De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado In situ La hibridación
28 de junio de 2012
Los ensamblajes genómicos basados en tecnologías de secuenciación masivamente paralela del ADN suelen ser altamente fragmentados. El desarrollo de mapas cromosómicos físicos puede mejorar potencialmente los ensamblajes genómicos. Aquí, demostramos enfoques innovadores para la preparación de cromosomas, hibridación fluorescente in situ y análisis de imágenes que aumentan significativamente el rendimiento en el desarrollo de mapas físicos.
El objetivo general de este procedimiento es mapear sondas de ADN a cromosomas politénicos de mosquito mediante una preparación de cromosomas a alta presión, seguida de hibridación fluorescente automatizada in C dos híbridos e imagenología automatizada. Esto se logra primero preparando extensiones de cromosomas politénicos utilizando un método de alta presión. El siguiente paso del procedimiento consiste en preparar sondas fluorescentes etiquetando ADN genómico de retroceso con el fluorocromo mediante un protocolo de traducción por mella.
El tercer paso consiste en realizar la hibridación fluorescente in C dos utilizando sistemas automatizados de tinción de portaobjetos. El paso final es escanear y fotografiar los cromosomas marcados mediante un sistema automático de imágenes fluorescentes. En última instancia, las imágenes pueden mostrar la localización de una sonda de ADN marcada con fluorescencia en el policromosoma.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como un protocolo estándar de hibridación in situ manual, es que el protocolo de mapeo físico de mayor rendimiento produce resultados más consistentes y reduce drásticamente el tiempo de manipulación. Este protocolo comienza disecando hembras de medio gravedad y oly aproximadamente 25 horas después de la alimentación con sangre, para recolectar sus ovarios cuando se encuentran en la etapa tres de Christopher. En esta etapa, la zona transparente con células nodrizas dentro de los folículos debe tener forma redondeada; recolecte ovarios de cinco hembras y fíjelos en 500 microlitros de una solución modificada de carno recién preparada.
Luego, se pueden almacenar a temperatura ambiente durante hasta 24 horas o más tiempo a menos 20 grados Celsius. A continuación, justo antes de preparar los portaobjetos para la disección de los ovarios, prepare la solución de carnoys y ácido propiónico al 50 %. Coloque cada par de ovarios en una gota de solución de carnoys fresca sobre un portaobjetos libre de polvo bajo un microscopio de disección.
Divida los ovarios con la aguja de disección. Transfiera todos los fragmentos ováricos a seis portaobjetos limpios con ácido propiónico al 50%. Separe los folículos unos de otros utilizando agujas de disección.
Luego, elimine cualquier tejido restante con una toalla de papel. Añada otra gota de ácido propiónico al 50 % y espere de tres a cinco minutos. Según la leyenda, mantener los folículos en ácido propiónico al 50 % durante tres a cinco minutos mejora significativamente la dispersión de cromosomas.
A continuación, coloque un cubreobjetos y espere otro minuto para dispersar los núcleos. Envuelva el portaobjetos con papel de filtro y plástico. Ajuste un Dremel entre 3.000 y 5.000 rpm y, durante aproximadamente un minuto, gire ligeramente la punta del Dremel en movimiento contra el cubreobjetos.
Confirme la calidad del extendido con un microscopio de contraste de fases y aplique el dremel durante más tiempo si es necesario, para aplanar los cromosomas. Coloque un segundo cubreobjetos adyacente al primero, luego coloque los cubreobjetos entre otro microscopio. A continuación, envuelva los portaobjetos con una lámina de plástico y papel de filtro, coloque los portaobjetos envueltos en una mordaza para comprimirlos entre 85 y 120 libras-pulgada.
Después de aplanar los cromosomas en las seis portaobjetos, desenrolle los portaobjetos y retire los portaobjetos adicionales para aplanar aún más los cromosomas. Incube los portaobjetos a 55 grados Celsius durante 10 a 15 minutos en un sistema de desnaturalización e hibridación de portaobjetos. A continuación, sumerja un portaobjetos en nitrógeno líquido durante al menos 15 segundos o hasta que deje de burbujear.
Luego, retire rápidamente la cubierta con una cuchilla de afeitar y coloque inmediatamente la preparación en etanol frío al 50 % durante cinco minutos. Repita este proceso para cada preparación de forma secuencial. Deshidrate las preparaciones en baños de etanol al 70 %, al 90 % y al 100 %.
Somérgalos en cada baño durante cinco minutos. Finalmente, después de que las laminillas se sequen al aire, están listas para la hibridación in situ fluorescente para tinción. Un dispositivo automatizado realiza la mayoría de los pasos del procedimiento, excepto la marcación de la sonda.
Antes de cargar el dispositivo, prepare la sonda fluorescente marcando nuevamente el ADN con el fluorocromo utilizando un protocolo comercial de traducción NIC. Con la sonda preparada, cargue las láminas y los reactivos en las láminas automatizadas. Sistema de tinción y programe el sistema para realizar los siguientes pasos. Primero, suministre 800 microlitros de una XPBS durante 20 minutos.
En segundo lugar, seque las laminillas con secador. En tercer lugar, fije las laminillas con 450 microlitros de formalina al 4% en un XPBS durante un minuto. Luego lave las laminillas con etanol al 100% durante un segundo, dos veces y durante dos minutos.
Una vez finalizado el baño de etanol, seque nuevamente las laminillas. Ahora caliente las laminillas a 45 grados Celsius durante dos minutos para evitar la formación de burbujas. A continuación, aplique 20 microlitros de la sonda de ADN, seguido de una gota de aceite mineral y un cubreobjetos; luego, en orden natural, los cromosomas a 90 grados Celsius durante 10 minutos.
Luego, incubar las laminillas a 42 grados Celsius durante 14 horas para la hibridación. Después de la hibridación, realizar los lavados de estrictez durante dos minutos a 42 grados Celsius, seguidos de cuatro aplicaciones consecutivas de un segundo cada una con dos XSSC y secado. A continuación, aplicar 800 microlitros de 0,4 XSSC a 42 grados Celsius durante 10 minutos dos veces, seguido de un lavado adicional y dos XSSC a 25 grados Celsius durante 10 minutos.
Ahora aplique el colorante: 50 microlitros de yo-yo uno, seguido de aceite mineral y cubreobjetos. Incube los portaobjetos a 25 grados Celsius durante 10 minutos. Luego retire los cubreobjetos.
Lave las laminillas en dos XSSC cuatro veces durante un segundo por lavado y seque las laminillas al aire. Finalmente, aplique 15 microlitros de reactivo antifade prolongado de oro a cada laminilla y coloque cubreobjetos nuevos. Encienda el sistema automatizado de escaneo Accord plus, comenzando con la fuente de alimentación Olympus U-R-F-L-T para una bombilla de halógeno.
Luego el ordenador y, finalmente, el microscopio con un accesorio de cámara. Ahora abra primero el paquete de software duet, configure una preescaneo de 10 x. Haga clic en el botón en línea, ingrese un nuevo ID de caso y asigne un ID de portaobjetos.
Haga clic en el punto etiquetado como bf. Esta es la opción de campo brillante. Seleccione una opción de escaneo para la previsualización de 10 x.
Seleccione 2, 500 x círculo, 10 000 x círculo o rectángulo. Haga clic en establecer y ejecutar. Luego, siga las indicaciones para ajustar correctamente el escaneo y haga clic en finalizar.
Para iniciar el escaneo, presione la pestaña principal para regresar a la pantalla principal. Ahora haga clic en el botón sin conexión, busque el ID del caso y el ID de la diapositiva que se asignaron y haga clic en sin conexión.
Escanee dentro del cuadro negro en la parte superior izquierda. Haga clic en una flecha y seleccione preescaneo de 10 x. Utilice las flechas para revisar las imágenes escaneadas después de encontrar una imagen de interés.
Haga doble clic en la pantalla en el centro de la región seleccionada y presione capturar. Esto marcará una imagen para su adquisición posterior, tras seleccionar todos los objetivos. Haga clic con el botón derecho en cada imagen, haga clic en clasificar, seleccione preescaneo de 10 x y seleccione politan.
Regrese al menú principal y configure el preescaneo de 40 x. Seleccione en línea nuevamente y seleccione un portaobjetos. Cambie BF a ffl y cambie el nombre de la tarea a revisitar guion X 40 guion rg.
Cambie la sección justo debajo de la última configuración para volver a dash all. Luego ejecute el programa y siga las indicaciones. Para configurar la automatización, haga clic en el botón iniciar coincidencia de vistas para hacer coincidir las imágenes de 10 x y 40 x.
Haga clic en finalizar para iniciar el escaneo. Una vez finalizado, haga clic en clasificar y observe las imágenes. Se realizaron preparaciones de cromosomas politénicos de células nodrizas ováricas de hembras de la anomalía Gambia utilizando la técnica de alta presión.
Este método no daña ni altera la mayor parte de la estructura cromosómica. Aplana los cromosomas doblados y, por lo tanto, revela bandas finas ocultas que no se observan en preparaciones convencionales. El cromosoma fue analizado con clones de ADN trasero obtenidos de la biblioteca trasera de S Gambia nd Tam.
La biblioteca se generó a partir de larvas estrella de primer estadio de ambos sexos de la cepa plaga de Anopheles gambiae. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar un mapeo físico automatizado de alto rendimiento para facilitar el desarrollo rápido de ensamblajes genómicos basados en cromosomas.
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo de alto rendimiento para la localización de sondas de ADN en cromosomas politénicos de mosquito. Al utilizar una preparación cromosómica de alta presión y técnicas de imagen automatizadas, el método mejora la eficiencia y la consistencia en el desarrollo de mapas físicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genómica
- Mapeo cromosómico
- Hibridación fluorescente in situ
Antecedentes
- Los ensamblajes del genoma a partir del secuenciado de ADN suelen estar fragmentados.
- Los mapas cromosómicos físicos pueden mejorar la calidad de los ensamblajes del genoma.
- Técnicas innovadoras pueden aumentar el rendimiento en el mapeo físico.
- Los sistemas automatizados pueden reducir el tiempo de manipulación en los procedimientos de laboratorio.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo de alto rendimiento para la elaboración de mapas cromosómicos.
- Mostrar la eficacia de la imagen automatizada en el desarrollo de mapas físicos.
- Mejorar la consistencia de los resultados en comparación con los métodos tradicionales.
Métodos Utilizados
- Preparación de cromosomas a alta presión a partir de ovarios de mosquito.
- Etiquetado con sonda fluorescente mediante el protocolo de traducción de mella.
- Hibridación fluorescente in situ automatizada.
- Adquisición de imágenes automatizada para la localización cromosómica.
Resultados principales
- El protocolo produce extensiones cromosómicas consistentes y de alta calidad.
- Los sistemas automatizados reducen significativamente el tiempo necesario para la elaboración de mapas físicos.
- Las imágenes muestran eficazmente la localización de sondas de ADN marcadas con fluorescencia.
- El método mejora el rendimiento en comparación con los protocolos manuales.
Conclusiones
- Este protocolo de alto rendimiento es un avance significativo en la cartografía cromosómica.
- La automatización mejora la eficiencia y la consistencia en la elaboración de mapas físicos.
- Las técnicas demostradas pueden aplicarse a otros estudios genómicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cartografía cromosómica física de alto rendimiento aborda un cuello de botella crítico en la calidad del ensamblaje del genoma, afectando directamente los análisis genómicos posteriores y los estudios evolutivos. Al permitir la localización rápida y consistente de sondas de ADN, este enfoque contribuye a reducir los riesgos en la validación de objetivos y mejora la confianza predictiva en los flujos de trabajo de genómica comparativa. La integración de la automatización reduce el tiempo de manipulación manual y potencia la reproducibilidad, posicionando al método como una capacidad escalable para proyectos de secuenciación a gran escala.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de la arquitectura genómica y la aclaración de la localización génica en relación con rasgos fenotípicos.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad en la anotación de genes al asignar contigs a ubicaciones cromosómicas específicas.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al mejorar la confianza en la inferencia de la función génica mediante un mapeo físico preciso.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce extensiones cromosómicas estandarizadas y de alta resolución adecuadas para ensayos basados en FISH reproducibles.
- Valor operativo: Los sistemas automatizados de tinción e imagen aumentan el rendimiento y reducen la variabilidad en la detección de la localización de sondas.
- Preparación para el ensayo: Genera resultados espaciales cuantificables que permiten la comparación entre variantes genéticas o condiciones experimentales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Traduccional: Facilita el análisis evolutivo y la reconstrucción filogenética mediante la asignación de orientación y ubicación a los contigs de secuenciación.
- Relevancia del Modelo Preclínico: Apoya estudios de competencia vectorial al permitir la genómica comparativa entre especies transmisoras y no transmisoras de enfermedades.
- Avance Ajustado al Riesgo: Mejora la calidad de la anotación del genoma, reduciendo los falsos positivos en las tuberías de identificación de objetivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento que va desde el secuenciamiento inicial del genoma hasta la anotación y el análisis comparativo, especialmente cuando se requiere resolución mediante mapa físico para resolver brechas en el ensamblaje o errores de ensamblaje.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el orden genético, la sintenia y la evolución cromosómica en modelos relevantes para enfermedades.
- Selección: Permite flujos de trabajo FISH estandarizados y automatizados para la validación de sondas y cribado de localización de alto rendimiento.
- Análisis: Genera lecturas espaciales y basadas en intensidad que permiten la comparación cuantitativa de la unión de sondas entre cromosomas o muestras.
- Investigación Traducional: Conecta el mapeo físico con la inferencia evolutiva y el descubrimiento de biomarcadores en estudios de genómica comparativa.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y automatizada para el mapeo físico aplicable a múltiples especies y proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la anotación de genes y reduce la ambigüedad mecanicista en la interpretación de datos genómicos.
- Valor operativo: Proporciona estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mediante la automatización de los pasos de tinción, hibridación y obtención de imágenes.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o abandono en la selección de objetivos al aumentar la fiabilidad del ensamblaje del genoma y reducir las pistas falsas biológicas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos genómicos mediante una mayor calidad del ensamblaje y una mejor comprensión evolutiva.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de cromosomas, protocolos de FISH y sistemas automatizados de imagen.
- Depende del acceso a herramientas de preparación de alta presión, tinción automática de portaobjetos y microscopios de fluorescencia motorizados.
- Necesita estandarización entre equipos para la marcación de sondas, condiciones de hibridación y tuberías de análisis de imágenes.
- La adaptación entre sistemas modelo puede requerir la optimización de los pasos de extensión y desnaturalización cromosómica.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de cromosomas politénicos de alta calidad y la idoneidad principalmente para genomas dípteros con etapas politénicas.
