Name: Caracterización de los mecanismos moleculares de la En vivo Catarata inducida por RUV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Aprende a inducir cataratas en ratas mediante radiación ultravioleta y analiza los mecanismos moleculares con PCR cuantitativa e inmunohistoquímica. Este modelo animal permite estudiar la apoptosis en el cristalino.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Karolinska KID-financiación, la Autoridad Sueca de Protección Radiológica, Instituto Karolinska Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Eye St. Erik el Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

1. La exposición a la radiación ultravioleta <ol><li> 15 min antes de la exposición, anestesiar una hembra Sprague-Dawley con una mezcla de 90 mg / kg Ketalar (ketamina) y 10 mg / kg Rompun (xilazina) por inyección intraperitoneal. </li><li> Colocar el animal en un limitador de rata y apretar las correas hasta la inmovilización de la rata sin causar una compresión de tronco 13. </li><li> Infundir Mydriacyl (tropicamida), 10 mg / ml, en ambos ojos de la rata para inducir midriasis. </li><li> Colocar el animal de modo que un ojo se coloca contra un haz estrecho de radiación UV a 300 nm con un ancho de 14 nm 10 a media altura y proteger el ojo contralateral con cinta de color negro. </li><li> Exponer la rata unilateralmente por debajo del umbral de dosis 1 kJ / m 2 RUV-B a 300 nm durante 15 minutos 15. </li></ol> 2. Disección <ol><li> Después de la pre-determinado intervalo de post-exposición (1, 5, 24 y HR 120), sacrificar la rata de seis semanas de edad (peso &lt;200 g) por carbon asfixia dióxido de carbono y la dislocación de las vértebras cervicales. </li><li> Ojos enucleación. A continuación, coloque la córnea del ojo hacia abajo, lado posterior hacia arriba. Entonces, perfore un agujero mínimo mediante la aplicación de una cánula de calibre 27 y empuje tangencial a la esclerótica para evitar dañar la lente que está muy cerca de la esclerótica. A continuación, utilice un par de tijeras de cirugía oftálmica para cortar circunferencialmente justo detrás del limbo hasta que la parte posterior de la esclerótica se puede quitar. A continuación, levante la lente con unas pinzas curvas romas. </li><li> Eliminar los restos del cuerpo ciliar desde el ecuador del cristalino bajo un microscopio, manteniendo la lente en solución salina equilibrada de no más de 5-10 min. </li></ol> 3. RT-PCR cuantitativa <ol><li> Colocar una lente en una mezcla de 350 l tampón de lisis RA1 (NucleoSpin RNA II Kit de aislamiento de ARN total) y 3,5 l β-mercaptoetanol en un tubo Eppendorf de 2 ml. </li><li> Mantener la lente en esta mezcla durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Homogeneizar la lente conuna aguja hasta sólo núcleo duro del cristalino que queda de la lente (la corteza y la cápsula de la lente se lisaron en tampón de lisis). Retire el núcleo de la mezcla. </li><li> Almacenar las muestras inmediatamente a -70 ° C. </li><li> Descongele las muestras y seguir el protocolo &quot;Total purificación de ARN a partir de células cultivadas y tejidos&quot; (NucleoSpin RNA II Kit de aislamiento de ARN total). </li><li> Tienda de muestras de ARN a -70 ° C. </li><li> Para verificar la eliminación suficiente de ADN de cada muestra, ejecutar una PCR en las condiciones siguientes (paso 1: 95 º C durante 2 min; paso 2 durante 40 ciclos: 95 ° C durante 20 s, 55 ° C durante 20 s, 72 ° C durante 20 seg; paso 3: 72 º C durante 7 min) con cebadores específicos de ADN de p53, adelante 5&#39;-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 &#39;y revertir 5&#39;-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3&#39; y Taq ADN polimerasa (dNTPack), de acuerdo con la fabricación protocolo. El producto de PCR esperada es 243 pares de bases. </li><li> Ejecutar un 1,5% electroforesis en gel de agarosa para detectar el producto de PCR específico de ADN de 243 pares de bases. Para preparar1,5% de gel de agarosa en tampón TBE tomar 3,75 g de agarosa y resolverlo en 250 ml de tampón TBE. Añadir bromuro de etidio (0,5 mg / ml) 500 l en 500 ml de solución de gel de agarosa al 1,5%. Calentar la mezcla en un horno de microondas y se agita para resolver la agarosa. </li></ol> Ninguna de las muestras tiene que revelar cualquier producto de PCR específicas de ADN en electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. <ol start="9"><li> Medir la concentración de las muestras de ARN (1 l) y la relación de absorbancia de la muestra a 260 nm (RNA) y 280 nm (proteína) en un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro. Si el ARN a la proteína de la relación de absorbancia de la muestra de ARN es 2,0 o más, entonces la muestra de ARN es puro. Si la relación de absorbancia de la muestra de ARN es menor que 2,0, rehacer etapa de purificación de ARN 3,5. </li><li> Tomar un volumen de muestra de RNA correspondiente a 1 mg y sintetizar cDNA siguiendo el protocolo 1 Kit st Strand cDNA de síntesis (1 kit st Strand cDNA de síntesis para la RT-PCR). </li><li> Almacenar las muestras de ADNc a -20 º C(Por un período de 1 y más años, almacenan a -70 ° C). </li><li> Ejecutar cuantitativa en tiempo real PCR en iCycler MyiQ único sistema de detección de color real PCR en tiempo. Carga triplicados en placas de 96 pocillos con 1 l de muestra cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, ensayo TaqMan Gene Expression para la caspasa 3, de acuerdo con las instrucciones de fabricación. Carga triplica en otra placa de 96 pocillos con 1 l de muestra cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, ensayo TaqMan Gene Expression para mayores de 18, de acuerdo con las instrucciones de fabricación (TaqMan Gene Expression Protocolo de ensayo). Diluir en serie una fracción de cDNA a partir de tres elegidas al azar y no expuestas lentes. Ejecutar diluciones en serie junto con el ADNc de las muestras en una placa de 96 pocillos. </li><li> Usar el método de la curva estándar para la cuantificación de los resultados. El número de ciclos en la fluorescencia umbral se utiliza como la medida en software MyiQ. Una curva estándar que expresa el número de ciclos en el umbral como función de la concentración relativa de calibrador es consultadatablished para las diluciones en serie en cada placa. ADNc a partir de tres muestras no tratadas de lentes se utiliza para la calibración. Relacionar el número de ciclos de umbral para cada muestra a la curva estándar para obtener la concentración relativa de la muestra de ADNc medido. Finalmente, obtener el nivel de expresión de los genes diana mediante la relación de la concentración relativa de ADNc diana a los 18 años de control de cDNA internos. </li></ol> 4. La tinción inmunohistoquímica <ol><li> Fijación <ol><li> Diseccionar el ojo en PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7,4). </li><li> Poner el ojo en un tubo lleno con 4% de paraformaldehído (PFA) en frío de hielo durante 20 min. Preparar PFA 4% el día antes. Almacenar a 4 ° C hasta su uso. PFA es fresco durante aproximadamente una semana. </li><li> Eliminar PFA con una micropipeta. A continuación, lavar con PBS enfriado en hielo durante 20 min. </li><li> Poner el ojo en sacarosa 30% a +4 º C durante la noche. </li><li> Poner el ojo en una copa llena con la temperatura óptima de corte (OCT)-medio (Tissue-Tek). Poner el ojo en una posición adecuada para el corte. </li><li> Congelar en octubre mediano con hielo seco. </li><li> Almacenar a -70 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Seccionamiento <ol><li> Coloque el ojo para la crio-corte en un plano adecuado. </li><li> Cortar tres 5 m de espesor medio sagital secciones desde una parte central de cada lente. Descartar al menos 6 secciones entre las secciones secuenciales para evitar manchar los mismos núcleos en diferentes secciones. </li><li> Una vez que una sección ha sido cortada, coloque suavemente una diapositiva en la parte superior de la misma. La sección a continuación, debe apegarse a la diapositiva. </li><li> Agregar los portaobjetos se seque al aire antes de su uso. Diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C hasta su utilización. </li></ol></li><li> Fluorescencia inmunohistoquímica <ol><li> Deje que las muestras de alcanzar la temperatura ambiente (5-10 min). </li><li> Dibujar bordes alrededor de las muestras con un PAP-pen (Invitrogen). </li><li> Deje que la frontera seca durante un tiempo (10 min). </li><li> Etiquetar los portaobjetos de microscopio. </li><li> Rehidratar en 1 × PBS durante 15 min. </li><li> Permeabilizar en solución estándar de bloque durante 30 min. </li><li> Añadir anticuerpo primario (policlonal de conejo caspasa-3, troceados anticuerpo Asp175 9661; Tecnología de Señalización Celular, Inc), diluido 1:3000 en solución de bloqueo estándar. </li><li> Almacenar en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar en PBS por pipeteado (3 x 5 min) o por inmersión en un baño de gran tamaño (&gt; 15 min, 1-2 cambios). </li><li> Añadir anticuerpo secundario (anticuerpo de conejo anti secundaria con una específica de absorción / emisión del espectro) diluido 1:300 en la solución estándar de bloque. </li><li> Lavar en PBS por pipeteado (3 x 5 min) o por inmersión en un baño de gran tamaño (&gt; 15 min, 1-2 cambios). </li><li> Limpie el pen-PAP frotis. </li><li> Almacenar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 h. Evite la exposición a la luz. </li><li> Añadir una gota de Vectashield y colocar un cubreobjetos sobre el portaobjetos. Evite hacer burbujas. </li><li> Dejar cuajar Vectashield (~ 20 min). </li><li> Mantenga apartados in la oscuridad hasta su análisis. </li><li> Todas las secciones de control se procesan en ausencia de anticuerpo primario. </li><li> Busque los resultados dentro de unas pocas horas bajo un microscopio de fluorescencia. </li><li> Contar núcleos de células epiteliales desde un lado del arco nuclear a proa del otro lado nuclear de cada lente. Aplicar el filtro azul estándar para ver todos los núcleos epiteliales de la lente en azul y un filtro estándar que se ajuste a la emisión del anticuerpo secundario para ver los núcleos positivos caspasa-3 en verde. </li><li> Registrar el número de todos los núcleos epiteliales de la lente y el número de núcleos positivos. Contar las células tres veces para cada sección. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
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<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

<html> En este trabajo se describen los métodos que permiten estudiar los eventos moleculares que ocurren durante la RUV-B inducida por la catarata. Teniendo en cuenta, que la mayoría de la información disponible para UVR in vivo inducida por catarata se derivó de los experimentos con ratas albinas Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, ​​19, se decidió utilizar la albinas Sprague-Dawley en el estudio actual. Edad de las ratas fue de seis semanas de edad. El género fue escogido par...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Ketalar </td><td> Pfizer </td><td> 150086 </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td> 022545 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Oculentum Simplex </td><td> Apoteket, Suecia </td><td> 336164 </td><td> 5 g </td></tr><tr><td> Mydriacyl </td><td> Alcon </td><td> 00352 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada </td><td> Alcon </td><td> 0007950055 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 ul β-mercaptoetanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II Kit de aislamiento de ARN total </td><td> Macherey-Nagel GmbH &amp; Co, Duren, Alemania </td><td> 740.955,50 </td><td></td></tr><tr><td> cebadores específicos de ADN de p53 </td><td> biomers.net GmbH </td><td> Una medida que se </td><td></td></tr><tr><td> Taq ADN polimerasa, dNTPack </td><td> Roche </td><td> 04 728 866 001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> El bromuro de etidio solución de 0,5 mg / ml </td><td> Sigma </td><td> E1385 </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop ND-1000 espectrofotómetro </td><td> Productos NanoDrop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ª Strand cDNA síntesis kit de RT-PCR (AMV) </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 11 483 188 001 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler MyiQ un solo color en tiempo real PCR sistema de detección </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Placa de 96 pocillos </td><td> Sarstedt </td><td> 72.1979.202 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Master Mix </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4369016 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene ensayo de expresión de la caspasa 3 </td><td> Applied Biosystems </td><td> Rn00563902_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene ensayo de expresión para mayores de 18 </td><td> Applied Biosystems </td><td> Hs99999901_s1 </td><td></td></tr><tr><td> MyiQ software </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exfoliados caspasa-3 (Asp175) </td><td> Señalización Celular Tecnología </td><td> 9661 </td><td></td></tr><tr><td> Anti IgG de conejo </td><td> Abcam </td><td> Ab6798 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Universal microscopio Axioplan 2 Radiología </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 441244 </td><td></td></tr><tr><td> TBE 10x tampón </td><td> Promega </td><td> V4251 </td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de los mecanismos moleculares de la<em&gt; en vivo</em&gt; catarata inducida por ruv

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo 1. La Organización Mundial de la Salud define catarata como una opacidad del cristalino del ojo que impide la transmisión de la luz. La catarata es una enfermedad multifactorial asociada con la diabetes, el tabaquismo, la radiación ultravioleta (UVR), alcohol, radiación ionizante, los esteroides y la hipertensión. Hay una fuerte evidencia experimental 2-4 y epidemiológica 5,6 UVR que provoca catarata. Hemos desarrollado un modelo animal para UVR B catarata inducida en ambos anestesiados 7 y los animales no anestesiados 8. La única cura para las cataratas es la cirugía, pero este tratamiento no es accesible a todos. Se ha estimado que un retraso de la aparición de cataratas durante 10 años podría reducir la necesidad de cirugía de cataratas en un 50% 9. Para retrasar la incidencia de cataratas, que es necesario para comprender los mecanismos de la formación de cataratas y encontrar estrategia eficaz de prevencióngias. Entre los mecanismos para el desarrollo de cataratas, la apoptosis desempeña un papel crucial en la iniciación de cataratas en los seres humanos y los animales 10. Nuestro enfoque ha sido recientemente apoptosis en la lente como el mecanismo para el desarrollo de cataratas 8,11,12. Se prevé que una mejor comprensión del efecto de la radiación UV en la vía de la apoptosis se proporcionan posibilidades para el descubrimiento de nuevos productos farmacéuticos para prevenir cataratas. En este artículo se describe cómo catarata puede ser inducida experimentalmente por la exposición en vivo a los rayos UV-B. Además RT-PCR e inmunohistoquímica se presentan como herramientas para estudiar los mecanismos moleculares de la RUV-B inducida por la catarata.

Las diversas fuentes de variación en las mediciones se calcula con un análisis de varianza y se encontró que la consideración de tres mediciones por animal de la varianza para mediciones fue del orden de 15% del de los animales. Así, considerando el análisis de toda la lente, no es posible aumentar la precisión. Pruebas ortogonal dilucidado un contraste estadísticamente significativo para la caspasa-3 mensajes entre 120 intervalo de latencia de horas frente a cortos intervalos de latencia. <...

La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo. Radiación solar ultravioleta (UVR) es el principal factor de riesgo para el desarrollo de cataratas. Un modelo animal de lejos catarata inducida por UVR-B fue desarrollado. En este artículo se describen los métodos para la investigación de la formación de cataratas: La exposición a los rayos UV, cuantitativos RT-PCR e inmunohistoquímica.

Caracterización de los mecanismos moleculares de la<em&gt; En vivo</em&gt; Catarata inducida por RUV

La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo 1. La Organización Mundial de la Salud define la catarata como una opacidad del cristalino del ojo que ...

Este video demuestra un método para inducir cataratas mediante radiación ultravioleta en la rata. Los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de cataratas se estudian posteriormente mediante PCR cuantitativa en tiempo real e inmuno citoinmunoquímica. Primero, se expone el ojo de una rata a radiación ultravioleta para inducir la formación de cataratas.El otro ojo sirve como control. A continuación, se disecan y procesan los cristalinos para obtener ARN y evaluar los niveles de expresión de CAS B mediante PCR cuantitativa en tiempo real o se tiñen utilizando un anticuerpo contra la caspasa clivada. Tres para evaluar la expresión y localización de la proteína activa.En última instancia, los resultados de estos ensayos confirman un aumento en el ARNm de la caspasa tres y en la expresión de la proteína activa en el núcleo de las células del cristalino tras la exposición a la radiación ultravioleta. La principal ventaja de este protocolo frente a los métodos existentes radica en el uso de una fuente única de radiación ultravioleta de banda estrecha y de un dispositivo universal de inmovilización de ratas, lo que nos permite exponer de forma segura y precisa a los animales a un espectro y dosis de UV bien definidos. Además, aplicamos técnicas biológicas modernas, como la R-T-P-C-R cuantitativa y la inmunohistoquímica, para estudiar la apoptosis en el cristalino; este método puede proporcionar información sobre los mecanismos moleculares de la catarata inducida por radiación ultravioleta.También puede aplicarse a otros modelos experimentales, como cánceres de piel inducidos por radiación ultravioleta, neurociencia conductual en ratas y estudios experimentales del ojo con enfoque en la apoptosis. Comience este protocolo colocando una rata hembra Sprague dawley anestesiada en un sujetador para ratas y, sin comprimir el tronco, apriete los cinturones hasta inmovilizar a la rata. Para inducir midriasis o dilatación de la pupila, instile una a dos gotas de una solución de 10 miligramos por mililitro de clorhidrato de tropicamida en cada ojo.Luego, aplique ungüento en el ojo no expuesto y protéjalo con cinta negra para bloquear la radiación ultravioleta. A continuación, coloque al animal en el sujetador de manera que el ojo descubierto quede posicionado para recibir un haz estrecho de radiación ultravioleta a 300 nanómetros con un ancho total a la mitad del máximo de 10 nanómetros, generado por una lámpara de mercurio de alta presión. Exponga unilateralmente a la rata a una dosis subumbral de un kilojoule por metro cuadrado de UVRB durante 15 minutos después de la exposición.Retire la cinta del ojo no expuesto y aplique pomada a ambos ojos. Devuelva el animal a su jaula y cúbralo con papel suave para mantenerlo caliente. Supervise al animal hasta que recupere suficiente conciencia para mantenerse en posición esternal recostada.Luego, coloque la rata recuperada de vuelta en su jaula con otras. 1, 5, 24 y 120 horas. Siga después de la exposición.Coloque el ojo enucleado de la rata sacrificada con la córnea hacia abajo y la cara posterior hacia arriba sobre un tejido de papel suave. A continuación, trabaje bajo un microscopio estereoscópico. Utilice una cánula de calibre 27 para hacer un orificio mínimo, empujando tangencialmente hacia la esclerótica para evitar dañar el cristalino, que se encuentra muy cerca de la esclerótica.A continuación, utilizando un par de tijeras para cirugía oftálmica, corte de forma circunferencial justo detrás del limbo hasta que se pueda levantar la porción posterior de la esclerótica. Luego, con fórceps curvos romos, levante el cristalino, colóquelo en una solución salina equilibrada y elimine los restos del cuerpo ciliar del cristalino. El cristalino no debe mantenerse en la solución salina equilibrada durante más de 10 minutos.Tras la disección, coloque un cristalino en un tubo microcentrífugo de dos mililitros que contenga 350 microlitros de tampón de lisis RA del kit de aislamiento de ARN total Nucleo Spin RNA II y 3,5 microlitros de etanol beta-mercapto. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, use una aguja para homogenizar mecánicamente el cristalino hasta que solo quede el núcleo duro. El tampón de lisis destruirá el cortex y la cápsula del cristalino.Retire el núcleo de la mezcla y deséchelo. Almacene las muestras inmediatamente a 70 grados centígrados bajo cero. Las muestras pueden almacenarse hasta por un año cuando estén listas para continuar.Padre las muestras y purifique el ARN según el protocolo de ARN total, purificación a partir de células cultivadas y tejidos del kit. Almacene las muestras de ARN a menos 70 grados Celsius. Para verificar la eliminación suficiente de ADN de cada muestra, amplifique el ADN utilizando cebadores específicos de ADN de P 53 bajo las siguientes condiciones.Paso 1: 95 grados Celsius durante dos minutos. Paso dos durante 40 ciclos: 95 grados Celsius durante 20 segundos. 55 grados Celsius durante 20 segundos.72 grados Celsius durante 20 segundos. Paso 3: 72 grados Celsius durante siete minutos. Una vez finalizada la corrida, analice los productos en un gel de AROS al 1,5 %.Para detectar el producto específico de PCR de ADN de 243 pares de bases, asegúrese de incluir una muestra de control positivo y una de control negativo. Si el ADN se ha eliminado con éxito, no se observarán los productos de PCR. Una banda solo debería observarse en la línea del control positivo utilizando un espectrofotómetro NanoDrop para medir la concentración de las muestras de ARN y determinar la relación de ARN a proteína.Si la relación ARN a proteína del ARN según la absorbancia de la muestra o la relación 260/280 es de 2,0 o superior, la muestra de ARN es pura. A continuación, utilizando un microgramo de ARN, sintetice ADNc mediante un kit de síntesis de primera cadena de ADNc para RT-PCR y almacene las muestras de ADNc a -20 grados Celsius. A continuación, para realizar la PCR cuantitativa en tiempo real, aplique las muestras por triplicado en una placa de 96 pocillos.Cada pocillo debe contener un microlitro de muestra de ADNc combinado con la mezcla maestra del ensayo de expresión génica TAC man para caspasa-3 en una placa separada. Aplique las mismas muestras, pero utilizando el ensayo de expresión génica TAC man para 18 s. A continuación, para generar una curva estándar para el análisis, realice diluciones en serie de un microlitro de ADNc proveniente de tres lentes no expuestos elegidos al azar.Realice diluciones seriadas junto con el ADNc de las muestras. En una placa de 96 pocillos, en cada placa. Centrifugue la placa, luego ejecútela en un sistema de detección de PCR en tiempo real I cycler my iq, de un solo color.Tras la corrida, utilizando el software de mi IQ. Establezca una curva patrón que exprese el número de ciclos en el umbral como una función de la concentración relativa del calibrador para las diluciones seriadas en cada placa. Utilice la curva patrón para determinar la concentración relativa del ADNc de la muestra, midiendo el número umbral de ciclos para cada muestra.Finalmente, determine el nivel de expresión de los genes diana relacionando la concentración relativa del ADNc diana con el ADNc del control interno 18 s. Para realizar la tinción inmunohistoquímica, diseque el ojo y colóquelo en PBS tras el disección. Transfiera el ojo a un tubo lleno con paraformaldehído al 4 % e incube sobre hielo durante 20 minutos.Utilizando una micropipeta, retire el paraformaldehído. A continuación, transfiera el ojo a un tubo eppendorf de dos mililitros que contenga un mililitro de PBS frío con hielo e incube durante 20 minutos en hielo. Luego, transfiera el ojo a un tubo eppendorf que contenga sacarosa al 30%.Incubar a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, utilizar pinzas para transferir el ojo a un recipiente lleno de medio de temperatura óptima para corte o medio OCT. Colocar el ojo en posición recta para el corte en secciones.Luego, coloque el recipiente sobre hielo seco para congelarlo y guárdelo a menos 70 grados Celsius hasta su uso para seccionar el ojo y analizarlo mediante microscopía de fluorescencia. Comience colocando el ojo embebido en OCT sobre un portamuestras en el microtomo criostático para la criosección. Intente alinear el lado más plano del cristalino del ojo paralelo al borde del cuchillo.Corte tres secciones midsagitales de cinco micrones de grosor de una porción central de cada cristalino. Deseche al menos seis secciones entre secciones secuenciales para evitar teñir los mismos núcleos en diferentes secciones. Una vez que se haya cortado una sección, coloque suavemente un portaobjetos encima de ella.La sección debe adherirse entonces al portaobjetos. Deje que los portaobjetos se sequen al aire antes de usarlos. Los portaobjetos pueden almacenarse a menos 70 grados Celsius hasta que sean necesarios para la tinción.Deje que los portaobjetos vuelvan a la temperatura ambiente. Luego, realice la tinción con anticuerpos para identificar la fase tres del CAS escindido según se describe en el documento adjunto dentro de unas pocas horas e inspeccione los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia. Cuente todos los núcleos de las células epiteliales del cristalino.Registre el número de todos los núcleos epiteliales del cristalino contando las células teñidas con DAPI y el número de núcleos positivos para caspasa tres contando la caspasa activa. Tres células marcadas. Cuente las células tres veces por cada sección.La caspasa 3 es una proteasa principal en la fase de ejecución de la apoptosis. Microscopía electrónica de transmisión. Diversos estudios respaldan que la radiación ultravioleta induce apoptosis en el cristalino.Los estudios experimentales sobre apoptosis confirman que la caspasa tres es un marcador confiable de apoptosis. Para determinar si la exposición in vivo a radiación ultravioleta (UVR) induce la expresión de caspasa tres, se midió la expresión de ARNm en el cristalino mediante QPCR a las 1, 5, 24 y 120 horas tras la exposición in vivo a un kilojoule por metro cuadrado de UVR a 300 nanómetros. Luego, se representó gráficamente la relación media de CASP tres, ARNm respecto a 18S-ARNr, entre el cristalino expuesto y el cristalino contralateral no expuesto, para cada punto temporal.Esta figura muestra la expresión del ARNm de la caspasa tres a lo largo del tiempo y demuestra la transcripción del proceso de apoptosis. El marcador caspasa tres en el cristalino in vivo tras la exposición a pruebas ortogonales de radiación ultravioleta lejana (UVR) arrojó una diferencia estadísticamente significativa en la señal del ARNm de la caspasa tres entre el intervalo de latencia de 120 horas y los intervalos de latencia más cortos. La expresión de la caspasa tres en un cristalino expuesto y no expuesto también se comparó mediante microscopía de inmunofluorescencia, como se muestra en estas imágenes; 24 horas después de la exposición, los núcleos están marcados, lo que indica la presencia de caspasa tres activa.Este método de inmunomarcado proporciona información valiosa sobre la distribución espacial de las células epiteliales marcadas con el marcador de apoptosis caspasa tres en el cristalino. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir experimentalmente la catarata por V-V-U-V-R y de cómo estudiar el mecanismo molecular de la catarata inducida por cinco UVR utilizando PCR cuantitativa e inmunohistoquímica.

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