Name: La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a producir vectores lentivirales para la entrega de genes en células del sistema nervioso central. Este protocolo detalla la producción, purificación y titulación usando células 293T y ultracentrifugación.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH Blueprint Neurociencia básica de subvención (P30 NS057105, BJS) de la Universidad de Washington, el Programa de Proyecto de Donación NS032636 (BJS) y por el Centro de Esperanza para los Trastornos Neurológicos.

1. Embalaje de vectores lentiviral Lentiviral vectores son producidos por cotransfección de un vector de transferencia lentiviral y otros plásmidos necesarios para el envasado en células 293T por el método de transfección con fosfato de calcio. Usamos 10 de 100 mm placas de cultivo de tejidos en este protocolo. Se puede escalar hacia arriba o hacia abajo dependiendo de las aplicaciones. La línea celular 293T se mantiene en modificado de Dulbecco medio Eagles (DMEM) con glucosa alta (4500 mg / l), suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C incubadora con 5% de CO 2. <ol><li> Semillas 293T células de la confluencia del 30-40% a 10 de 100 mm placas de cultivo de tejidos (3 x 10 6 células / placa) en medio de cultivo. Volver a las células a la incubadora. </li><li> Después de 20-24 h de cultivo, comprobar la densidad de las células. Las células debe ser aproximadamente 80% de confluencia en el momento de la transfección. </li><li> Preparar un tubo de 50 ml. Añadir 4,4 ml TE79/10 (1 mM Tris HCl, 0,1 mMEDTA, pH 7,9) menos el volumen total del ADN plásmido siguiente. Añadir 100 g de transferencia lentiviral plásmido (Figura 1), 58 g pMDLg / pRRE, 31 ug pCMV-T, 25 mg pRSV-Ap, 600 l 2M CaCl 2. Mezclar con cuidado. </li><li> Preparar otro tubo de 50 ml. Añadir 5 ml de 2x HBS (0,05 M, HEPES 0,28 M NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 7,12). </li><li> Tomar la ADN-CaCl 2 por mezcla de 10 ml pipeta y añadir al tubo que contenía 2 x HBS, gota a gota mientras que el tubo vortex. </li><li> Mantener la reacción de precipitación a temperatura ambiente (TA) durante 30 min. </li><li> Retire las placas de cultivo de la incubadora. Mezclar la reacción de precipitación adecuadamente por agitación. Añadir 1 ml de suspensión a cada uno de las células del plato de 100 mm que contienen. La suspensión se debe añadir lentamente, gota a gota mientras agita suavemente el medio en el plato. Volver estas placas en la estufa y se deja durante 5 horas. </li><li> Retire el medio de la cultura. Añadir 6 ml de medio de cultivo fresco que contiene 6 mM de sodio butyrate a cada plato. Volver a los cultivos a la incubadora. Después de cultivo durante la noche, si hay un reportero fluorescente en el constructo, comprobar la expresión del gen bajo microscopio de fluorescencia. Por lo general, más del 80% de las células expresan el gen reportero si es impulsado por un promotor ubicuo (por ejemplo, promotor CMV). </li><li> Dos días (40-44 h) después de la transfección, recoger el líquido sobrenadante de 10 platos en 2 50-ml tubos (aproximadamente 30 ml cada tubo). Congelar el sobrenadante en el congelador de -80 º C o ir al siguiente paso. </li></ol> 2. La concentración y purificación de los Vectores <ol><li> Centrifugar el recién recogida o descongelado sobrenadante a 900 g (aproximadamente 2000 rpm) durante 10 minutos para eliminar cualquier residuo de células en el sobrenadante. </li><li> Coloque una jeringa de 60 ml a un filtro de 0,2-m SFCA jeringa. Transferir el sobrenadante de 50-ml tubo de la jeringa. Se filtra el sobrenadante en un tubo de centrífuga de polialómero. </li><li> Tomar 5 ml de sacarosa 20% (preparado en PBS) en una pipeta de 5 ml. Insertarla pipeta a la parte inferior del tubo de centrífuga que contiene sobrenadante. Añadir lentamente la solución de sacarosa en el sobrenadante del vector. Repita estos pasos con sobrenadante de otro tubo. </li><li> Centrifugar el sobrenadante a 11000 rpm y 4 ° C durante 4 h con rotor Beckman SW28 oscilación. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Añadir 150 l de lactosa 4% (preparado en PBS) a cada tubo de centrífuga. Resuspender las pastillas. </li><li> Transferir el vector de concentrado de todos los tubos de centrífuga a un tubo de 1,5 ml. Dejar el tubo en hielo durante 15 min. </li><li> Mezclar la suspensión de vectores con la pipeta. Gira con la microcentrífuga a máxima velocidad (alrededor de 16.000 g) durante 1 min. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Divida la muestra final en 20 ml de alícuotas y se almacenan en -80 ° C congelador. </li></ol> 3. Valoración de los Vectores <ol><li> Semillas de 5 x 10 4 / pocillo de células HT1080 en 12-pocillos en 1 ml de medio DMEM suplementado con FBS al 10%. </li><li> Después de Overnigla cultura ht, contar las células de un bien y anotar el número de células. </li><li> Hacer 5-pliegue dilución en serie (1:5, 1: 25; 1:125, y 1:625) del vector de concentrado con medio de cultivo. Añadir I l de cada vector diluido a los pocillos separados. Las muestras pueden ser duplicados para aumentar la precisión. </li><li> Añadir 1 l de 4 mg / ml de polibreno (Hexadimetrina Bromuro) en cada vector que contiene bien y en un pozo sin vectorial. Mezcle agitando suavemente la placa. Volver a la incubadora durante 48 h. </li><li> Quitar medio de los pocillos de cultivo de células. Lavar cada pocillo con PBS. Añadir 250 l 1x tripsina-EDTA solución a las células. Cuando las células se separan (3-5 minutos), añadir 1 ml de medio de cultivo. Resuspender las células mediante pipeteo. Transferir la suspensión de células a tubos de 1,5 ml de centrífuga. </li><li> Centrifugar a 900 g durante 6 minutos. Para los vectores con un gen indicador fluorescente (GFP, por ejemplo), vaya al paso 3.7 para el análisis de FACS. Para los vectores sin un periodista, vaya al paso 3.8 para qPCR en tiempo real. </li><li> Para los vectores que contienen un fluogen reportero fluorescentes, separar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 300 l de 3,7% de formaldehído en PBS. Determinar el porcentaje de las células informadoras positivos por análisis FACS. El título se representa como unidades de transducción por mililitro concentrado vector (TU / ml). </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> Por ejemplo, si 1 x 10 5 células transducidas con l fue 1/25 (0,04 l) vector y las células 30% son reportero positivo, el título será: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> Sólo utilizar las diluciones caer en una relación lineal entre el porcentaje de células positivas y la cantidad de vector añadido para calcular título. El título final debe ser un promedio de los títulos obtenidos a partir de transducciones de al menos 2 diferentes cantidades del vector. <ol start="8"><li> Para los vectores sin ungen reportero fluorescente, extraer el ADN genómico de las células HT1080 con QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), según el protocolo del fabricante. Amplificar la secuencia del vector en el ADN genómico utilizando ABI Prism 7000 secuencia sistema de detección (Applied Biosystems) con los cebadores (VIH-1 en PBS / psi región 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;y 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;, y sonda TaqMan 5 &#39;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3&#39;. Gen de la albúmina que es un gen de copia única en el genoma (2 copias / célula) también fue amplificado con los primers 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &#39;y 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&#39;, y la sonda de 5&#39;-FAM-TAMRA TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-3- &quot;como un control interno. Determinar el número de copias del vector y la albúmina por PCR en placa de 96 pocillos de acuerdo con la fabricación de instrucción con el siguiente programa: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, y 35 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 2 min. Diez veces diluciones seriadas de los plásmidos de concentración conocida y representada como una copianúmero) que contiene las secuencias modelo también debe ser amplificada para crear una curva estándar para la cuantificación de muestras desconocidas. El título se representa como unidades de integración por mililitro concentrado vector (UI / ml). </li></ol><img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. Transducción de las Culturas neocorticales Culturas neocorticales que contienen tanto las neuronas y glía se preparó a partir de cortezas de ratón utilizando un procedimiento de chapado de dos pasos como se ha descrito previamente 18. Neocorteza obtenidos de ratones fetales en 14-16 días de gestación se sembraron en una monocapa previamente establecido gliales en MEM suplementado con FBS al 10%, 20 mM de glucosa y glutamina 2 mM en 24-así placa de cultivo de tejido. <ol><li> Después de 5 días in vitro, añadir 10 mM citosina arabinósido (Ara-C) en NEOCcultura ortical para inhibir no neuronal división celular. Continuar cultivar las células durante 2 días. </li><li> Medio de cultivo en caliente 37 ° C baño de agua durante 5-10 minutos. Sustituir Ara-C que contiene el medio con medio de cultivo fresco (500 l / pocillo). </li><li> Añadir vector con deseado MOI (multiplicidad de infección; la relación del número de partículas de vectores para el número de células diana) para el cultivo. Continuar la cultura durante 24 horas. Usamos MOI de 1-10 (generalmente 5) en cultivos primarios corticales. </li><li> Sustituir el medio de cultivo con medio fresco. Continuar la cultura. Si hay un gen reportero en la construcción de vectores, visita células bajo microscopio fluorescente 2 días después de la transducción. La expresión del gen será visible en las neuronas 2-7 después de la transducción, dependiendo del diseño del vector y la dosis utilizada. </li></ol> 5. Los resultados representativos Los títulos de los vectores lentivirales producidos con este rango de protocolo de 10 8 -10 10 UI / ml, which son adecuados para la transducción de una variedad de tipos de células a partir del SNC, tanto in vitro como in vivo. Tabla 1 y Figura 2 muestran un resultado representativo utilizando los vectores producidos por este protocolo. Nos transducidas murinos culturas neocorticales con vectores lentivirales que expresan la proteína verde fluorescente (GFP), controlada por sinapsina (SYN) promotor o promotor de la proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Siete días después de la transducción, se realizó inmunotinción a las neuronas y astrocitos de la etiqueta con anticuerpos anti-NeuN y anti-GFAP, respectivamente. Como se muestra en la tabla 1 y fig. 2A, después de la transducción con el vector que lleva el promotor sinapsina, más del 90% de las neuronas (células NeuN +) expresa las buenas prácticas agrarias y los astrocitos no (GFAP + en las células) expresan este gen reportero. Cuando promotor GFAP se utiliza en la construcción de vectores (Fig. 2B), alrededor del 80% de los astrocitos (GFAP + células) expresións las buenas prácticas agrarias; todos GFP + células son los astrocitos según lo confirmado por colocalización con Bosnia y Herzegovina y la ausencia de expresión de GFP en las células NeuN marcadas. Estos resultados demuestran que los vectores lentiviral son muy eficientes para entregar los transgenes de las células de SNC y células específicas de la expresión génica puede lograrse cuando se utilizan promotores apropiados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática de VIH-vectores basados ​​en lentivirus y los plásmidos de embalaje. El VIH-1 provirus se muestra en la parte superior. Los elementos para la producción de vectores están separados en cuatro diferentes plásmidos. La transferencia del plásmido lentiviral contiene un híbrido LTR 5 &#39;en la que se sustituye la región U3 con el citomegalovirus (CMV), la señal de empaquetamiento (ψ), la secuencia RRE, el tracto polipurina central (cPPT), un gen de interés (por ejemplo un reportero fluorescente), junto con un promotor de la elección, y LTR 3 &#39;en la que elsecuencias reguladoras cis se elimina completamente de la región U3. pMDLg / pRRE contiene los genes gag y pol y secuencia RRE de VIH-1 bajo el control del promotor CMV. pRSV-Ap contiene la secuencia codificante de Rev impulsado por el promotor RSV. pCMV-G contiene el gen de la proteína VSV-G bajo el control del promotor CMV. PA indica la señal de poliadenilación de β-globina humana gen. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> Figura 2. Expresión de genes reporteros en el ratón cultivo mixto neocortical transducidas con vectores lentivirales que llevan el tipo de células específicas de los promotores. Los cultivos fueron transducidas con el LV-SYN-GFP (A) o LV-GFAP-GFP vectores (B) a una MOI de 5. Siete días después de la transducción, las células se immunostained con anticuerpo anti-NeuN o anti-GFAP. Los paneles superiores muestran la fluorescencia de GFP, los paneles centrales muestran inmunotinción y los paneles inferiores se fusionan imágenes (GFP: verde; NeuN y GFAP: rojo). </p&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Vector </td><td> GFP + células en las neuronas </td><td> GFP + en los astrocitos </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92,2 ± 7,3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78,3 ± 11,5 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Comparación de la expresión de GFP en murinos culturas neocorticales transducidas con vectores lentivirales que llevan a diferentes promotores. unas culturas murinos neocorticales (5 x 10 5 / bien en placa de 24 pocillos) fueron transducidas con el LV-SYN-GFP o LV-GFAP-GFP en una MOI de 5. Siete días después de la transducción, las culturas se fijaron y se immunostained para NeuN y GFAP. El número de células GFP y NeuN / GFAP que expresan fueron contadas en imágenes de 10 campos por condición experimental. Los valores representan el porcentaje de las neuronas (células NeuN +) oastrocitos (GFAP + en las células), que también expresa el gen reportero GFP. Los valores mostrados son medias ± SD de tres experimentos independientes.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este protocolo, se ha demostrado la producción de vectores lentivirales y la aplicación de estos vectores en cultivos neocorticales. Hemos demostrado eficaz y tipo de células específicas de transducción con los vectores producidos por estos métodos. Cuando el promotor sinapsina se utiliza, la expresión de GFP es estrictamente neurona específica. Cuando el promotor de GFAP se utiliza, la expresión de GFP es exclusivamente en los astrocitos. Si ningún tipo de células específicas de expresión se requiere, un promotor ub...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> Butirato sódico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimetrina bromuro (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> Células 293T </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> Células HT1080 </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> Falcon 100 x 20 mm de tejido CULTURAe plato </td><td> BD Biosciences </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 1 x 3 ½ en el tubo de centrífuga polyallomoer </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0.2 micras filtro de jeringa </td><td> Corning </td><td> 431219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

la producción de vectores lentivirales de células transductoras del sistema nervioso central

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

La entrega eficiente de genes en el sistema nervioso central (SNC) es importante para estudiar las funciones génicas, modelar enfermedades neurológicas y desarrollar enfoques terapéuticos. Los vectores lentivirales son herramientas atractivas para la transducción de neuronas y otros tipos celulares en el SNC, ya que pueden transducir tanto células en división como no divididas, permiten una expresión sostenida de transgenes y tienen una capacidad de empaquetamiento relativamente grande y baja toxicidad 1-3. Los vectores lentivirales se han utilizado con éxito para transducir muchos tipos de células neurales in vitro 4-6 y en animales 7-10.
Se han realizado grandes esfuerzos para desarrollar vectores lentivirales con mayor seguridad biológica y eficiencia en la entrega de genes. Los actuales vectores lentivirales de tercera generación, defectivos para la replicación e inactivantes por sí mismos (SIN), se muestran en la Figura 1. Los elementos necesarios para el empaquetamiento del vector se distribuyen en cuatro plásmidos. En el plásmido de transferencia lentiviral, la región U3 del extremo largo terminal (LTR) 5' se sustituye por un promotor fuerte de otro virus. Esta modificación permite la transcripción de la secuencia del vector de forma independiente de la proteína Tat del VIH-1, que normalmente es necesaria para la expresión génica del VIH11. La señal de empaquetamiento (Ψ) es esencial para la encapsidación, y el elemento de respuesta a Rev (RRE) es necesario para producir vectores de alto título. El tracto polipurínico central (cPPT) es importante para la importación nuclear del ADN del vector, una característica necesaria para la transducción de células no divididas12. En el LTR 3', las secuencias reguladoras en cis se eliminan completamente de la región U3. Esta deleción se copia al LTR 5' tras la transcripción inversa, lo que resulta en la inactivación transcripcional de ambos LTR. El plásmido pMDLg/pRRE contiene los genes gag/pol del VIH-1, que proporcionan las proteínas estructurales y la transcriptasa inversa. El plásmido pRSV-Rev codifica la proteína Rev, que se une al RRE para facilitar una exportación eficiente del ARN desde el núcleo. El plásmido pCMV-G codifica la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), que sustituye a la Env del VIH-1. La VSV-G amplía el tropismo de los vectores y permite su concentración mediante ultracentrifugación13. Todos los genes que codifican las proteínas accesorias, incluyendo Vif, Vpr, Vpu y Nef, se excluyen del sistema de empaquetamiento. La producción y manipulación de vectores lentivirales debe realizarse de acuerdo con las directrices del NIH para investigaciones que involucren ADN recombinante (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). Puede requerirse la aprobación del Comité Institucional de Seguridad Biológica y Química antes de utilizar vectores lentivirales. Los vectores lentivirales se producen comúnmente mediante la cotransfección de células 293T con el plásmido de transferencia lentiviral y los plásmidos auxiliares que codifican las proteínas necesarias para el empaquetamiento del vector. Muchos plásmidos de transferencia lentiviral y plásmidos auxiliares pueden obtenerse de Addgene, un repositorio sin fines de lucro de plásmidos (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Se han desarrollado algunas líneas celulares estables de empaquetamiento, pero estos sistemas ofrecen menor flexibilidad y su eficiencia de empaquetamiento generalmente disminuye con el tiempo14,15. Los kits comerciales de transfección pueden permitir una transfección de alta eficiencia16, pero pueden resultar muy costosos para preparaciones a gran escala del vector. Los métodos de precipitación con fosfato de calcio proporcionan una transfección altamente eficiente de las células 293T y, por tanto, representan un enfoque confiable y rentable para la producción de vectores lentivirales.
En este protocolo, producimos vectores lentivirales mediante la cotransfección de células 293T con cuatro plásmidos basada en el principio de precipitación con fosfato de calcio, seguida de purificación y concentración mediante ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa al 20%. Los títulos vectoriales se determinan mediante análisis de clasificación fluorescente de células (FACS) o mediante qPCR en tiempo real. La producción y titulación de vectores lentivirales en este protocolo puede completarse en 9 días. Proporcionamos un ejemplo de transducción de estos vectores en cultivos neocorticales de ratón que contienen tanto neuronas como astrocitos. Demostramos que los vectores lentivirales permiten una alta eficiencia de transducción y expresión génica específica de tipo celular en células primarias cultivadas del SNC.

En este protocolo se describe la producción, purificación y valoración de lentiviral vectores. Se presenta un ejemplo de entrega gen vector lentiviral mediada por neuronas cultivadas en la enseñanza primaria y astrocitos. Nuestros métodos pueden aplicarse también a otros tipos de células<em&gt; In vitro</em&gt; Y<em&gt; En vivo</em&gt;.

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

La entrega eficiente de genes en el sistema nervioso central (SNC) es fundamental para estudiar las funciones génicas, modelar enfermedades neurológicas y desarrollar...

El objetivo general de este procedimiento es producir vectores lentivirales para la entrega de transgenes en células del sistema nervioso central. Esto se logra primero mediante la transfección simultánea de plásmidos de transferencia lentiviral y plásmidos auxiliares en células 293T, utilizando el principio de precipitación con fosfato de calcio. El segundo paso del procedimiento consiste en purificar y concentrar el sobrenadante vectorial mediante ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa al 20 %.El tercer paso consiste en determinar el título del vector mediante análisis por fax o PCR cuantitativa en tiempo real. El paso final del procedimiento es transducir el vector a las células diana. Finalmente, la eficiencia de transducción en función de la especificidad del tipo celular puede demostrarse mediante tinción inmunológica de las células diana que expresan el transgén.La principal ventaja de nuestra técnica frente a otros métodos existentes, como el uso de kits comerciales, es que proporciona un enfoque costoso, eficaz y fiable para la producción de vectores lentivirales. Por lo tanto, este método puede aportar información sobre la entrega de transgenes en células del SNC. También puede aplicarse a otros tipos celulares in vivo e in vitro. Los vectores lentivirales se producen mediante la transfección conjunta de plásmidos en células 293T.La línea celular 293T debe mantenerse en DMEM modificado para este experimento. Siembre diez placas de cultivo de cien milímetros con células 293T al 30-40 % de confluencia. Tras 20 a 24 horas de cultivo, las células deben alcanzar aproximadamente el 80 % de confluencia y, por lo tanto, estar listas para la transfección.Para la transfección, agregue todos los plásmidos requeridos a un tubo de 50 mililitros y complete el tubo hasta 4,4 mililitros con TE 7 9 10. Luego agregue 0,6 mililitros de cloruro de calcio dos molar y mezcle suavemente el tubo. Prepare otro tubo de 50 mililitros con cinco mililitros de HBS 2X. Añada la mezcla de plásmido y cloruro de calcio al HBS gota a gota mientras agita la mezcla en vórtex.Ahora, durante los próximos 30 minutos, permita que se forme un precipitado a temperatura ambiente. Recoja las placas de cultivo del incubador y, una vez que se forme el precipitado en suspensión, agregue un mililitro de la suspensión a cada placa gota a gota utilizando un vórtex.Mientras se agita suavemente el medio en la placa. Agite brevemente el tubo antes de transferir la suspensión a la siguiente placa. Devuelva las placas cargadas al incubador.Deje que los plásmidos transfecten las células durante cinco horas. Después de cinco horas, sustituya el medio por seis mililitros de medio que contenga seis milimolares de butirato de sodio.Luego, devuelva los cultivos al incubador al día siguiente. Si se utilizó un reportero fluorescente expresado de forma ubicua, verifique su expresión bajo un microscopio fluorescente. Por lo general, más del 80 % de las células expresan el gen reportero.Dos días después de la transfección, recoger el SANE de las placas en dos tubos de 50 mililitros, lo que debería sumar aproximadamente 30 mililitros por tubo. En este punto, el sobrenadante puede almacenarse a menos 80 grados Celsius antes de continuar. Comience por centrifugar el sobrenadante recogido de las placas de transfección para eliminar cualquier resto celular.Mientras tanto, conecte una jeringa de 60 mililitros a un filtro de jeringa SFCA de 0,2 micrones. A continuación, vierta el sobrenadante en la jeringa. Luego, empuje el émbolo para filtrar el sobrenadante hacia un tubo de centrífuga de polímero de 38 mililitros que sea compatible con un rotor de balanceo.Ahora cargue una pipeta de cinco mililitros con cinco mililitros de sacarosa al 20 % en PBS. Introduzca la pipeta hasta el fondo del tubo de centrífuga que contiene el sobrenadante y agregue lentamente la solución de sacarosa debajo del sobrenadante que contiene el vector. A continuación, centrifugue el SNAT durante cuatro horas en un Beckman SW 28; inmediatamente después de la centrifugación, vierta y deseche el sobrenad游戏副本A continuación, mezcle la suspensión mediante pipeteo y luego centrifúguela en una microcentrífuga a velocidad máxima durante un minuto; transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y divida el vector concentrado en alícuotas de 20 microlitros para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius. Para titular el vector, siembre primero células HT1080 en una placa de 12 pocillos con un mililitro de DMEM suplementado en cada pocillo. Tras un cultivo nocturno, cuente las células de un pocillo y anote el número de células.Ahora, prepare una serie de diluciones seriadas cinco veces del vector concentrado en medio de cultivo. Luego, agregue un microlitro de cada vector diluido a un pozo separado; las muestras pueden duplicarse, pero deje al menos un pozo sin vector como control negativo. A continuación, agregue un microlitro de poli cerebro a cada pozo y mezcle la placa con agitación suave.Devuelva la placa al incubador durante 48 horas. Dos días después, retire el medio de cada pocillo y lave las células con PPS. A continuación, tripsinice las células y resuspenda en un mililitro de medio de cultivo transfiriendo las suspensiones celulares mediante pipeta a tubos de 1,5 mililitros y centrifugue para recoger los pellet celulares.Si los vectores contienen un gen reportero fluorescente, resuspenda el precipitado en 300 microlitros de formaldehído al 3,7 % en PBS, luego determine el porcentaje de células positivas mediante análisis de citometría de flujo y calcule la titulación. Si no se utilizó un gen reportero fluorescente, extraiga el ADN genómico de las células utilizando un kit disponible comercialmente. Luego, amplifique la secuencia del vector mediante PCR en tiempo real.Cree una curva patrón amplificando la secuencia molde de un plásmido con un número de copias conocido en una serie de diluciones de diez veces. Luego, calcule la titulación en unidades de integración por mililitro. Prepare cultivos de neocorteza que contengan neuronas y glía a partir de cortezas de ratón utilizando un procedimiento previamente descrito en dos pasos, en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos con MEM suplementado después de cinco días.In vitro, agregue 10 micromoles de RSC para inhibir la división de células no neuronales. A continuación, continúe el cultivo durante dos días, teniendo cuidado de que las células no se sequen durante los cambios de medio. Después de dos días, reemplace el medio que contiene RC con medio recién preparado y tibio, utilizando medio mililitro.Luego, agregue el vector al MOI deseado a la cultura y continúe cultivando las células durante 24 horas. Después de 24 horas, cambie el medio y, tras 48 horas, si hay un gen reportero, examine las células bajo un microscopio fluorescente; la expresión del reportero debería ser visible en las neuronas entre dos y siete días después de la transfección. Dependiendo del diseño del vector y de la dosis, los títulos de vectores lentivirales producidos con este protocolo oscilan entre 10⁸ y 10¹⁰.Unidades de integración por mililitro, lo cual es adecuado para la transducción in vitro o in vivo de muchas células del SNC. Por lo tanto, cultivos neocorticales murinos fueron transducidos con vectores lentivirales que expresan GFP controlado por un promotor de sinapsina o por un promotor A-G-F-A-P. Siete días después de la transducción, se realizó inmunohistoquímica en el vector que porta el promotor de sinapsina.Más del 90 % de las neuronas identificadas como nuevas células positivas expresaron GFP, mientras que ninguna de las astrocitos identificadas como células positivas para GFAP expresaron. El gen reportero en células transducidas con los vectores que contienen el promotor A-G-F-A-P. Aproximadamente el 80 % de los astrocitos expresaron GFP, pero ninguna de las neuronas nuevas y marcadas expresó GFP.Estos resultados demuestran que los vectores lentivirales son muy eficientes para entregar transgenes a las células del sistema nervioso central. Además, se puede lograr una expresión génica específica de células cuando se utilizan promotores adecuados. Los vectores virales de Lindsey se han utilizado ampliamente para sobreexpresar y silenciar genes de interés en el sistema nervioso central.Nuestro protocolo debería ser útil para otros investigadores que deseen utilizar estos métodos en sus laboratorios.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Para que los lentivirus, los vectores de ADN se transfectadas en células humanas 293. Después de la cosecha y la concentración del sobrenadante, título del virus se determina mediante la expresión de fluorescencia con un citómetro de flujo.

Lentivirus de producción

Lentiviral vectores de expresión son los medios más eficaces para que expresan establemente diferentes moléculas efectoras o reportero construcciones para dividir y no dividir las células de mamíferos y organismos enteros. A continuación presentamos un protocolo sobre cómo empaquetar construcciones lentivirus de expresión en las partículas pseudoviral y la transducción de las células diana utilizando las partículas pseudoviral.

Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

Aquí, nosotros usamos la transducción retroviral y transfección concatemeric para crear una línea de células que pueden expresar las componentes de un vector lentiviral (VI) en ausencia de tetraciclina. Esta LV codifica GFP y se pseudotyped con una glicoproteína, SVGmu, que es específico para un receptor en las células dendríticas.

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Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

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Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

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Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

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Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.

Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)

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Preparación de vectores lentivirales para la modulación eficiente de genes y microARN de macrófagos residentes en el tejido de la cavidad peritoneal in vivo en ratones

Aprende a producir vectores lentivirales para la entrega de genes en células del sistema nervioso central. Este protocolo detalla la producción, purificación y titulación usando células 293T y ultracentrifugación.

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

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