatro veces. Sople los portaobjetos con aire. Aplique 800 μl de SSC 0,4x a 42 °C durante 10 min, dos veces. Lave los portaobjetos en SSC 2x a 25 °C durante 10 min.</li>
	<li>Realice la tinción cromosómica aplicando 50 μl de YOYO-1 1 μM en PBS 1x. Aplique gotas de aceite mineral para evitar la evaporación de la solución de tinción, coloque cubiertas y incube a 25 °C durante 10 min. Retire las cubiertas, lave los portaobjetos en SSC 2x durante 1 segundo cuatro veces. Sople los portaobjetos con aire. Aplique 15 μl del reactivo antifade ProLong Gold. Coloque cubiertas.</li>
</ol>
3. Lectura de portaobjetos con un sistema automático de imágenes de fluorescencia
Esta sección detalla el uso del software Duet, que viene incluido de forma estándar con el sistema de escaneo automatizado ACCORD PLUS. Las instrucciones comienzan tras encender los dispositivos en este orden: fuente de alimentación Olympus U-RFL-T para una bombilla de halógeno, ordenador Dell Precision T3500, microscopio Olympus BX61 con una cámara conectada Olympus U-CMAD3.
<ol>
	<li>Para configurar el preescaneo a 10x, abra el software Duet en el sistema de escaneo automatizado ACCORD PLUS. Haga clic en el botón "Online". Ingrese un nuevo ID de caso y asigne un ID de portaobjetos. Haga clic en el punto etiquetado como "BF", que corresponde a la opción de campo claro. Establezca la opción de escaneo en "10x Prescan". Utilice "2500x circle", "10000x circle" o "rectangle". Haga clic en "Set&amp;run" para iniciar el preescaneo a 10x.</li>
	<li>Haga clic en el botón "OK" para ejecutar el preescaneo a 10x. Siga las indicaciones para ajustar correctamente el escaneo. Haga clic en "Finish" para comenzar el escaneo. Presione la pestaña "Main" para regresar a la pantalla principal. Haga clic en el botón "Offline". Busque el ID de caso y el ID de portaobjetos asignados y haga clic en "Offline Scan". En el cuadro negro ubicado en la parte superior izquierda, haga clic en una flecha y seleccione "10x Prescan". Utilice las flechas (&lt; || Δ &gt;, conocidas como botones "atrás", "pausa", "reproducir", "adelante") para revisar las imágenes escaneadas.</li>
	<li>Después de encontrar una imagen de interés, haga doble clic en el centro de la región objetivo sobre la pantalla y presione "Snap". Esto marcará la imagen para su captura posterior. Tras seleccionar todos los objetivos, haga clic en "Classify". Seleccione "10x Prescan". Haga clic derecho sobre una imagen para tener la opción de clasificarla. Seleccione "Polytene".</li>
	<li>Configure el preescaneo a 40x en el software Duet. Haga clic en "Main" para regresar al menú principal. Seleccione nuevamente "Online". Seleccione un portaobjetos. Cambie "BF" a "FL". Modifique el nombre de la tarea a "Revisit-X40-RG". Cambie la sección justo debajo de la última configuración a "Revisit-ALL". Haga clic en "Set&amp;Run". Presione "OK". Siga nuevamente las indicaciones para configurar la automatización. Haga clic en el botón "Start matching views" para hacer coincidir las imágenes a 10x y 40x. Haga clic en "Finish" para comenzar el escaneo. Una vez finalizado, haga clic en "Classify" y examine las imágenes.</li>
</ol>
4. Resultados representativos
Figura 1 muestra gráficamente el esquema de la preparación de cromosomas a alta presión. Este paso incluye el proceso de aplastar y aplanar los cromosomas utilizando una herramienta Dremel y una mordaza mecánica, así como la visualización de cromosomas mediante un microscopio de contraste de fases. Figura 2 ilustra la hibridación de una sonda marcada con fluorescencia al ADN diana sobre preparaciones de portaobjetos cromosómicos mediante un sistema automatizado de tinción de portaobjetos, el uso de un microscopio de escaneo automatizado para visualizar y mapear las sondas tras el experimento de FISH, y la colocación y orientación de andamios genómicos sobre los cromosomas.
Se realizaron preparaciones de cromosomas politénicos de células nodrizas ováricas a partir de hembras de An. gambiae utilizando la técnica de alta presión. Este método no daña ni altera la mayor parte de la estructura cromosómica (Figura 3). Aplana los cromosomas doblados y, por lo tanto, revela bandas finas ocultas que no se observan en preparaciones convencionales (Figura 4).
Las sondas utilizadas en este protocolo son clones de ADN BAC genómicos obtenidos de una biblioteca BAC ND-TAM generada a partir del ADN de la cepa PEST de An. gambiae. El ADN genómico para esta biblioteca se extrajo de larvas recién eclosionadas de primer estadio de ambos sexos. Figura 5 muestra los resultados de la hibridación in situ fluorescente (FISH) utilizando clones BAC hibridados con cromosomas politénicos de An. gambiae. Este procedimiento se realizó utilizando el sistema automatizado de tinción de portaobjetos Xmatrx. Mediante un fotomapa citogenético para An. gambiae10, dos clones BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) y BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), se localizaron en las subdivisiones 16C y 16D del brazo 2R, respectivamente. Sin embargo, la búsqueda mediante BLAST contra el ensamblaje AgamP3 de la cepa PEST de An. gambiae14 identificó las secuencias homólogas a 102B24 y 142O19 en las subdivisiones 16B y 17A del brazo 2R, respectivamente (Tabla 1). Por lo tanto, la correspondencia entre las coordenadas genómicas y las subdivisiones citogenéticas puede ajustarse ahora según nuestros datos de mapeo. La búsqueda mediante BLAST contra los ensamblajes genómicos de las formas M y S de An. gambiae reveló que los dos clones BAC se encuentran en contigs diferentes, pero en los mismos scaffolds dentro de cada forma (Tabla 1). Los contigs identificados ahora pueden asociarse con ubicaciones cromosómicas específicas. Además, los scaffolds identificados pueden orientarse adecuadamente dentro de las subdivisiones citológicas 16CD. Curiosamente, las distancias entre las secuencias 102B24 y 142O19 en los scaffolds son de 1.892.981 pb, 1.658.391 pb y 1.688.426 pb en los ensamblajes genómicos de la cepa PEST, la forma M y la forma S, respectivamente. Dado que la cepa PEST es un híbrido entre las formas M y S, esta diferencia probablemente se deba a un ensamblaje incorrecto del genoma PEST.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BAC 
			(acceso)</td>
			<td>cepa PEST 
			AgamP3 
			 
			Coordenadas</td>
			<td>M-forma 
			contigs 
			 
			Coordenadas</td>
			<td>Forma M 
			andamios 
			 
			Coordenadas</td>
			<td>Forma S 
			contigs 
			 
			Coordenadas</td>
			<td>Forma S 
			andamios 
			 
			Coordenadas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372694)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_26 (16B) 
			 
			43,681,342- 
			43,681,874</td>
			<td>ABKP020247 
			53.1 
			 
			32,513- 
			33,045</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			1,858,377- 
			1,858,909</td>
			<td>ABKQ010123 
			32.1 
			 
			4,299- 
			4,832</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			215,891- 
			216,424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372701)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_28 (16B) 
			 
			43,788,213- 
			43,788,969</td>
			<td>ABKP020247 
			51.1 
			 
			24,816- 
			25,575</td>
			<td>EQ090167.1, 
			 
			1,772,683- 
			1,773,442</td>
			<td>ABKQ010123 
			35.1 
			 
			27,782- 
			28,540</td>
			<td>EQ099711.1, 
			 
			305,514- 
			306,272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368698)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			 
			8805_5 (17A) 
			45,428,580- 
			45,429,264</td>
			<td>ABKP020247 
			01.1 
			 
			2,499- 
			3,185</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			315,806- 
			316,492</td>
			<td>ABKQ010123 
			76.1 
			 
			49,242- 
			49,942</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1,791,625- 
			1,792,325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368703)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8805_8 (17A) 
			 
			45,560,099- 
			45,574,323</td>
			<td>ABKP020220 
			17.1 
			 
			30,971- 
			32,469</td>
			<td>EQ090167.1 
			200,518- 
			202,016</td>
			<td>ABKQ010123 
			79.1 
			 
			27,760- 
			28,508</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1,903,569- 
			1,904,317</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Resultados de BLAST de las secuencias de los extremos del BAC contra los ensamblajes del genoma de An. gambiae.
<img alt="Disección de ovarios de mosquito; microscopio estereoscópico; preparación de cromosomas; microscopía de contraste de fases." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Representación esquemática de la preparación de cromosomas a alta presión. Se muestran los ovarios de mosquito en la etapa correcta de desarrollo.
<img alt="Etiquetado de sondas para mapeo cromosómico con hibridación automatizada en portaobjetos y microscopio de escaneo." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Un esquema que representa la FISH automatizada, el escaneo de portaobjetos y el mapeo cromosómico de andamios genómicos.
<img alt="Estructura de cromosomas politénicos, imagen de microscopio, análisis de patrón de bandeo de ADN, investigación genética." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Una extensión del cromosoma politénico 3 de An. gambiae obtenida mediante la técnica de alta presión. 3L y 3R marcan los brazos izquierdo y derecho en sus telómeros. PH e IH indican heterocromatina pericéntrica y heterocromatina intercalar, respectivamente.
<img alt="Imagen microscópica que compara los patrones de bandeo de los cromosomas 3R/3L bajo diferentes presiones." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4. Comparación de cromosomas politénicos de An. gambiae preparados utilizando la técnica tradicional (arriba) y la técnica de alta presión (abajo). Las imágenes abarcan las subdivisiones 29A-30E del brazo 3R (A) y 43D-46D del brazo 3L (B).
<img alt="Mapa cromosómico, marcadores fluorescentes y loci genéticos en un diagrama de cromosomas politénicos de Drosophila." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Hibridación in situ fluorescente (FISH) de clones BAC en cromosomas politénicos de An. gambiae. A) Hibridación del clon 102B24 (señal roja) con el brazo 2R. B) FISH de doble color de 102B24 (señal roja) y 142O19 (señal azul) en las subdivisiones 16C y 16D, respectivamente, del brazo 2R estirado. Las flechas indican las señales de hibridación de los clones BAC marcados con Cy3 (rojo) y Cy5 (azul). C: región centrómerica. a/+ muestra la inversión heterocigota 2La. Los cromosomas fueron contratinjidos con el fluoróforo YOYO-1.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+10K%3A+a+proposal+to+obtain+whole-genome+sequence+for+10%2C000+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hered%22%5BJournal%5D)">Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species.</a> J. Hered. 100, 659-674 (2009).</li>
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<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Drosophila+Polytene+Chromosome+Squashes+for+Antibody+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling.</a> J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).</li>
<li>Vatolina, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Identical+Functional+Organization+of+Nonpolytene+and+Polytene+Chromosomes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

El paso más crítico del procedimiento de alta presión es el aplastamiento adecuado de las células nodrizas ováricas aisladas en la etapa III de Christophers del desarrollo ovárico13. Un aplastamiento inadecuado puede provocar cromosomas insuficientemente extendidos, lo que puede generar problemas al intentar determinar la ubicación de las sondas tras la hibridación fluorescente in situ (FISH). Si los cromosomas se aplastan en exceso, pueden romperse o alargarse hasta el punto de perder los patrones de bandeo. La preparación de múltiples portaobjetos debería conducir a una mayor consistencia al intentar aplastarlos utilizando la herramienta Dremel, lo que aumentará la eficiencia general en la producción de portaobjetos. La técnica de alta presión fue desarrollada inicialmente para glándulas salivales recién aisladas de D. melanogaster9. Sin embargo, los ovarios de mosquitos se conservan rutinariamente en solución fijadora de Carnoy modificada (3 metanol: 1 ácido acético glacial en volumen) antes de utilizarse en preparaciones cromosómicas. Por lo tanto, modificamos el protocolo existente de alta presión para adaptarlo a los cromosomas politénicos de las células nodrizas ováricas fijadas del mosquito de la malaria An. gambiae. Dado que la alta presión se aplica mediante una morsa de precisión que posee una superficie de trabajo altamente paralela sobre todo el portaobjetos, se requiere significativamente menos tiempo para preparar el aplastamiento cromosómico que con la técnica tradicional de golpeteo con la goma de un lápiz.
Otros pasos importantes incluyen remojar suficientemente los folículos en ácido propiónico al 50 % y calentar el portaobjetos. Ambos pasos son esenciales para ayudar a aplanar los cromosomas. Si se omiten, los cromosomas pueden aparecer brillantes tras la deshidratación, lo que podría provocar un exceso de fondo que podría confundirse con una señal en la hibridación in situ fluorescente (FISH). La técnica de aplastamiento a alta presión también funciona bien utilizando las mismas soluciones al preparar cromosomas mitóticos. La extensión y aplanamiento adicionales ayudan a separar mejor los cromosomas de sus núcleos. Aplicar presión uniforme debería aplanarlos adecuadamente, permitiendo realizar mediciones y posiblemente mejorar la resolución de las bandas visibles tras la tinción. Los detalles sobre el aislamiento de cromosomas mitóticos de mosquitos se describen en otra publicación15. Aunque las preparaciones convencionales por aplastamiento son suficientes para muchos fines, incluyendo FISH16 e inmunotinción17, el método de alta presión no solo reduce la variabilidad potencial entre un portaobjetos y otro, sino que también mejora la calidad general de los cromosomas, lo que permite mayor detalle al mapearlos. Este procedimiento también puede utilizarse para preparar portaobjetos con membranas de cromosomas politénicos destinados a microdiseción láser.
Las limitaciones del método de alta presión incluyen la rotura de las láminas y el exceso de estiramiento de los cromosomas. La rotura de la lámina, causada por aplicar demasiada presión sobre ella mediante la morsa, es posible, pero se limita utilizando las presiones indicadas en el artículo. En cuanto al exceso de estiramiento de los cromosomas, si la herramienta Dremel se aplica sobre la lámina durante un período prolongado, existe la posibilidad de que los cromosomas se estiren demasiado y pierdan resolución. Esto puede corregirse aplicando la herramienta durante un breve período, revisando bajo el microscopio y aplicando más tiempo con la herramienta Dremel si los cromosomas no están suficientemente desplegados.
Un protocolo tradicional de FISH incluye una serie de pasos de lavado e incubación, que suelen durar entre 5 y 20 minutos y requieren casi toda la atención del investigador durante toda la duración del experimento. Además, el número de portaobjetos que se pueden manejar manualmente generalmente está limitado a unos pocos en un experimento determinado. En contraste, un sistema automatizado de tinción de portaobjetos realiza todos los pasos (incluyendo lavado, incubación, aplicación de la sonda, desnaturalización, hibridación, aplicación y retirada del cubreobjetos) de forma automática. Esto libera al investigador durante 6 a 8 horas de trabajo en un experimento de FISH. Asimismo, un sistema automatizado de FISH puede aumentar significativamente el rendimiento. Por ejemplo, el sistema Xmatrx es capaz de procesar hasta 40 ensayos en portaobjetos de preparación individual y hasta 80 ensayos en portaobjetos de preparación doble simultáneamente. Entre las limitaciones de este sistema se encuentra que no es eficiente para un número reducido de experimentos de FISH, ya que requiere la preparación de grandes volúmenes de soluciones. Además, el protocolo de FISH programado en el sistema puede requerir modificaciones y ajustes para nuevas aplicaciones.
Un sistema de escaneo de portaobjetos es una versión automatizada de un microscopio fluorescente. El movimiento automatizado de la platina y un panel de control del microscopio sencillo liberan tiempo del investigador y hacen que el uso del microscopio sea extremadamente simple. Por ejemplo, el software del sistema de escaneo ACCORD PLUS permite la captura sencilla de múltiples canales de fluorescencia y una adquisición de imágenes fácil de gestionar. Un ejemplo de esto es la inclusión de la captura de z-stacks, en lugar de tomar una sola imagen; el software captura una serie de imágenes en el eje z configurable para asegurar que al menos una imagen permanezca enfocada. Aunque este sistema está diseñado principalmente para la adquisición de múltiples imágenes (muchas células en un solo portaobjetos), aún facilita mucho la localización de cromosomas en el portaobjetos en comparación con la navegación manual por el portaobjetos.
Tanto el sistema automatizado de tinción de portaobjetos como el sistema de escaneo se utilizan rutinariamente en clínicas de citogenética para el diagnóstico mediante FISH de anomalías cromosómicas en células humanas. En este estudio, desarrollamos un protocolo que utiliza estos sistemas automatizados para una aplicación en investigación básica. El protocolo automatizado de mapeo físico de alto rendimiento puede facilitar el desarrollo rápido de mapas cromosómicos físicos para cualquier especie de interés. Aunque en este informe utilizamos cromosomas politénicos para el mapeo físico, también se pueden utilizar cromosomas mitóticos con estos sistemas. Sería útil adaptar el protocolo a cromosomas mitóticos, ya que la mayoría de los organismos no desarrollan cromosomas politénicos legibles. Sin embargo, cuando están disponibles, los cromosomas politénicos pueden proporcionar información útil sobre la correspondencia entre dominios funcionales del genoma y la estructura cromosómica con la máxima resolución. Recientemente, se ha comparado la organización de los cromosomas politénicos, como los patrones de bandas e interbandas, con la de cromosomas no politénicos regulares (en interfase)18. Por lo tanto, el mapeo físico detallado realizado en preparaciones cromosómicas de alta presión tiene el potencial de vincular secuencias de ADN con estructuras cromosómicas específicas, tales como bandas, interbandas, esponjosidades, centrómeros, telómeros y heterocromatina; creando así ensamblajes genómicos basados en cromosomas.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos para microscopio de 22x22 mm</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos para microscopio de 18x18 mm</td><td>Fisher</td><td>12-553-402</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta rotativa Dremel 200 con accesorio de eje flexible</td><td>Rand</td><td></td><td>3&quot; Amoladora de banco mini multifunción (con limitador de velocidad)</td></tr><tr><td>Puntas plásticas especialmente diseñadas de 200 &amp;mu;l (bordes plásticos con cuentas) para herramienta Dremel</td><td>Pipetman</td><td>F171300</td><td>Cortar y calentar el extremo grueso de las puntas de pipeta</td></tr><tr><td>Tornillo de banco rápido revestido de estaño</td><td>Avenger Gold Toolmaker</td><td>MTC-200-1</td><td>Rectificado de precisión, cuadrado y paralelo dentro de 0,00025</td></tr><tr><td>Llave de torque</td><td>Craftsman</td><td>44593</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ThermoBrite para desnaturalización/hibridación de portaobjetos</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos con barrera de 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT108-SL</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT122-90X</td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatizado de tinción de portaobjetos Xmatrx</td><td>Abbott Molecular</td><td>08L46-001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico MZ6 Leica</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>Se puede utilizar un microscopio estereoscópico diferente</td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fases Olympus CX41</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>Se puede utilizar un microscopio de fases diferente</td></tr><tr><td>Sistema automatizado de escaneo ACCORD PLUS</td><td>BioView (USA)</td><td>BV-5000-ACCP</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra al 10% (NBF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formamida al 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrana, sal sódica</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Tampón SSC 20x</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Denhardt 50x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Solución de yoduro de YOYO-1 1 mM (491/509) en DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antifade ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr></tbody></table>

de alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Se prevé que los proyectos para obtener secuencias de genomas completos de 10 000 especies de vertebrados1 y de 5 000 especies de insectos y artrópodos relacionados2 se lleven a cabo durante los próximos 5 años. Por ejemplo, actualmente se está realizando la secuenciación de los genomas de 15 especies de mosquitos de la malaria mediante una plataforma Illumina3,4. Este grupo de especies del género Anopheles incluye tanto vectores como no vectores de la malaria. Cuando estén disponibles los ensamblajes genómicos, los investigadores tendrán la oportunidad única de realizar análisis comparativos para inferir cambios evolutivos relacionados con la capacidad vectorial. Sin embargo, ha resultado difícil utilizar lecturas de secuenciación de nueva generación para generar ensamblajes genómicos de novo de alta calidad5. Además, los ensamblajes genómicos existentes para Anopheles gambiae, aunque obtenidos mediante el método Sanger, presentan huecos o están fragmentados4,6.
El éxito de los análisis genómicos comparativos estará limitado si los investigadores trabajan con numerosos contigs de secuenciación, en lugar de con ensambles genómicos basados en cromosomas. Las secuencias fragmentadas y sin mapear generan problemas para los análisis genómicos porque: (i) los huecos no identificados provocan una anotación incorrecta o incompleta de las secuencias genómicas; (ii) las secuencias sin mapear llevan a confusiones entre genes parálogos y genes de diferentes haplotipos; y (iii) la falta de asignación cromosómica y orientación de los contigs de secuenciación impide reconstruir la filogenia de reordenamientos y estudiar la evolución cromosómica. Desarrollar mapas físicos de alta resolución para especies con genomas recién secuenciados es una inversión oportuna y rentable que facilitará la anotación del genoma, el análisis evolutivo y la resecuenciación de genomas individuales procedentes de poblaciones naturales7,8.
Aquí presentamos enfoques innovadores para la preparación de cromosomas, hibridación fluorescente in situ (FISH) y obtención de imágenes que facilitan el desarrollo rápido de mapas físicos. Utilizando An. gambiae como ejemplo, demostramos que el desarrollo de mapas cromosómicos físicos puede mejorar potencialmente los ensamblajes del genoma y, por ende, la calidad de los análisis genómicos. Primero, empleamos un método de alta presión para preparar extensiones de cromosomas politénicos. Este método, originalmente desarrollado para Drosophila9, permite al usuario visualizar más detalles en los cromosomas que la técnica convencional de aplastamiento10. Segundo, se utiliza un sistema automatizado de extremo frontal para FISH que permite el mapeo físico del genoma a alto rendimiento. El sistema automatizado de tinción de portaobjetos realiza múltiples ensayos simultáneamente y reduce drásticamente el tiempo de manipulación manual11. Tercero, un sistema automático de obtención de imágenes fluorescentes, que incluye una platina motorizada para portaobjetos, escanea y fotografía automáticamente los cromosomas marcados tras la FISH12. Este sistema es especialmente útil para identificar y visualizar múltiples placas cromosómicas en un mismo portaobjetos. Además, el proceso de escaneo captura resultados de FISH más uniformes. En conjunto, el protocolo automatizado de mapeo físico a alto rendimiento es más eficiente que un protocolo manual estándar.

Los ensamblajes genómicos basados en tecnologías de secuenciación masivamente paralela del ADN suelen ser altamente fragmentados. El desarrollo de mapas cromosómicos físicos puede mejorar potencialmente los ensamblajes genómicos. Aquí, demostramos enfoques innovadores para la preparación de cromosomas, hibridación fluorescente in situ y análisis de imágenes que aumentan significativamente el rendimiento en el desarrollo de mapas físicos.

De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Se prevé que los proyectos para obtener secuencias del genoma completo de 10 000 especies de vertebrados1 y de 5 000 especies de insectos y artrópodos relacionados2 se lleven a cabo...

El objetivo general de este procedimiento es mapear sondas de ADN a cromosomas politénicos de mosquito mediante una preparación de cromosomas a alta presión, seguida de hibridación fluorescente automatizada in C dos híbridos e imagenología automatizada. Esto se logra primero preparando extensiones de cromosomas politénicos utilizando un método de alta presión. El siguiente paso del procedimiento consiste en preparar sondas fluorescentes etiquetando ADN genómico de retroceso con el fluorocromo mediante un protocolo de traducción por mella.El tercer paso consiste en realizar la hibridación fluorescente in C dos utilizando sistemas automatizados de tinción de portaobjetos. El paso final es escanear y fotografiar los cromosomas marcados mediante un sistema automático de imágenes fluorescentes. En última instancia, las imágenes pueden mostrar la localización de una sonda de ADN marcada con fluorescencia en el cromosoma poli. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como un protocolo manual estándar de hibridación in situ, es que el protocolo de mapeo físico de mayor rendimiento produce resultados más consistentes y reduce drásticamente el tiempo de manipulación. Este protocolo comienza disecando hembras de medio gravedad y oly aproximadamente 25 horas después de la alimentación con sangre, para recolectar sus ovarios cuando se encuentran en la etapa tres de Christopher. En esta etapa, el área transparente con células foliculares dentro de los folículos debe tener forma redondeada; recolecte ovarios de cinco hembras y fíjelos en 500 microlitros de una solución modificada de carno recién preparada.Luego, se pueden almacenar a temperatura ambiente durante hasta 24 horas o más tiempo a menos 20 grados Celsius. A continuación, justo antes de preparar los portaobjetos para la disección de los ovarios, prepare la solución de carnoys y ácido propiónico al 50 %. Coloque cada par de ovarios en una gota de solución de carnoys fresca sobre un portaobjetos libre de polvo bajo un microscopio de disección.Divida los ovarios con la aguja de disección. Transfiera todos los fragmentos ováricos a seis portaobjetos limpios con ácido propiónico al 50%. Separe los folículos unos de otros utilizando agujas de disección.Luego, elimine cualquier tejido restante con una toalla de papel. Añada otra gota de ácido propiónico al 50% y espere de tres a cinco minutos. Según la leyenda, mantener los folículos en ácido propiónico al 50% durante tres a cinco minutos mejora significativamente la dispersión de cromosomas.A continuación, coloque un cubreobjetos y espere otro minuto para dispersar los núcleos. Envuelva el portaobjetos con papel de filtro y plástico. Ajuste un Dremel entre 3.000 y 5.000 rpm, y durante aproximadamente un minuto, gire ligeramente la punta giratoria del Dremel contra el cubreobjetos.Confirme la calidad del extendido con un microscopio de contraste de fases y aplique el dremel por más tiempo si es necesario, para aplanar los cromosomas. Coloque un segundo cubreobjetos adyacente al primero, luego coloque los cubreobjetos entre otro microscopio. A continuación, envuelva los portaobjetos con una lámina de plástico y papel de filtro, coloque los portaobjetos envueltos en una mordaza para comprimirlos entre 85 y 120 libras-pulgada.Después de aplanar los cromosomas en las seis portaobjetos, desenrolle los portaobjetos y retire los portaobjetos adicionales para aplanar aún más los cromosomas. Incube los portaobjetos a 55 grados Celsius durante 10 a 15 minutos en un sistema de desnaturalización e hibridación de portaobjetos. A continuación, sumerja un portaobjeto en nitrógeno líquido durante al menos 15 segundos o hasta que deje de burbujear.Luego, retire rápidamente la cubierta con una hoja de bisturí y coloque inmediatamente la preparación en etanol frío al 50% durante cinco minutos. Repita este proceso para cada preparación de forma secuencial. Deshidrate las preparaciones en baños de etanol al 70%, al 90% y al 100%.Súmérjalos en cada baño durante cinco minutos. Finalmente, después de que las laminillas se sequen al aire, están listas para la hibridación in situ fluorescente para tinción. Un dispositivo automatizado realiza la mayoría de los pasos del procedimiento, excepto la marcación de la sonda.Antes de cargar el dispositivo, prepare la sonda fluorescente etiquetando nuevamente el ADN con el fluorocromo utilizando un protocolo comercial de traducción NIC. Con la sonda preparada, cargue las láminas y los reactivos en las láminas automatizadas. Sistema de tinción y programe el sistema para realizar los siguientes pasos. Primero, suministre 800 microlitros de una XPBS durante 20 minutos.En segundo lugar, seque las laminillas con secador. En tercer lugar, fije las laminillas con 450 microlitros de formalina al 4% en un XPBS durante un minuto. Luego lave las laminillas con etanol al 100% durante un segundo, dos veces y durante dos minutos.Una vez tras el baño de etanol, seque nuevamente las laminillas con aire. Ahora caliente las laminillas a 45 grados Celsius durante dos minutos para evitar la formación de burbujas. A continuación, aplique 20 microlitros de la sonda de ADN, seguido de una gota de aceite mineral y un cubreobjetos; luego, en orden natural, los cromosomas a 90 grados Celsius durante 10 minutos.Luego, incubar los portaobjetos a 42 grados Celsius durante 14 horas para la hibridación. Después de la hibridación, realizar los lavados de estrictez durante dos minutos a 42 grados Celsius, seguidos de cuatro aplicaciones consecutivas de un segundo cada una con dos XSSC y secado. A continuación, aplicar 800 microlitros de 0,4 XSSC a 42 grados Celsius durante 10 minutos dos veces, seguido de un lavado adicional y dos XSSC a 25 grados Celsius durante 10 minutos.Ahora aplique el colorante: 50 microlitros de yo-yo uno, seguido de aceite mineral y cubreobjetos. Incube los portaobjetos a 25 grados Celsius durante 10 minutos. Luego retire los cubreobjetos.Lave las laminillas en dos veces SSC cuatro veces durante un segundo por lavado y seque las laminillas soplándolas. Finalmente, aplique 15 microlitros de reactivo antifade prolongado de oro a cada laminilla y coloque cubreobjetos nuevos. Encienda el sistema automatizado de escaneo Accord plus, comenzando con la fuente de alimentación Olympus U-R-F-L-T para una bombilla de halógeno.Luego el ordenador, y finalmente el microscopio con un accesorio de cámara. Ahora abra primero el paquete de software duet, configure una preescaneo de 10 x. Haga clic en el botón en línea, ingrese un nuevo ID de caso y asigne un ID de portaobjetos.Haga clic en el punto etiquetado como bf. Esta es la opción de campo brillante. Seleccione una opción de escaneo para la previsualización a 10 x.Seleccione 2, 500 x círculo, 10 000 x círculo o rectángulo. Haga clic en establecer y ejecutar. Luego, siga las indicaciones para ajustar correctamente el escaneo y haga clic en finalizar.Para iniciar el escaneo, presione la pestaña principal para regresar a la pantalla principal. Ahora haga clic en el botón sin conexión, busque el ID del caso y el ID de la diapositiva que se asignaron y haga clic en sin conexión.Escanee dentro del cuadro negro en la parte superior izquierda. Haga clic en una flecha y seleccione preescaneo de 10 x. Utilice las flechas para revisar las imágenes escaneadas después de encontrar una imagen de interés.Haga doble clic en la pantalla en el centro de la región objetivo y presione capturar. Esto seleccionará una imagen para su adquisición posterior, tras elegir todos los objetivos. Haga clic con el botón derecho en cada imagen, haga clic en clasificar, seleccione preescaneo de 10 x y elija politan.Regrese al menú principal y configure el preescaneo de 40 x. Seleccione en línea nuevamente y seleccione un portaobjetos. Cambie BF a ffl y cambie el nombre de la tarea a revisitar guion X 40 guion rg.Cambie la sección justo debajo de la última configuración para volver a dash all. Luego ejecute el programa y siga las indicaciones. Para configurar la automatización, haga clic en el botón iniciar coincidencia de vistas para hacer coincidir las imágenes de 10 x y 40 x.Haga clic en finalizar para iniciar el escaneo. Una vez finalizado, haga clic en clasificar y observe las imágenes. Se realizaron preparaciones de cromosomas politénicos de células nodrizas ováricas de hembras de la anomalía Gambia utilizando la técnica de alta presión.Este método no daña ni altera la mayor parte de la estructura cromosómica. Aplana los cromosomas doblados y, por lo tanto, revela bandas finas ocultas que no se observan en preparaciones convencionales. El cromosoma fue analizado con clones de ADN back obtenidos de la biblioteca S Gambia nd Tam back del anomaly.La biblioteca se generó a partir de larvas estrella de primer estadio de ambos sexos de la cepa plaga de Anopheles gambiae. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar un mapeo físico automatizado de alto rendimiento para facilitar el desarrollo rápido de ensamblajes genómicos basados en cromosomas.

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Investigación

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