Un enfoque semi-cuantitativo para evaluar la formación de biopelículas Con el desarrollo de colonias arrugada

El objetivo general de este procedimiento es identificar y medir los cambios en la formación de biopelículas mediante la evaluación del desarrollo de la formación de colonias arrugadas a lo largo del tiempo. Esto se logra primero cultivando cepas bacterianas de interés en cultivo líquido. El segundo paso consiste en colocar los cultivos sobre agar nutritivo.

A continuación, se monitorean las colonias a lo largo del tiempo para identificar el momento en que comienzan a desarrollar estructuras tridimensionales indicativas del inicio de la formación de colonias arrugadas. Se sigue el desarrollo de la morfología colonial hasta que no se visualizan cambios adicionales. Finalmente, se utiliza microscopía de las colonias para mostrar diferencias en el desarrollo de biopelículas a lo largo del tiempo por cepas específicas o bajo condiciones específicas, de manera semicuantitativa.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite un análisis semicuantitativo de la formación de biopelículas bacterianas mediante el desarrollo de una morfología de colonia arrugada. Aunque este método puede aportar información sobre la formación de biopelículas en Vireo fishery, también puede aplicarse a la caracterización de fenotipos de biopelícula en otros sistemas bacterianos como basc, slus, pseudomonas osa y vial cholera. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando identificamos mutantes bacterianos que mostraban un retraso en el desarrollo de la formación de colonias arrugadas.

La formación de biopelículas generalmente está influenciada por la densidad celular y la velocidad de crecimiento. Por lo tanto, antes de evaluar la morfología de colonias arrugadas, se debe determinar la velocidad de crecimiento y el rendimiento de las cepas de interés. Mida el aumento en la densidad óptica o DO de cada cepa a lo largo del tiempo y trace una curva de crecimiento para determinar el rendimiento o el número final de células.

Se puede utilizar un ensayo de siembra celular. Las cepas bacterianas de interés se cultivan en medio líquido, y luego se siembran diluciones de los cultivos en placas de agar. Tras la incubación, se calcula el número de células viables y se representa gráficamente como se muestra aquí.

También es importante identificar las mejores condiciones de inoculación que revelen las diferencias más notorias entre el control y el mutante de interés. Para lograrlo, antes de realizar la inoculación, cultive cepas en crecimiento en caldo bajo diversas condiciones, como diferentes medios o temperaturas, y en distintas fases de crecimiento, como la fase exponencial o la fase estacionaria. Inocule 10 microlitros de cultivo con diversas densidades celulares en el medio apropiado e incube a la temperatura deseada hasta que las morfologías de las colonias sean evidentes. De este modo, se puede determinar la DO óptima inicial para un conjunto determinado de cepas o condiciones con el fin de comenzar este procedimiento.

Inocule células de Fisher de placas de agar en cinco mililitros de medio de sal LB o LBS que contenga los antibióticos necesarios, e incube con agitación a 28 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, realice un subcultivo de las células con una dilución uno a 100 en cinco mililitros de medio LBS fresco e incube bajo las mismas condiciones hasta que las células alcancen la DO deseada a 600 nanómetros. Para Vibrio fii, se obtienen los mejores resultados cuando las colonias se generan a partir de cultivos con una DO de aproximadamente 0,2. A continuación, pipetee un mililitro de cada cultivo en un tubo microfuga y centrifugue a velocidad máxima.

Durante un minuto, elimine el sobrenadante por aspiración y resuspenda el precipitado en un mililitro de agua de mar artificial estéril al 70 % o en una centrífuga de SW. Este paso de lavado eliminará nuevamente los restos de medio y los componentes extracelulares. Tras la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado lavado en un mililitro de SW al 70 % para asegurar que cada muestra contenga el número de células estimado mediante la DO a 600 nanómetros.

Realice los ajustes necesarios diluyendo muestras más concentradas con 70 %A SW adicional. Aplique 10 microlitros de cada cultivo en placas LBS que contengan los antibióticos necesarios. Asegúrese de mantener la pipeta con el dedo justo por encima de la superficie del agar y aplique la muestra verticalmente, no en ángulo. Expulse el líquido lentamente para lograr una distribución uniforme del punto. Incluya los controles positivo y negativo apropiados en la misma placa.

Al evaluar la formación de colonias arrugadas como placas menores, la variación AFL puede afectar el desarrollo del biofilm. El aspecto más difícil de este procedimiento es identificar el inicio de la formación de colonias arrugadas. A veces, solo es evidente después de que ha comenzado el desarrollo.

Para capturar el inicio del desarrollo de colonias arrugadas, tomamos puntos temporales cada hora dentro de un período específico. Esto también nos permite retroceder y realizar comparaciones después de que el desarrollo haya comenzado. Para asegurar que el cultivo en el punto permanezca uniformemente distribuido, permita que la gota se seque antes de mover la placa al incubador, invierta las placas e incube a 28 grados Celsius.

Una forma de evaluar la morfología de los cultivos punteados es mediante un ensayo de punto final, que consiste en la evaluación de la formación de colonias arrugadas en un punto de tiempo predeterminado tras el punteo. Este es un resultado representativo de un ensayo de punto final en el que se evaluó la formación de colonias arrugadas. Cuarenta horas después del punteo, se muestra a la izquierda una cepa de Vibrio FII que no forma biopelícula y a la derecha una cepa formadora de biopelícula.

El ensayo de punto final es útil para cepas que exhiben o se propone que exhiben defectos severos en la formación de biopelículas. Otro ensayo para evaluar la morfología de la colonia es un ensayo de curso temporal en el que se evalúa la formación de colonias arrugadas durante un período de tiempo posterior al inoculado para facilitar el seguimiento del tiempo transcurrido desde el inoculado. Configure un temporizador para contar hacia arriba.

En esta demostración, se monitoreará cada hora la morfología del punto en crecimiento, comenzando entre 12 y 15 horas después de la siembra, utilizando un microscopio estereoscópico con una cámara acoplada y software de adquisición y análisis de imágenes. Se utilizan programas informáticos para observar y documentar la morfología de la colonia y para evaluar el inicio y la progresión de la formación de colonias arrugadas. Antes de obtener imágenes de los cultivos sembrados, normalmente se retira la tapa de la placa de Petri para obtener la imagen más nítida posible.

Aquí, los cultivos se iluminan desde abajo a través de una plataforma de vidrio transparente con una fuente de luz fría, mientras que las imágenes se capturan desde arriba. Este montaje es óptimo para la obtención de imágenes del desarrollo de colonias arrugadas porque las colonias de Vibrio fisheri son translúcidas. Para visualizar mejor el desarrollo de colonias arrugadas, ajuste tanto la intensidad de la iluminación como el ángulo de reflexión por debajo de las colonias bacterianas, de modo que pueda distinguirse la morfología tridimensional de los biofilms en desarrollo.

Determine las condiciones óptimas de iluminación que proporcionen el mayor contraste entre la colonia punteada y el fondo de agar circundante. Es importante utilizar siempre la misma magnificación al obtener imágenes durante todo el experimento, utilizando la palanca situada en la parte trasera de la cámara; cambie la vista desde el ocular del microscopio a la pantalla del ordenador, ajuste la imagen, enfoque adecuadamente y luego capture la imagen. Obtenga imágenes adecuadas para documentar el inicio y el desarrollo de la formación de colonias arrugadas. El experimento finaliza cuando ya no haya un desarrollo adicional del biofilm.

Al finalizar los experimentos realizados, las imágenes se consolidan en figuras para visualizar el desarrollo del patrón a lo largo del tiempo para cada cepa o condición. Observe cuánto tiempo transcurre desde el momento de la inoculación hasta el momento en que se inicia la formación de colonias arrugadas; el inicio de la formación de colonias arrugadas se define como el punto temporal en el que resulta aparente por primera vez la formación de patrones y estructuras tridimensionales. En este ejemplo, la iniciación de la formación de biopelícula es evidente a las 12 horas para una cepa control competente en biopelícula de Vibrio FII mostrada en el panel superior.

En el panel inferior, una imagen representativa de una cepa mutante de Vibrio FII que exhibe un retraso de cuatro horas en el inicio de la formación de colonias arrugadas a lo largo del tiempo, con la formación de biopelícula iniciándose a las 16 horas posteriores a la inoculación. Obsérvese que, aunque se observan diferencias sutiles entre estas cepas en los puntos temporales más tempranos a las 40 horas, las cepas presentan un aspecto similar en la intensidad y el patrón de formación de biopelícula en cada punto temporal posterior al inicio de la formación de colonias arrugadas. Debe anotarse el patrón de desarrollo de las colonias arrugadas.

La arquitectura puede desarrollarse desde el exterior hacia el interior, como se ilustra en el panel A, o puede desarrollarse desde el interior hacia el exterior, como se ilustra en el panel B. Esta evaluación proporciona un mecanismo para distinguir los biofilms formados por diferentes cepas o bajo distintas condiciones. Una segunda medida semicuantitativa de la formación de biofilm aprovecha el cambio en el diámetro de la colonia a lo largo del tiempo. Como se muestra en el panel superior, una cepa representativa de competencia para biofilm forma colonias que aumentan en complejidad y diámetro.

En contraste, otra cepa mostrada en el panel inferior no forma biopelículas. Finalmente, esta figura muestra una representación gráfica del aumento en el diámetro de la colonia a lo largo del tiempo. Para las mismas dos cepas, la cepa competente en biopelículas está representada por círculos blancos.

Mientras que la cepa que no forma biopelículas está representada por cuadrados negros. Este análisis reveló que el tamaño de las colonias competentes para formar biopelículas aumenta a una tasa mayor que el de las colonias negativas para biopelículas, y al punto final del tiempo, ambas difirieron en casi el doble. Al realizar este procedimiento, es importante recordar aplicar cuidadosamente cada cepa y documentar la formación de la colonia arrugada inicial para cada cepa.

Tras seguir este protocolo, se pueden realizar otros métodos, como un ensayo iCal o una tinción cristal violeta, con el fin de responder preguntas adicionales sobre los procesos implicados y la formación de biopelículas.