Name: Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a realizar Análisis Cuantitativo de Aptitud (QFA) para evaluar la aptitud microbiana a escala genómica mediante imágenes automatizadas y modelado computacional. Este método mejora la precisión en la medición del crecimiento microbiano.

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Queremos agradecer a todos los miembros de nuestro laboratorio y el Centro para la Biología de Sistema Integrado de Envejecimiento y Nutrición (CISBAN) para el apoyo y útiles debates. Este estudio fue apoyado por las Ciencias Biológicas y la Biotecnología Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) y el Wellcome Trust (075294, 093088).

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
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<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
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<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
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<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

QFA es en muchos sentidos, un descendiente directo de los tres establecidos a escala de banco técnicas microbiológicas: cultura dilución, pruebas in situ de la serie 9, la determinación de la curva de crecimiento en cultivos líquidos aireados y las planchas del 9 de réplica 13. Estos tres métodos se resumen y se comparan con QFA y otras técnicas de alto rendimiento en la Tabla 2. Considerando que la dilución, pruebas in situ de la serie definirá la aptitud de una cepa como su capacidad de formar colonias en una serie de culturas cultivadas a partir de una serie de diluciones del inóculo, QFA gimnasio cepa medidas por parte de las observaciones repetidas de una misma cultura para construir una curva de crecimiento. Cuantificación de la aptitud de los cultivos individuales permite muchas cepas más a ser examinada simultáneamente, bajo condiciones idénticas. Replicar las matrices de las culturas permite repetir la prueba de las colecciones de la cepa, el más útil cuando las pruebas de diferencias de aptitud de cultivo en diferentes ambientes o las bases genéticas. El protocolo presentado QFAaquí utiliza equipos robóticos costosas de duplicar, inocular, incubar y las placas de agar de imagen, adecuada para observar el crecimiento de miles de culturas independientes (robótica QFA, Tabla 2). Sin embargo, puesto QFA se basa en técnicas establecidas, de laboratorio tradicionales, sino que también puede llevarse a cabo mucho más barata mediante la sustitución de asistencia robot con pasos Manual (Manual de QFA, Tabla 2). Manual de QFA implica la replicación y la inoculación de los cultivos sobre discos de agar con una herramienta manual de pin y la transferencia manual de las placas hacia y desde una incubadora para la fotografía. El flujo de trabajo mismo análisis computacional puede ser aplicado para generar curvas de crecimiento de cualquier diseño experimental. QFA estimaciones salud física parecen ser relativamente precisa. En la Figura 4, las eficacias medias de cuatro grupos de ejemplo de supresiones de genes funcionalmente relacionados se destacan. La proximidad de los miembros de cada clase de genes relacionados funcionalmente en dos independenciarentes orígenes genéticos (ura3Δ y cdc13-1) indica la reproducibilidad de QFA estimaciones de fitness. Por ejemplo, sólo tres supresiones de genes (de un máximo de 4.300) separar a los tres miembros del complejo MRX conservada. De alto rendimiento alternativas a QFA para probar las características de crecimiento de cepas microbianas incluyen SGA 5,6, las pantallas de la competencia en las bibliotecas de código de barras y pantallas de captura de 11,12 cinética de la densidad óptica de lectores de placas espectrofotométrico 10, que se resumen en la Tabla 2 y se describe más detalladamente en otro lugar 8 . QFA y placas SGA, donde las culturas crecen en las superficies de agar agar (sólidos basados ​​en métodos, Cuadro 2) se puede manejar de forma rápida y fácil por el robot. Sólidos culturas superficie del agar son bien aireado durante todo el crecimiento y las células pueden crecer en cultivos fijos, permitiendo microbios sociables a crecer en una comunidad 14. Dejado a las comunidades microbianas intactas, unFECTOS sus propios micro-ambientes, toxinas que secretan tales como etanol, y posiblemente de señalización entre las células. Sin embargo, la continua mezcla de culturas líquidas, necesarias para lograr una aireación adecuada, de forma artificial altera las comunidades microbianas y sus entornos de microorganismos que puedan afectar a su modo de crecimiento. La contaminación cruzada es una preocupación menor en los métodos de agar sólido ya que hay menos oportunidad para que las salpicaduras de líquidos que transportan las células entre las culturas. Si se produce contaminación por el aire exterior transmitidas por microbios en los ensayos de agar sólido, a menudo puede ser detectada mediante inspección visual de las placas de agar sólido y representó o eliminado. Rendimiento QFA es significativamente mayor que la de paralelas métodos líquidos de dos maneras. En primer lugar, en QFA (y SGA) placas, cultivos inoculados se empaquetan con mayor densidad, lo que las culturas más independientes por placa. En QFA normalmente hay 308 culturas, sin contar las no experimentales culturas de borde (Figura 1) comcomparación en paralelo cultivos líquidos con 96 o 100 por placa culturas. En segundo lugar, los experimentos QFA se puede escalar a un número mucho mayor de las placas. Considerando que el número de placas analizadas en un único experimento QFA sólo está limitado por el espacio disponible en una sala de incubadora o caliente, la frecuencia mínima permisible de captura de imágenes y la frecuencia máxima alcanzable captura, el número de placas en un experimento de crecimiento líquido es fuertemente limitado por la capacidad del lector de placas (normalmente una o dos placas), o del apilador unido al lector de placas (típicamente 25-50 placas). Recientemente hemos llevado a cabo un experimento QFA totalmente automatizado en 123 platos, cada uno con 308 cultivos experimentales, dando 37.884 cultivos simultáneos. Se estima que el número máximo posible de las culturas de cultivo independientes en el líquido es de 96 (cultivos / placa) x 50 (placas / apilador) = 4,800, que es de alrededor de diez veces menor que nuestro rendimiento QFA. Una alternativa para las pantallas de cultivo líquidos es utilizar muchas gro automatizadowth dispositivos en paralelo (Tabla 1 de la revisión de Blomberg 8), cada uno con una capacidad de uno o dos platos. El control de temperatura en cada dispositivo es independiente, y así que las condiciones no son idénticas, pero suponiendo que lo sean, este flujo de trabajo que requieren al menos 190 dispositivos de este tipo para que coincida con el rendimiento QFA (suponiendo 200 cultivos líquidos por dispositivo). En resumen, QFA es un flujo de trabajo de alta calidad que pueden ser útiles para obtener los caracteres cuantitativos de crecimiento en los dos pequeños experimentos a escala centrados y pantallas de alto rendimiento. Es lo suficientemente flexible para ser aplicado eficazmente con diferentes requisitos para el equipo robótico. El componente de cálculo del flujo de trabajo QFA se basa en libre disposición, el código fuente abierto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 pines manual de pintool con 1/8 pines de diámetro &quot; </td></tr><tr><td> Mezclar mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Instalado en Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 plataforma giratoria del carrusel </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Manual de imagen de alta resolución </td></tr><tr><td> spImager con Cytomen </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Costumbre </td><td> Temperatura controlada de imágenes automatizado de alta resolución </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 con intercambiador de calor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Se adjunta a spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Se adjunta a Cytomat </td></tr><tr><td> spImager con el carrusel de </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Costumbre </td><td> Imagen automatizada de alta resolución </td></tr><tr><td> Pin Robot herramienta de accesorio para FP12pins </td><td> V &amp; P Científico </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 pines </td><td> V &amp; P Científico </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm de largo, 17 mm de longitud expuesta pin </td></tr><tr><td> Docking Station para la Herramienta de Pin </td><td> V &amp; P Científico </td><td> VP425 </td><td> Base de la estación de acoplamiento eliminado para permitir un secado de fans de los pasadores </td></tr><tr><td>Pin Cepillo de limpieza </td><td> V &amp; P Científico </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Herramienta manual pin </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray con tapa </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 así estériles placas de poliestireno </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 así estériles tapas de poliestireno </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Reactivos específicos y equipos.

un flujo de trabajo de análisis cuantitativo gimnasio

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Análisis de aptitud cuantitativa (QFA) es un flujo de trabajo experimental y computacional para la comparación de eficacias de los cultivos microbianos crecido en paralelo 1,2,3,4. QFA se puede aplicar a las observaciones de las culturas centradas individuales, pero es más útil para todo el genoma interacción genética o la investigación de análisis de drogas a miles de culturas independientes. El método experimental central es la inoculación de independientes, diluidas cultivos líquidos microbianos sobre discos de agar sólidos que son incubados y se fotografiaron con regularidad. Las fotografías de cada punto de tiempo se analizan, produciendo cuantitativos estimaciones de la densidad de células, que se utilizan para construir curvas de crecimiento, lo que permite medidas cuantitativas aptitud para ser derivado. Eficacias Cultura se puede comparar a cuantificar y clasificar las fortalezas genéticas de interacción o de sensibilidad a los medicamentos. El efecto sobre la aptitud cultivo de cualquier tratamiento añadido en agar sustrato (por ejemplo, pequeñas moléculas, antibióticos o nutrientes) o se aplica a placas externoly (irradiación UV, por ejemplo, temperatura) se puede cuantificar por QFA. El flujo de trabajo QFA produce tasa de crecimiento estima análoga a los obtenidos por medición espectrofotométrica de paralelas cultivos líquidos en los lectores de placas de 96 pocillos o bien 200. Es importante destacar que QFA tiene el rendimiento significativamente mayor en comparación con estos métodos. Culturas QFA crecer en una superficie de agar sólido y por lo tanto bien aireado durante el crecimiento sin la necesidad de agitación o agitación. QFA rendimiento no es tan alta como la de algunos matriz sintética genética (SGA) de los métodos de detección 5,6. Sin embargo, ya que las culturas están fuertemente QFA diluido antes de ser inoculadas en agar, QFA puede capturar las curvas de crecimiento más completos, incluyendo las fases exponencial y la saturación de 3. Por ejemplo, las observaciones de la curva de crecimiento permiten tiempos de la cultura de duplicación que se calcula directamente con la alta precisión, como se indicó anteriormente 1. Aquí les presentamos unaprotocolo específico de QFA aplicado a miles de S. culturas cerevisiae, que se gestionan automáticamente mediante robots durante la inoculación, incubación y de imagen. Cualquiera de estos pasos automatizados puede ser sustituido por un procedimiento equivalente, manual, con una reducción asociada en el rendimiento, y que también presentan un protocolo de instrucciones rendimiento más bajo. Las mismas herramientas de software QFA se puede aplicar a las imágenes capturadas, ya sea en flujo de trabajo. Tenemos amplia experiencia en la aplicación de QFA a los cultivos de la levadura de gemación S. cerevisiae, pero esperamos que QFA será igualmente útil para examinar las culturas de la levadura de fisión S. pombe y cultivos bacterianos.

Análisis de aptitud cuantitativa (QFA) es una serie complementaria de los métodos experimentales y computacionales para la estimación de eficacias de cultivos microbianos. QFA estima el efecto de mutaciones genéticas, medicamentos u otros tratamientos aplicados en el crecimiento de microbios. Los experimentos de escala a partir del análisis de las culturas individuales enfocada a miles de culturas paralelas se pueden diseñar.

Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

El Análisis Cuantitativo de la Aptitud (QFA, por sus siglas en inglés) es un flujo de trabajo experimental y computacional para comparar las aptitudes de cultivos microbianos crecidos en paralelo1,2,3,4. ...

El objetivo de este procedimiento es capturar simultáneamente ajustes cuantitativos de cultivos microbianos a escala del genoma completo, de manera precisa y de alto rendimiento. Esto se logra primero transformando una biblioteca ordenada de colonias microbianas en placas de 96 pocillos y cultivando los cultivos hasta la saturación. A continuación, los cultivos saturados se diluyen en agua y luego se depositan sobre placas sólidas de agar.Luego, las placas sólidas con agar se fotografían periódicamente hasta que el crecimiento de la colonia microbiana se satura. Finalmente, las fotografías de seguimiento temporal del crecimiento de cada cultivo se convierten en medidas cuantitativas de la densidad celular, y las curvas de crecimiento observadas se resumen mediante modelos de crecimiento y medidas cuantitativas del ajuste microbiano. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren evidencia de interacciones genéticas al demostrar que las cepas microbianas presentan diferentes ajustes, ya sea cuando se combinan con distintas mutaciones o cuando se cultivan en diferentes condiciones.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los métodos de clavijas de alta densidad, tales como SGA o experimentos de competencia con códigos de barras, es que las mediciones de aptitud son más precisas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de fármacos contra el cáncer, como qué genes y procesos son importantes en la respuesta al daño del ADN y al control del ciclo celular, así como comprender y trasladar dicha investigación y microorganismos básicos a la forma de posibles dianas terapéuticas en células cancerosas humanas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de los telómeros y la visi.También puede aplicarse a otras áreas de la biología de levaduras o, de hecho, a cualquier área en la que los fenotipos de aptitud puedan proporcionar información sobre la biología microbiana. Esperamos que el QFA pueda aplicarse a muchos otros organismos microbianos para los cuales existan bibliotecas de matrices. Por ejemplo, povi e coli, orilla surplus A partir de cultivos saturados de la noche anterior, se sembraron hasta 96 cepas independientes de levadura en volúmenes de 200 microlitros de medio líquido rico.En una placa de cultivo de 96 pocillos, esterilice un replicador manual de 96 puntas con un diámetro de un octavo de pulgada sumergiéndolo primero en etanol al 100 %, luego flameándolo y dejándolo enfriar. Coloque 200 microlitros de agua estéril en los pocillos de una placa de 96 pocillos, agregue cultivos saturados de levadura y dilúyalos sumergiendo la herramienta de pin esterilizada en las cepas tres veces. Luego, sumérjala una vez en la placa que contiene el agua. Vuelva a esterilizar la herramienta de pin y déjela enfriar antes de sumergirla tres veces en los cultivos diluidos. A continuación, transfiera el pin a una placa de agar sólido.Después de incubar las placas de agar, utilice un imagenador robótico SP s y p para obtener imágenes manualmente para el cultivo automatizado. Comience con una matriz rectangular de cepas de levadura independientes cultivadas en agar sólido. En este ejemplo, las cepas iniciales son el resultado del cruce de una mutación de consulta sensible a la temperatura con la colección de deleciones de levadura.1.536 cultivos que representan cuatro réplicas de 384 cepas independientes de levadura se cultivan en placas SGA utilizando un robot con una herramienta estéril de transferencia de 96 agujas, con un diámetro de aguja de un milímetro, transfiriendo 384 de los 1.536 cepas a 4 placas de cultivo de 96 pocillos que contienen 200 microlitros de medio selectivo; se cultivan los cultivos a 20 grados Celsius hasta alcanzar la saturación. Para depositar los cultivos saturados de levadura, comience transfiriéndolos a un robot de manipulación de líquidos y Resus, suspendiéndolos en un agitador magnético, diluya los cultivos aproximadamente a una relación de uno a 70 utilizando una herramienta robótica estéril de 96 agujas para transferirlos mediante pinzas a 200 microlitros de agua estéril.Después de limpiar y esterilizar la herramienta de pines, depositar las cultivos diluidos sobre placas de agar. En formato de 384 pocillos, transferir las placas a un incubador controlado por temperatura y humectado, equipado con un carrusel automático y una compuerta de acceso. Para obtener imágenes de los cultivos, utilizar un imagenador automático robótico, que retira repetidamente las placas del incubador, quita las tapas, las transfiere a un espacio uniformemente iluminado debajo de una cámara de 35 milímetros y captura una imagen de 5.184 por 3.456 píxeles.La resolución de píxeles reemplaza la tapa y luego devuelve las placas al carrusel del incubador para rastrear las ubicaciones de los cultivos en las placas y los tratamientos aplicados a ellos. Las placas se codifican automáticamente con un código de barras según el nombre del incubador, la temperatura, un número de lote secuencial único y la posición dentro del incubador. Los nombres de las imágenes son una concatenación del nombre de la placa y la marca de tiempo, y se generan automáticamente al capturar la imagen.Suele etiquetarse manualmente las placas para asegurar que permanezcan en el mismo orden durante la transferencia entre caruseles de robots. Los archivos de metadatos son archivos de texto delimitados por tabulaciones, que se generan manualmente. El archivo de descripción experimental FT dos.La tabla uno es única para cada experimento, pero la descripción de la biblioteca FT tres, tabla uno puede reutilizarse ampliamente. Una vez construido, el experimento se describe en el archivo de descripción experimental FT dos, tabla uno, que contiene columnas para el código de barras o el nombre automático de la placa, la marca temporal de inicio del experimento, el tratamiento de la placa, el contenido del medio de agar sólido, el nombre de la pantalla, el número de placa de la biblioteca para bibliotecas con múltiples placas y un número de cuadrante de repetición para reducir el formato de 1.536 pocillos a 384 pocillos. La biblioteca de cepas e se describe mediante un archivo de descripción de biblioteca FT tres, tabla uno, que indica el genotipo cultivado en cada ubicación de cultivo.En cada placa de una biblioteca, se incluyen las columnas cuatro, nombre de la biblioteca, ORF, número de placa, fila, columna de placa y una columna opcional de notas. Puede proporcionarse un archivo opcional de nombres estándar de genes FT cuatro, tabla uno, que describe el nombre estándar del gen asociado con cada número sistemático de ORFY, identificando las cepas que se están analizando. Este archivo contiene dos columnas, ORF y nombre del gen, para analizar los datos.El flujo de trabajo computacional de QFA requiere acceso a una estación de trabajo informática multinúcleo razonablemente potente en la que esté instalado. La herramienta de software de análisis de imágenes colonizer y el paquete QFAR, ambos documentados en línea, están disponibles gratuitamente y funcionan en una variedad de sistemas operativos. Ejecute colonizer con cada una de las imágenes de placas capturadas como entrada, generando un archivo de salida de colonizer FT cinco, tabla uno por cada imagen capturada; los archivos de salida de colonizer especifican estimaciones de densidad de cultivo, área del cultivo, forma y color.Para cada una de las 384 ubicaciones en la placa de imagen, un nombre de archivo de salida se copia automáticamente del nombre del archivo de imagen fuente. El paquete QFAR contiene funciones seldens para cursos temporales de cada cultivo, con el fin de ajustar modelos poblacionales logísticos generalizados a las observaciones y para graficar. Véanse las figuras dos y tres para ejemplos.Los valores de los parámetros ajustados se escriben en archivos de parámetros logísticos de QFA. El paquete QFAR también contiene funciones para el control de calidad. Se descartan las colonias periféricas debido a la mayor disponibilidad de nutrientes en los bordes de la placa y a las dificultades con el análisis de imágenes.Se eliminan del análisis las culturas cercanas a las paredes de la placa y aquellas que no superaron el SGA, así como los genotipos que muestran asociación con los genes marcadores específicos de la pantalla. Se derivan varias medidas cuantitativas de aptitud a partir de los parámetros del modelo poblacional logístico para cada cultura. Estas incluyen las tasas máximas de duplicación poblacional y el número de divisiones desde la inoculación hasta la saturación para cada conjunto de culturas replicadas y para cada definición de aptitud.Se calculan varias estadísticas resumidas de las estimaciones de aptitud: media y mediana de la aptitud, desviación estándar de la aptitud y número de réplicas observadas. Las estadísticas resumidas se exportan a los archivos de resumen de aptitud QFA FT ocho, tabla uno, para su análisis posterior. Por ejemplo, cálculos de puntuaciones de interacción genética FT nueve, tabla uno.Esta figura muestra una curva de crecimiento típica en escala logarítmica OBTENIDA MEDIANTE QFA 384. Los cultivos crecieron a 20 grados Celsius sobre agar sólido, cuantificados mediante colonizador, con un aumento en la densidad celular detectable por primera vez tras aproximadamente dos días. Este retraso probablemente sea un efecto combinado de una fase de latencia del cultivo tras la inoculación en medio sólido y de un límite inferior de detección para la densidad celular.Aquí, se capturaron 308 curvas de crecimiento similares a partir de una sola placa. Tenga en cuenta que las cepas que produjeron una línea plana estaban muy enfermas o muertas. Esta figura demuestra la comparación de dos cribados QFA a nivel del genoma completo para inferir las intensidades de las interacciones genéticas.El paquete QFAR también incluye funciones para generar la figura anterior de la curva de crecimiento y para producir listas ordenadas de los genotipos examinados y estimaciones de la intensidad de la interacción genética. Junto con un valor Q para la significancia de la GIS observada, una vez dominado, un experimento QF.A completo a escala del genoma con cuatro réplicas puede completarse en menos de tres semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantenerse organizado en el seguimiento y nombramiento de todas las placas y las imágenes.Todas las placas deben ser inoculadas y sembradas en la orientación y orden correctos. El análisis de datos depende de la exactitud de los archivos de texto auxiliares elaborados por el científico experimental. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estimar la aptitud de miles de cultivos microbianos independientes.Los valores de aptitud se estiman mediante la toma repetida de fotografías de cultivos con manchas, creciendo en placas de agar sólido, la conversión de las imágenes capturadas en estimaciones de densidad celular y la generación de curvas de crecimiento. La modelización matemática de las curvas de crecimiento proporciona estimaciones cuantitativas de la aptitud, que luego pueden utilizarse para deducir relaciones funcionales entre productos génicos a escala genómica.

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Diseño automatizado, de alto rendimiento, experimentos de crecimiento de células continuas utilizando eVOLVER

Este protocolo describe cómo mantener el Experimento de Evolución a Largo Plazo (LTEE) de Escherichia coli realizando sus transferencias diarias y congelaciones periódicas y cómo realizar ensayos de competencia para medir las mejoras de aptitud física en bacterias evolucionadas. Estos procedimientos pueden servir como plantilla para los investigadores que comienzan sus propios experimentos de evolución microbiana.

Transferencias diarias, archivo de poblaciones y medición de la aptitud física en el experimento de evolución a largo plazo con Escherichia coli

Aquí, presentamos un protocolo para convertir datos transcriptómicos en una vista mqTrans, lo que permite la identificación de biomarcadores oscuros. Si bien no se expresan diferencialmente en los análisis transcriptómicos convencionales, estos biomarcadores exhiben una expresión diferencial en la vista mqTrans. El enfoque sirve como una técnica complementaria a los métodos tradicionales, revelando biomarcadores que antes se pasaban por alto.

Generación de la vista de regulación transcripcional de características transcriptómicas para la tarea de predicción y la detección de biomarcadores oscuros en conjuntos de datos pequeños

Presentamos un flujo de trabajo flexible y extensible basado en Jupyter-lab para el análisis no supervisado de conjuntos de datos multiómicos complejos que combina diferentes pasos de preprocesamiento, estimación del modelo de análisis factorial multiómico y varios análisis posteriores.

Aplicación del análisis factorial multiómico no supervisado para descubrir patrones de variación y procesos moleculares relacionados con las enfermedades cardiovasculares

La tecnología portátil tiene un bajo costo y ofrece un monitoreo conveniente de los datos fisiológicos. Sin embargo, la precisión y fiabilidad de estos dispositivos requiere una evaluación cautelosa para garantizar su eficacia y seguridad para los usuarios. Este informe describe el proceso de validación de un reloj inteligente comercial en el seguimiento de datos fisiológicos y de actividad física.

Evaluación de la precisión de los datos de los relojes inteligentes de fitness para el seguimiento de la actividad cardiovascular y física: un estudio de validación en salud digital

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Aprenda a realizar Análisis Cuantitativo de Aptitud (QFA) para evaluar la aptitud microbiana a escala genómica mediante imágenes automatizadas y modelado computacional. Este método mejora la precisión en la medición del crecimiento microbiano.

Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

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