Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

El objetivo de este procedimiento es capturar simultáneamente ajustes cuantitativos de cultivos microbianos a escala del genoma completo, de manera precisa y de alto rendimiento. Esto se logra primero transformando una biblioteca ordenada de colonias microbianas en placas de 96 pocillos y cultivando los cultivos hasta la saturación. A continuación, los cultivos saturados se diluyen en agua y luego se depositan sobre placas sólidas de agar.

Luego, las placas sólidas con agar se fotografían periódicamente hasta que el crecimiento de la colonia microbiana se satura. Finalmente, las fotografías de seguimiento temporal del crecimiento de cada cultivo se convierten en medidas cuantitativas de la densidad celular, y las curvas de crecimiento observadas se resumen mediante modelos de crecimiento y medidas cuantitativas del ajuste microbiano. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren evidencia de interacciones genéticas al demostrar que las cepas microbianas presentan diferentes ajustes, ya sea cuando se combinan con distintas mutaciones o cuando se cultivan en diferentes condiciones.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los métodos de clavijas de alta densidad, tales como SGA o experimentos de competencia con códigos de barras, es que las mediciones de aptitud son más precisas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo de fármacos contra el cáncer, como qué genes y procesos son importantes en la respuesta al daño del ADN y al control del ciclo celular, así como comprender y trasladar dicha investigación y microorganismos básicos a la forma de posibles dianas terapéuticas en células cancerosas humanas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de los telómeros y la visi.

También puede aplicarse a otras áreas de la biología de levaduras o, de hecho, a cualquier área en la que los fenotipos de aptitud puedan proporcionar información sobre la biología microbiana. Esperamos que el QFA pueda aplicarse a muchos otros organismos microbianos para los cuales existan bibliotecas de matrices. Por ejemplo, povi e coli, orilla surplus A partir de cultivos saturados de la noche anterior, se sembraron hasta 96 cepas independientes de levadura en volúmenes de 200 microlitros de medio líquido rico.

En una placa de cultivo de 96 pocillos, esterilice un replicador manual de 96 puntas con un diámetro de un octavo de pulgada sumergiéndolo primero en etanol al 100 %, luego flameándolo y dejándolo enfriar. Coloque 200 microlitros de agua estéril en los pocillos de una placa de 96 pocillos, agregue cultivos saturados de levadura y dilúyalos sumergiendo la herramienta de pin esterilizada en las cepas tres veces. Luego, sumérjala una vez en la placa que contiene el agua. Vuelva a esterilizar la herramienta de pin y déjela enfriar antes de sumergirla tres veces en los cultivos diluidos. A continuación, transfiera el pin a una placa de agar sólido.

Después de incubar las placas de agar, utilice un imagenador robótico SP s y p para obtener imágenes manualmente para el cultivo automatizado. Comience con una matriz rectangular de cepas de levadura independientes cultivadas en agar sólido. En este ejemplo, las cepas iniciales son el resultado del cruce de una mutación de consulta sensible a la temperatura con la colección de deleciones de levadura.

1.536 cultivos que representan cuatro réplicas de 384 cepas independientes de levadura se cultivan en placas SGA utilizando un robot con una herramienta estéril de transferencia de 96 agujas, con un diámetro de aguja de un milímetro, transfiriendo 384 de los 1.536 cepas a 4 placas de cultivo de 96 pocillos que contienen 200 microlitros de medio selectivo; se cultivan los cultivos a 20 grados Celsius hasta alcanzar la saturación. Para depositar los cultivos saturados de levadura, comience transfiriéndolos a un robot de manipulación de líquidos y Resus, suspendiéndolos en un agitador magnético, diluya los cultivos aproximadamente a una relación de uno a 70 utilizando una herramienta robótica estéril de 96 agujas para transferirlos mediante pinzas a 200 microlitros de agua estéril.

Después de limpiar y esterilizar la herramienta de pines, depositar las cultivos diluidos sobre placas de agar. En formato de 384 pocillos, transferir las placas a un incubador controlado por temperatura y humectado, equipado con un carrusel automático y una compuerta de acceso. Para obtener imágenes de los cultivos, utilizar un imagenador automático robótico, que retira repetidamente las placas del incubador, quita las tapas, las transfiere a un espacio uniformemente iluminado debajo de una cámara de 35 milímetros y captura una imagen de 5.184 por 3.456 píxeles.

La resolución de píxeles reemplaza la tapa y luego devuelve las placas al carrusel del incubador para rastrear las ubicaciones de los cultivos en las placas y los tratamientos aplicados a ellos. Las placas se codifican automáticamente con un código de barras según el nombre del incubador, la temperatura, un número de lote secuencial único y la posición dentro del incubador. Los nombres de las imágenes son una concatenación del nombre de la placa y la marca de tiempo, y se generan automáticamente al capturar la imagen.

Suele etiquetarse manualmente las placas para asegurar que permanezcan en el mismo orden durante la transferencia entre caruseles de robots. Los archivos de metadatos son archivos de texto delimitados por tabulaciones, que se generan manualmente. El archivo de descripción experimental FT dos.

La tabla uno es única para cada experimento, pero la descripción de la biblioteca FT tres, tabla uno puede reutilizarse ampliamente. Una vez construido, el experimento se describe en el archivo de descripción experimental FT dos, tabla uno, que contiene columnas para el código de barras o el nombre automático de la placa, la marca temporal de inicio del experimento, el tratamiento de la placa, el contenido del medio de agar sólido, el nombre de la pantalla, el número de placa de la biblioteca para bibliotecas con múltiples placas y un número de cuadrante de repetición para reducir el formato de 1.536 pocillos a 384 pocillos. La biblioteca de cepas e se describe mediante un archivo de descripción de biblioteca FT tres, tabla uno, que indica el genotipo cultivado en cada ubicación de cultivo.

En cada placa de una biblioteca, se incluyen las columnas cuatro, nombre de la biblioteca, ORF, número de placa, fila, columna de placa y una columna opcional de notas. Puede proporcionarse un archivo opcional de nombres estándar de genes FT cuatro, tabla uno, que describe el nombre estándar del gen asociado con cada número sistemático de ORFY, identificando las cepas que se están analizando. Este archivo contiene dos columnas, ORF y nombre del gen, para analizar los datos.

El flujo de trabajo computacional de QFA requiere acceso a una estación de trabajo informática multinúcleo razonablemente potente en la que esté instalado. La herramienta de software de análisis de imágenes colonizer y el paquete QFAR, ambos documentados en línea, están disponibles gratuitamente y funcionan en una variedad de sistemas operativos. Ejecute colonizer con cada una de las imágenes de placas capturadas como entrada, generando un archivo de salida de colonizer FT cinco, tabla uno por cada imagen capturada; los archivos de salida de colonizer especifican estimaciones de densidad de cultivo, área del cultivo, forma y color.

Para cada una de las 384 ubicaciones en la placa de imagen, un nombre de archivo de salida se copia automáticamente del nombre del archivo de imagen fuente. El paquete QFAR contiene funciones seldens para cursos temporales de cada cultivo, con el fin de ajustar modelos poblacionales logísticos generalizados a las observaciones y para graficar. Véanse las figuras dos y tres para ejemplos.

Los valores de los parámetros ajustados se escriben en archivos de parámetros logísticos de QFA. El paquete QFAR también contiene funciones para el control de calidad. Se descartan las colonias periféricas debido a la mayor disponibilidad de nutrientes en los bordes de la placa y a las dificultades con el análisis de imágenes.

Se eliminan del análisis las culturas cercanas a las paredes de la placa y aquellas que no superaron el SGA, así como los genotipos que muestran asociación con los genes marcadores específicos de la pantalla. Se derivan varias medidas cuantitativas de aptitud a partir de los parámetros del modelo poblacional logístico para cada cultura. Estas incluyen las tasas máximas de duplicación poblacional y el número de divisiones desde la inoculación hasta la saturación para cada conjunto de culturas replicadas y para cada definición de aptitud.

Se calculan varias estadísticas resumidas de las estimaciones de aptitud: media y mediana de la aptitud, desviación estándar de la aptitud y número de réplicas observadas. Las estadísticas resumidas se exportan a los archivos de resumen de aptitud QFA FT ocho, tabla uno, para su análisis posterior. Por ejemplo, cálculos de puntuaciones de interacción genética FT nueve, tabla uno.

Esta figura muestra una curva de crecimiento típica en escala logarítmica OBTENIDA MEDIANTE QFA 384. Los cultivos crecieron a 20 grados Celsius sobre agar sólido, cuantificados mediante colonizador, con un aumento en la densidad celular detectable por primera vez tras aproximadamente dos días. Este retraso probablemente sea un efecto combinado de una fase de latencia del cultivo tras la inoculación en medio sólido y de un límite inferior de detección para la densidad celular.

Aquí, se capturaron 308 curvas de crecimiento similares a partir de una sola placa. Tenga en cuenta que las cepas que produjeron una línea plana estaban muy enfermas o muertas. Esta figura demuestra la comparación de dos cribados QFA a nivel del genoma completo para inferir las intensidades de las interacciones genéticas.

El paquete QFAR también incluye funciones para generar la figura anterior de la curva de crecimiento y para producir listas ordenadas de los genotipos examinados y estimaciones de la intensidad de la interacción genética. Junto con un valor Q para la significancia de la GIS observada, una vez dominado, un experimento QF.A completo a escala del genoma con cuatro réplicas puede completarse en menos de tres semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantenerse organizado en el seguimiento y nombramiento de todas las placas y las imágenes.

Todas las placas deben ser inoculadas y sembradas en la orientación y orden correctos. El análisis de datos depende de la exactitud de los archivos de texto auxiliares elaborados por el científico experimental. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estimar la aptitud de miles de cultivos microbianos independientes.

Los valores de aptitud se estiman mediante la toma repetida de fotografías de cultivos con manchas, creciendo en placas de agar sólido, la conversión de las imágenes capturadas en estimaciones de densidad celular y la generación de curvas de crecimiento. La modelización matemática de las curvas de crecimiento proporciona estimaciones cuantitativas de la aptitud, que luego pueden utilizarse para deducir relaciones funcionales entre productos génicos a escala genómica.