Un modelo humano las trompas de Falopio para la Investigación de

Chlamydia trachomatis es una bacteria gramnegativa, obligada intracelular. Se conocen diferentes serovares de clamidia que causan infecciones del ojo o del tracto genital. Las infecciones del tracto genital por Chlamydia trachomatis son la enfermedad de transmisión sexual más frecuente en el mundo.

Se encuentran con una prevalencia de casi 3 millones de infecciones reportadas en la Unión Europea desde 1990 hasta 2009. En 2009 se notificaron casi 400.000 casos. Aunque la salud pública y la educación sexual están mejorando constantemente, se detecta un aumento en la tasa de nuevas infecciones genitales por clamidia, pasando de 70.000 casos en 1990 a 400.000 casos en 2009.

El 75 % de todas las nuevas infecciones se notifican en personas jóvenes de entre 15 y 24 años. Se cree que las secuelas clínicas ocurren debido a una eliminación ineficiente de los patógenos, lo que puede provocar infecciones ascendentes desde el tracto genital inferior hasta el superior, y posteriormente causar daño inflamatorio crónico en el tejido infectado. Del 10 al 30 % de las mujeres infectadas con chlamydia tracheitis desarrollan una enfermedad inflamatoria pélvica (EIP), y hasta el 50 % de los casos de EIP se atribuyen a infecciones por chlamydia tracheitis.

Como consecuencia, en el 50 % de los pacientes con infertilidad tubárica y en el 40 % de los pacientes con embarazo ectópico, se encuentra *Chlamydia trachomatis* como el patógeno causal. En una mujer sana no infectada, el óvulo fertilizado migra a través de la trompa de Falopio hasta el útero, donde se desarrolla hasta el parto. En pacientes infectados, *Chlamydia* puede ascender desde el tracto genital inferior hasta la trompa de Falopio, desencadenando procesos inflamatorios crónicos.

Se considera que el daño inducido por patógenos en las células epiteliales y la pérdida de funciones epiteliales centrales causan finalmente la oclusión tubárica, lo que resulta en un transporte reducido o completamente abolido del óvulo desde los ovarios hasta el útero. A tal fin, se recolectan y almacenan trompas de Falopio humanas provenientes de mujeres sometidas a histerectomía. Las trompas se disecan y se abren cuidadosamente.

Según el diseño experimental, se cortan en pequeños especímenes e infectan con cuerpos elementales infecciosos de *Chlamydia trachomatis* durante 24 a 48 horas tras los respectivos puntos de tiempo. Los especímenes se fijan con fijador de Monty durante al menos tres días hasta su posterior preparación. Almacene las trompas de Falopio humanas (HFT) de mujeres sometidas a histerectomía inmediatamente después de la cirugía.

En RPMI que contiene 5 %FCS sin antibióticos a cuatro grados Celsius hasta su preparación. Diseque el tubo falopio humano en una placa de Petri que contenga RPMI con 5 %FCS sin antibióticos durante todo el procesamiento. El tubo debe estar sumergido en medio para evitar que se seque; corte y deseche el tejido conectivo y el tejido dañado durante la cirugía.

Después de la disección, abra cuidadosamente el TFM con un escalpelo pequeño. Evite el daño del tejido mediante un manejo descuidado con pinzas y escalpelo. Prepare pequeños fragmentos de tejido de un tamaño de cinco por cinco milímetros para la infección; almacene la muestra de TFM en un mililitro de RPMI que contenga 5 % de FCS sin antibióticos y agregue C track.

Los cuerpos elementales de la muestra HFT de OMAS se incuban durante un máximo de 48 horas a 37 grados Celsius, 5 %CO₂ y 20 %O₂ dentro de una incubadora normal o en un ambiente de bajo oxígeno, inferior al 5 %O₂ en una cámara de hipoxia. Tras los tiempos de incubación correspondientes, las muestras se recogen y almacenan en el fijador de Monty durante al menos tres días a cuatro grados Celsius hasta su preparación para microscopía electrónica de barrido (SEM) o microscopía electrónica de transmisión (TEM). El tejido fijado se corta en pequeños fragmentos, se lava e incuba con osmio al 1 % y tetraóxido durante la noche.

Después de varios pasos de lavado y secado, los especímenes deshidratados se transfieren a aite recién preparado y se polimerizan durante 48 horas a 60 grados Celsius. Después del recorte, se cortan secciones semifinas y ultradelgadas, que se transfieren a portaobjetos o rejillas, respectivamente. Después de la tinción, las secciones semifinas pueden examinarse mediante un microscopio óptico para microscopía electrónica de transmisión.

Retire el espécimen del fijador de Monty y córtele en trozos de hasta dos por dos por cinco milímetros. Después de lavar y la incubación con tampón diluido de sodio CCO y lavado con óxido de osmio y deshidratación y concentraciones ascendentes de etanol, transfiera el espécimen a una mezcla de 50% de óxido de propileno y aite durante la noche. Al día siguiente, transfiera a aite recién preparado durante al menos una hora.

Luego transfiera a moldes planos y llénelos con aite y deje que el aite polimerice durante 48 horas a 60 grados Celsius. Después de recortar la muestra embebida, corte secciones semifinas de aproximadamente 700 nanómetros o secciones ultradelgadas de 70 nanómetros utilizando un ultramicrotomo equipado con un cuchillo de vidrio o, preferiblemente, un cuchillo de diamante. Analice las secciones semifinas y ultradelgadas mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión. Para microscopía electrónica de barrido.

Los especímenes se sujetan con el epitelio hacia arriba sobre placas de corcho, se lavan y se deshidratan utilizando concentraciones crecientes de acetona. Después de secarlos en un secador de punto crítico, los especímenes se transfieren a un soporte para muestras de microscopía electrónica de barrido y se recubren con platino, oro o paladio mediante un evaporador de pulverización catódica. Luego están listos para ser analizados en un microscopio electrónico de barrido para microscopía electrónica de barrido.

Retire el espécimen del fijador de Monty y oriente el fragmento de tejido con el epitelio hacia arriba sobre una hoja de corcho, fijando su posición con agujas para insectos. Después de lavar con tampón de caco dilatado al sodio, seque el espécimen mediante un tratamiento con acetona en un secador de punto crítico. Tras transferir el espécimen del corcho a un soporte para microscopía electrónica de barrido (SEM), prepare un recubrimiento conductor de platino, oro o paladio sobre el espécimen utilizando un sputter coater; luego transfiera el espécimen pulverizado al microscopio electrónico de barrido para su análisis posterior.

La alta incidencia invariable de infecciones por lumus en mujeres y las enormes consecuencias clínicas de las infecciones al ascendentes constituyen la justificación para intensificar la investigación básica y traslacional en este campo. Hicimos uso de un modelo de tejido exvivo de la trompa de Falopio humano, previamente establecido por el grupo de St.Perus, para caracterizar morfológicamente el daño celular inducido por Chlamydia en la trompa de Falopio. Mediante el uso de este método, se observa la formación de inclusiones intracelulares en diferentes estadios de desarrollo, evidenciando tanto infecciones replicativas como persistentes.

Sin embargo, aún falta evidencia experimental sobre la presencia de clamidia persistente en el tejido de la trompa de Falopio humana, lo que requiere un análisis adicional de clamidia, descendencia y regulación positiva de la transcripción de genes de persistencia. Una de las limitaciones principales de este modelo es la ausencia de células inflamatorias, lo que dificulta el análisis de efectos secundarios derivados de la infección glaucomatosa inicial por KLA. No obstante, este modelo parece adecuado para analizar condiciones ambientales como el contenido de oxígeno en el contexto del daño celular epitelial de la trompa de Falopio, así como para analizar la respuesta inmunitaria inicial del huésped frente a la infección glaucomatosa aguda.

Uno de los objetivos futuros consiste en establecer un modelo más elaborado para la prueba de la CMI de las UTC en el modelo de tejido tubárico humano con pH controlado, y utilizar este modelo para definir realmente las distintas etapas de desarrollo de las CLI desde el punto de vista metabólico, haciendo uso de la técnica de microscopía de barrido láser de dos fotones.