Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

El objetivo de este procedimiento es capturar aptitudes cuantitativas de cultivo microbiano en paralelo a escala de todo el genoma de una manera precisa y de alto rendimiento. Esto se logra mediante el primer Turing y la biblioteca de coordenadas microbianas en placas de 96 pocillos y el crecimiento del cultivo hasta la saturación. A continuación, los cultivos saturados se diluyen en agua y luego se colocan en placas de agar sólidas.

A continuación, se fotografían periódicamente las placas sólidas y hasta que se satura el crecimiento de la colonia microbiana. Finalmente, las fotografías del curso del tiempo del crecimiento de cada cultivo se convierten en medidas cuantitativas de la densidad celular y se resumen las curvas de crecimiento observadas con modelos de crecimiento y medidas cuantitativas de la aptitud microbiana. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren evidencia de interacciones genéticas al demostrar que las cepas microbianas tienen diferentes aptitudes, ya sea cuando se combinan con diferentes mutaciones o se cultivan en diferentes condiciones.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los métodos de fijación de alta densidad, como el SGA o los experimentos de competencia con códigos de barras, es que las mediciones de aptitud son más precisas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de fármacos contra el cáncer, como qué genes y procesos son importantes en la respuesta al daño del ADN y el control del ciclo celular, entendiendo y traduciendo dicha investigación y microorganismos básicos en forma de posibles dianas farmacológicas en las células cancerosas humanas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función y el visi.

También se puede aplicar a otras áreas de la biología de la levadura o, de hecho, a cualquier área en la que los fenotipos de aptitud puedan proporcionar información sobre la biología microbiana. Esperamos que QFA se pueda aplicar a muchos otros organismos microbianos para los que existen bibliotecas de matrices. Por ejemplo, povi e coli, orilla excedente A partir de cultivos saturados durante la noche reprodujeron hasta 96 cepas de levadura independientes en volúmenes de 200 microlitros de medio líquido rico.

En un plato de 96 pozos cultivados, esterilice un plato de réplica manual de 96 pines y un octavo de pulgada de diámetro sumergiéndolo primero en etanol al 100%, luego flameándolo y dejándolo enfriar, 200 microlitros de agua estéril en los pozos de un vórtice de placa de 96 pocillos ha saturado los cultivos de levadura y diluyéndolos sumergiendo la herramienta de alfiler esterilizada en las cepas tres veces. Luego, una vez en el plato que contiene el agua, esterilice la herramienta de alfiler y deje que se enfríe antes de sumergirla tres veces en los cultivos diluidos. Luego transfiera el pivote a una placa de agar sólida.

Después de incubar las placas de agar, utilice un generador de imágenes SP de S and P Robotics para obtener imágenes manuales para el cultivo automatizado. Comience con una matriz rectangular de cepas de levadura independientes cultivadas en agar sólido. En este ejemplo, las cepas iniciales son el resultado del cruce de una mutación de consulta sensible a la temperatura con la colección de deleción de levadura.

Se cultivan 1.536 cultivos que representan cuatro réplicas de 384 cepas de levadura independientes en placas SGA utilizando un robot con una herramienta de pin estéril de 96 pines y un milímetro de diámetro que transfiere 384 de las 1.536 cepas a 4 96. Las placas de cultivo de pocillos que contienen 200 microlitros de medio selectivo hacen crecer los cultivos a 20 grados centígrados hasta la saturación. Para detectar los cultivos de levadura saturados, comience transfiriéndolos a un robot de manejo de líquidos y Resus suspendiéndolos en un agitador magnético, diluya los cultivos a alrededor de uno a 70 mediante el uso de una herramienta de alfiler robótica estéril de 96 pines para clavarlos en 200 microlitros de agua estéril.

Después de limpiar y esterilizar la herramienta de clavija, coloque los cultivos diluidos en placas de agar. En formato de pocillo 384, transfiera las placas a una incubadora humidificada a temperatura controlada con carrusel automático y escotilla de acceso. Para obtener imágenes de los cultivos, utilice un generador de imágenes automatizado robótico, que retira repetidamente las placas de la incubadora, quita las tapas, las transfiere a un espacio uniformemente iluminado debajo de una cámara de 35 milímetros, captura una imagen a 5, 184 por 3, 456.

La resolución de píxeles reemplaza la tapa y luego las devuelve al carrusel de la incubadora para rastrear las ubicaciones de los cultivos en las placas y los tratamientos aplicados a ellas. Las placas se codifican automáticamente con códigos de barras de acuerdo con el nombre de la incubadora, la temperatura, el número de lote secuencial único y la posición en la incubadora. Los nombres de las imágenes son una concatenación del nombre de la placa y la marca de tiempo y se generan automáticamente al capturar la imagen.

Las placas a menudo también se etiquetan manualmente para garantizar que permanezcan en el mismo orden cuando se transfieren entre carruseles de robots. Los archivos de metadatos son archivos de texto delimitados por tabuladores, que se generan manualmente. El archivo de descripción experimental FT dos.

La tabla uno es única para cada experimento, pero la descripción de la biblioteca FT tres, la tabla uno se puede reutilizar ampliamente. Una vez construido, el experimento se describe en el archivo de descripción experimental FT dos tablas que contienen columnas para el código de barras o el nombre de la placa generado automáticamente, el experimento de inicio de la marca de tiempo del tratamiento de la placa el contenido del nombre de pantalla del medio de agar sólido, el número de placa de la biblioteca para bibliotecas con múltiples placas y un número de cuadrante repetido para reducir la escala de 1, 536, formato de pozo a 384. El formato del pozo es la biblioteca de cepas se describe con un archivo de descripción de la biblioteca FT tres, tabla uno que indica el genotipo cultivado en cada ubicación de cultivo.

En cada placa de una biblioteca, contiene las columnas cuatro, el nombre de la biblioteca, el ORF, la placa de número de placa, la columna de la placa de fila y una columna de notas opcional. Se puede proporcionar un archivo de nombre de gen estándar opcional FT 4, tabla uno que describe el nombre de gen estándar asociado con cada número ORFY sistemático, identificando las cepas que se están examinando. Este archivo contiene dos columnas, ORF y nombre del gen para analizar los datos.

El flujo de trabajo computacional QFA requiere acceso a una estación de trabajo de computadora multinúcleo razonablemente potente en la que se instala. La herramienta de software de análisis de imágenes colonizador y el paquete QFAR, ambos documentados en línea, están disponibles de forma gratuita y se ejecutan en una variedad de sistemas operativos. Ejecute el colonizador con cada una de las imágenes de placa capturadas como entrada, generando un archivo de salida del colonizador FT cinco, tabla uno para cada imagen capturada, archivos de salida del colonizador capturado, especifique las estimaciones de densidad de cultivo, el cultivo, el área, la forma y el color.

Para cada una de las 384 ubicaciones de la placa de imagen, se copia automáticamente un nombre de archivo de salida del nombre del archivo de imagen de origen. El paquete QFAR contiene funciones seldens a los cursos de tiempo de cada cultura para ajustar los modelos de población logística generalizada a las observaciones y a la gráfica. Ambos véanse las figuras dos y tres como ejemplos.

Los valores de los parámetros ajustados se escriben en archivos de parámetros logísticos QFA. El paquete QFAR también contiene funciones para el control de calidad. Las colonias de borde se descartan debido a la mayor disponibilidad de nutrientes en los bordes de la placa y la dificultad con el análisis de imágenes.

Se eliminan del análisis las paredes cercanas a las placas y los cultivos, que no superaron el SGA, y los genotipos que muestran vinculación con genes marcadores específicos de la criba. Varias medidas cuantitativas de aptitud se derivan de los parámetros del modelo de población logística para cada cultura. Estos incluyen las tasas máximas de duplicación de la población y el número de divisiones desde la inoculación hasta la saturación para cada conjunto de cultivos replicados y para cada definición de aptitud.

Se calculan varios estadísticos resumidos de las estimaciones de aptitud física media y media, la desviación estándar de la aptitud y el número de réplicas observadas. Las estadísticas de resumen se envían a los archivos de resumen de aptitud física de QFA FT eight, tabla uno para su posterior análisis. Por ejemplo, los cálculos de las puntuaciones de interacción genética FT 9 tabla uno.

Esta figura muestra una curva de crecimiento típica en una escala logarítmica OUTTA 384 QFA. Cultivos que crecen a 20 grados centígrados en agar sólido cuantificado por el colonizador con un aumento en la densidad celular detectable por primera vez después de aproximadamente dos días. Este retraso es probablemente un efecto combinado de una fase de retraso en el cultivo después de la inoculación en medio sólido y un límite inferior de detección para la densidad celular.

Aquí, se capturaron 308 curvas de crecimiento similares de una sola placa. Tenga en cuenta que las cepas que produjeron una línea plana estaban muy enfermas o muertas. Esta figura demuestra la comparación de dos cribas QFA de todo el genoma para inferir las fortalezas de la interacción genética.

El paquete QFAR también incluye funciones para producir la figura de la curva de crecimiento anterior y para generar listas clasificadas de los genotipos examinados y estimaciones de la fuerza de la interacción genética. Junto con un valor Q para la significación del SIG observado, una vez dominado un QF completo de cuatro réplicas en todo el genoma. Un experimento puede completarse en tres semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe organizarse en el seguimiento y la denominación de todas las placas e imágenes.

Todas las placas deben inocularse y colocarse en la orientación y orden correctas. El análisis de los datos se basa en la exactitud de los archivos de texto auxiliares construidos por el científico experimental. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estimar la aptitud de miles de cultivos microbianos independientes.

Las aptitudes se estiman fotografiando repetidamente cultivos manchados, creciendo en placas sólidas de agar, convirtiendo las imágenes capturadas en estimaciones de la densidad celular y generando curvas de crecimiento. El modelado matemático de las curvas de crecimiento proporciona estimaciones cuantitativas de la aptitud, que luego se pueden utilizar para deducir relaciones funcionales entre productos genéticos a escala de todo el genoma.