Name: Un modelo humano las trompas de Falopio para la Investigación de C. trachomatis Infecciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a establecer un modelo ex vivo de trompas de Falopio humanas para estudiar infecciones por C. trachomatis. Este método permite analizar daño celular y respuestas inflamatorias en tejido humano real.

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Este trabajo fue apoyado por la DFG-Cluster de Excelencia &quot;La inflamación en las interfaces&quot; (AR-Si, RA-D). Estamos muy agradecidos por la excelente asistencia técnica de Kristin Wischnat.

1. Preparación de Chlamydia trachomatis serovar D de archivo <ol><li> Infect confluente 175 cm 2 frasco de cultivo celular que contiene células HeLa-229 con 4 ml C. trachomatis D en el SPG de amortiguamiento. </li><li> Incubar durante una hora a 37 ° C durante agitación constante. </li><li> Añadir 20 ml de DMEM con 10% de FCS y 240 l cicloheximida. </li><li> Incubar en una incubadora humidificada durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Añadir 5 ml de perlas de vidrio estériles y agitar fuerte para separar y destruir a C. trachomatis albergar HeLa-229 células. </li><li> Recoger el sobrenadante y añadir otros 5 ml de perlas de vidrio estériles. </li><li> Roca tres veces durante 1 min para destruir todas las células HeLa-229 y suelte C. trachomatis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI y 4 ° C para deshacerse de los desechos celulares. </li><li> Recoger el sobrenadante para la infección de 8 a 10 175 cm cultivo celular 2 matraces g confluenteRowN con HeLa 229 células. </li><li> Incubar cada matraz con 4 ml de tampón SPG y 4 ml de sobrenadante de la infección anterior durante una hora a 37 ° C con agitación constante. </li><li> Después de una hora añadir 15 ml de DMEM con 10% de FCS y 230 l cicloheximida seguido de 48 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Añadir 5 ml de perlas de vidrio estériles, agitar para separar y destruir a C. trachomatis albergar HeLa-229 células. </li><li> Recoger el sobrenadante y añadir otros 5 ml de perlas de vidrio estériles. </li><li> Roca tres veces durante 1 min para destruir todas las células HeLa-229 y suelte C. trachomatis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C para deshacerse de los desechos celulares. </li><li> Recoger el sobrenadante. </li><li> Llena 40 ml de sobrenadante en tubos Falcon de 50 ml y centrifugar durante 99 minutos con 11.000 RPMI. </li><li> Después de la centrifugación descartar el sobrenadante y lavar el precipitado con 1 ml de tampón SPG. </li><li> Homogeneizar elpellet en 1 ml y SPG l alícuota de 20 en un 1, 5 ml tubo Eppendorf, almacenar a -70 ° C hasta su uso. La actividad biológica de la población preparada se confirmó en una establecida HeLa-229 modelo de infección celular. </li></ol> 2. Preparación de las trompas de Falopio Humanos <ol><li> Tienda de trompas de Falopio humanas (HFT) de las mujeres sometidas a histerectomía inmediatamente después de la cirugía en RPMI que contiene 5% de FCS sin antibióticos en la 4 ° C hasta la preparación. El protocolo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Lübeck (09-153). Las mujeres incluidas en el estudio (edad 34 hasta 53) no tenían antecedentes de antes de C. trachomatis infección. Tejido de las trompas de Falopio se recogió en la esterilización periparto previa solicitud materna durante la cesárea o durante una histerectomía debido a fibromas uterinos sintomáticos en la fase lútea. Todos se pusieron a prueba HFT negativos para C. trachomatis por PCR. </li><li> Diseccionar el HFT en una placa de Petri que contiene RPMI con5% de FCS sin antibióticos. Durante el procesamiento de todo el tejido debe ser sumergido en un medio para prevenir el secado. </li><li> Corte y deseche el tejido conjuntivo y tejido destruido durante la cirugía. </li><li> Después de la disección abrir el HFT cuidadosamente con un pequeño bisturí. </li><li> Para más experimentos preparar piezas de tejido en el tamaño de 0,5 cm x 0,5 cm hasta 1 cm x 1 cm. </li><li> Para el modelo HFT infección almacén en 1 ml de RPMI que contiene 5% de FCS sin antibióticos. Las muestras fueron infectadas con el HFT 5.5x10 5 IFU (unidades formadoras de inclusión) de C. trachomatis. </li><li> Incubar espécimen HFT en 37 ° C, 5% de CO 2 y el 21% de O 2, así como en 37 ° C, 5% de CO 2 y 2% de O 2 durante 24 h. </li><li> Después de recolectar la muestra el tiempo de incubación y la tienda en fijador Monti por lo menos tres días a 4 ° C hasta su SEM / TEM preparación. </li></ol> 3. Preparación de la pieza HFT para TEM <ol><li> ParaTEM quitar muestra de fijador de Monti y corte de 2 x 2 mm a 4 x trozos de 5 mm. El tejido restante se puede utilizar para SEM. </li><li> Lavar las piezas con tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35 durante 1 h. </li><li> Incubar en 1% (w / v) de tetróxido de osmio en agua destilada. durante la noche. </li><li> Eliminar el exceso de tetróxido de osmio por lavado min 6x5 en tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35. </li><li> Eliminar el agua mediante la incubación en concentraciones crecientes de etanol en agua (v / v) (30% durante 2 h, 40% durante 2 h, 50% durante 2 h, 60% durante 2 h, 70% durante la noche, el 80% de 2 h, 90% durante 1 h, 95% durante 1 h, 100% durante 1 h. </li><li> Lavar etanol para 2 x 15 min en óxido de propileno y, posteriormente, transferir a una mezcla de 50% (v / v) Araldite recién preparada (incluyendo todos los componentes) en propileno y se incuba durante la noche. </li><li> Transferir a Araldite recién preparada (incluyendo todos los componentes) durante al menos 1 hora. </li><li> Traslado a la incrustación de moldes planos y se llenan de Araldite. </li><li> Vamos a endurecer durante aralditepor lo menos 48 horas a 60 ° C </li><li> Tras el recorte de la muestra integrada corte semi-secciones delgadas (700 nm) en un ultramicrotomo utilizar cuchillos de vidrio o un cuchillo de diamante histo y se tiñen con tinción de Richardson. </li><li> Corte secciones ultrafinas (aprox. 70 nm), utilizando un cuchillo de diamante y la transferencia a las redes de cobre (por ejemplo, 150 mallas cuadradas). </li><li> Mancha de ultra-delgadas secciones con acetato de uranilo 0,5% (w / v) en agua destilada. seguido por 3% (w / v) de citrato de plomo en agua destilada. en un teñidor sección automática. Alternativamente, las secciones se pueden teñir manualmente dejando rejillas 15 minutos en una solución saturada de acetato de uranilo centrifugada en agua destilada. seguido por citrato de plomo 0,3% (w / v) en agua destilada. </li></ol> 4. Preparación de la muestra HFT para SEM <ol><li> Para eliminar el SEM muestra de fijador de Monti, oriente con el epitelio hacia arriba en una hoja de 1,5 x 1 cm de corcho y de fijar la posición con agujas de insectos. </li><li> Transferir la muestra en el corcho a las cestas de metal adecuados ylavar durante 30 minutos en tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35. </li><li> Eliminar el agua mediante la incubación de la muestra en la creciente concentración de las mezclas de acetona / agua (v / v) 30% durante 6 h, 40% durante 6 h, 60% durante 8 h, 70% durante la noche, el 80% durante 2 h, 90% para 2 horas y 100% durante la noche (ser extremadamente cuidadoso para mantener la muestra continuamente sumergido). </li><li> Transferir a la acetona fresca 100% y la muestra seca mediante secado por punto crítico (temperatura 40 ° C, presión 80 bar). </li><li> Eliminar las agujas, de corcho y de muestras de pegamento con el epitelio hacia arriba en el monte de la muestra SEM equipado con una ficha de carbón conductor con un cemento de carbono conductor. Utilice conductora de plata líquida para mejorar la conductividad entre el monte y la ficha de carbono conductor. </li><li> Preparar un recubrimiento conductor de platino, oro o paladio de la muestra utilizando un recubridor de pulverización catódica. </li></ol> 5. La tinción de Semi Secciones finas con manchas de Richardson <ol><li> Que semi seco en secciones delgadas de diapositivas. </li><li> Mancha de secciones con la solución de tinción a 60 ° C durante 1-2 min. </li><li> Lavar con agua destilada. </li><li> Secciones secas y cubreobjetos. </li></ol> 6. Los resultados representativos Dentro del modelo de Falopio humana infección tubo hemos sido capaces de visualizar las diferencias en la morfología epitelial entre los controles no infectados (Figura 1) y la C. trachomatis - tubos infectados (Figura 2) bajo condiciones normoxic. Características morfológicas diferencias implícitos patógenos inducida por la inflamación y la lisis de las células epiteliales del tubo de Falopio que no podían ser detectadas en los controles no infectados. Uso semi secciones delgadas y microscopía electrónica de transmisión que fueron capaces de demostrar intracelular C. formación trachomatis inclusión en la ex vivo tejido humano infectado trompa de Falopio (Figura 3, 5), pero no en los controles no infectados (Figura 4). Como las concentraciones de oxígenociones en el tracto genital de la mujer ya son bajos en condiciones fisiológicas 11, y una disminución aún más durante un proceso inflamatorio que también investigó el modelo bajo condiciones hipóxicas. Los resultados preliminares indican que el modelo es útil para analizar el crecimiento de clamidia y descendientes en las diferentes concentraciones de oxígeno. Chlamydia inducida por el daño de las células epiteliales tiene que ser separado de los artefactos que están mediadas a través de la preparación y la manipulación imprudente de las trompas de Falopio antes de la infección (Figura 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microscopía electrónica de barrido (SEM) de una de Falopio humana no infectados después de la incubación de un día en medio de control (flecha verde muestran células ciliadas flecha azul muestra de células no ciliadas). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Electrónica de barrido micros<html> copia (SEM) de una ex vivo trachomatis C infecta el tubo de Falopio humana un día después de la infección (flecha blanca marca de ruptura de la inclusión). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Secciones delgadas semi muestran típicas inclusiones intracelulares (flechas blancas) 1d después de la infección de las trompas de Falopio humana con C. trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de un no-humano infectado tubo de Falopio días después de la incubación en un medio de control. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de un C. ex vivo trachomatis infecta el tubo de Falopio humana un día después de la infección (flechas blancas marcan las inclusiones clamidias). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Microscopía electrónica de barrido (SEM) de las trompas de Falopio epitelio dañado mediante la preparación y manipulación imprudente de espécimen (blanco flechas marca destruido tejido epitelial).

<ol><li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li>
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<li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li>
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<li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Visualización de patógenos inducida por el daño al tejido infectado es arduo y, a menudo limitada a los procedimientos experimentales en ratones. Hemos establecido un modelo in vivo en humanos la infección ex trompas de Falopio para analizar C. trachomatis de la parte superior del tracto genital femenino. Mediante el uso de este método, hemos sido capaces de visualizar C. trachomatis - inducida por los daños al epitelio de las trompas de Falopio humana dentro de un día después de la infección. Inflamación celular y la lisis eran típicos los cambios morfológicos que se observaron en C. trachomatis - infectados trompas de Falopio, pero no en los controles no infectados. TEM análisis reveló que las clamidias poner en práctica un típico ciclo de desarrollo intracelular en los tejidos infectados, que muestra grandes inclusiones con la re-diferenciados cuerpos elementales, sino también pequeñas inclusiones con cuerpos reticulados agrandados que pudieran indicar la persistencia. Sin embargo, la imagen morfológica por sí sola no es suficiente para discriminar entre REPLinfecciones icating y persistente, que se caracterizan por una disminución del metabolismo y aumento de la resistencia a los antimicrobianos 10. La destrucción del epitelio en las trompas de Falopio infectadas es o bien debido a la interrupción de C. trachomatis - las células epiteliales infectadas después de la finalización del ciclo de desarrollo intracelular y la liberación de los cuerpos elementales infecciosos o la liberación de citoquinas pro-inflamatorias 8. Patógenos inducida por daño tisular e indujo host reacciones inmunes contra C. trachomatis se supone que son los principales factores que conducen a la pérdida de la función de las células epiteliales, fibroblastos y la remodelación de la infertilidad tubárica en vivo, finalmente 8,11. Una de las principales limitaciones de este modelo es la ausencia de células inflamatorias que dificulta el análisis de los efectos secundarios a la inicial C. trachomatis infección del epitelio de las trompas de Falopio. Sin embargo, el modelo es APpropriate para investigar diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, contenido de oxígeno) y el primer host de la respuesta inmune en la C aguda trachomatis 8,9. Otros planes son establecer un modelo para la prueba de los antimicrobianos en contra de C. trachomatis en las trompas de Falopio humanos enteros y caracterizar los estados metabólicos de las diferentes etapas evolutivas observadas en el epitelio de las trompas de 2-fotones microscopía de escaneo láser.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG de búfer </td><td> diversos </td><td></td><td> ver receta a continuación </td></tr><tr><td> Fijador de Monti </td><td> diversos </td><td></td><td> ver receta a continuación </td></tr><tr><td> tampón de cacodilato de sodio </td><td> diversos </td><td></td><td> ver receta a continuación </td></tr><tr><td> Richardson la mancha </td><td> diversos </td><td></td><td> ver receta a continuación </td></tr></tbody></table> Recetas: 1. SPG de búfer <ol><li> Añadir 75 g de sacarosa. </li><li> Añadir 2,47 g de fosfato disódico. </li><li> Añadir 0,36 g de fosfato monosódico. </li><li> Añadir 0,72 g de ácido glutámico. </li><li> Llene hasta 1 litro con agua destilada. </li><li> Ajustar el pH a 7.3. </li></ol> 2. Cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,35. <ol><li> Añadir 42,80 g de ácido dimetilarsénico sal de sodio. </li><li> Añadir 68,46 g de sacarosa. </li><li> Llene hasta 1 litro con agua destilada. para obtener 0,2 M tampón de cacodilato de sodio. </li><li> Antes de utilizar la solución diluida con agua destilada. a deseada concentración y ajustar el pH a 7,35, si es necesario. </li></ol> 3. Fijador de Monti <ol><li> Añadir 156 ml de 0,12 M tampón de cacodilato de sodio. 3.2 Añadir 25 ml de 25% glutaraldehído en agua destilada. </li><li> Añadir 19 ml10% de paraformaldehído en agua destilada. </li><li> Añadir 3 ml 3% de CaCl2 en agua destilada. </li><li> Ajustar el pH a 7,35 y rellenar con agua destilada. a 312 ml de solución final. </li></ol> 4. Richardson mancha <ol><li> Mezcle partes iguales de azul de metileno al 1% en solución acuosa al 1% de bórax y el 1% II Azul en agua destilada. </li></ol>

un modelo humano las trompas de falopio para la investigación de<em&gt; c. trachomatis</em&gt; infecciones

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Infecciones del tracto genital por Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) son las más frecuentes enfermedades de transmisión sexual en las mujeres de todo el mundo. Aclaramiento de ineficaz o la persistencia de los patógenos puede dar lugar a infecciones ascendentes del tracto genital superior y se supone para causar daño inflamatorio crónico de 1,2 tejidos infectados. Como consecuencia, graves secuelas clínicas como la enfermedad inflamatoria pélvica (EIP), oclusión de las trompas e infertilidad puede ocurrir 3,4. La mayor parte de la investigación con C. trachomatis se ha realizado en líneas de células epiteliales (por ejemplo, células HEp-2 y HeLa 229-) o en ratones. Sin embargo, como con modelos de cultivo a base de células, que no reflejan ni la fisiología del tejido nativo ni la fisiopatología de C. trachomatis del tracto genital en vivo 5. Otras limitaciones están dadas por el hecho de que centrales cascadas de señalización (por ejemplo, el IFN-γ MEDIATed JAK / STAT vía de señalización) que controlan el crecimiento intracelular Chlamydia difieren fundamentalmente entre los ratones y los seres humanos 6,7. Nosotros y otros por lo tanto, estableció un modelo de órgano en su totalidad las trompas de Falopio para investigar las interacciones directas entre C. trachomatis y las trompas de Falopio humana ex vivo las células 8,9. Para este propósito, las trompas de Falopio humanos de las mujeres sometidas a histerectomía se recogieron y se infectan con C. trachomatis serovar D. Dentro de las 24 h después de la infección, la muestra donde se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para detectar la Chlamydia trachomatis mediado daño epitelial, así como C. trachomatis formación inclusión en el tejido de Falopio.

Se describe un<em&gt; Ex vivo infección</em&gt; Modelo para la visualización de las interacciones directas de los patógenos bacterianos con células humanas de la trompa de Falopio. El modelo de todo el tejido del órgano se creó para investigar<em&gt; C. trachomatis</em&gt; La patología inducida por la trompa de Falopio en las mujeres &quot;como&quot; condiciones de vida.

Un modelo humano las trompas de Falopio para la Investigación de<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infecciones

Las infecciones del tracto genital por Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) son la enfermedad de transmisión sexual más frecuente en mujeres en todo el mundo. La ineficiente...

Chlamydia trachomatis es una bacteria gramnegativa, obligada intracelular. Se conocen diferentes serovares de clamidia que causan infecciones del ojo o del tracto genital. Las infecciones del tracto genital por Chlamydia trachomatis son la enfermedad de transmisión sexual más frecuente en el mundo.Se encuentran con una prevalencia de casi 3 millones de infecciones reportadas en la Unión Europea desde 1990 hasta 2009. En 2009 se notificaron casi 400.000 casos. Aunque la salud pública y la educación sexual están mejorando constantemente, se detecta un aumento en la tasa de nuevas infecciones genitales por clamidia, pasando de 70.000 casos en 1990 a 400.000 casos en 2009.El 75 % de todas las nuevas infecciones se notifican en personas jóvenes de entre 15 y 24 años. Se cree que las secuelas clínicas ocurren debido a una eliminación ineficiente de los patógenos, lo que puede provocar infecciones ascendentes desde el tracto genital inferior hasta el superior, y posteriormente causar daño inflamatorio crónico en el tejido infectado. Del 10 al 30 % de las mujeres infectadas con chlamydia tracheitis desarrollan una enfermedad inflamatoria pélvica (EIP), y hasta el 50 % de los casos de EIP se atribuyen a infecciones por chlamydia tracheitis.Como consecuencia, en el 50 % de los pacientes con infertilidad tubárica y en el 40 % de los pacientes con embarazo ectópico, se encuentra *Chlamydia trachomatis* como el patógeno causal. En una mujer sana no infectada, el óvulo fertilizado migra a través de la trompa de Falopio hasta el útero, donde se desarrolla hasta el parto. En pacientes infectados, *Chlamydia* puede ascender desde el tracto genital inferior hasta la trompa de Falopio, desencadenando procesos inflamatorios crónicos.Se considera que el daño inducido por patógenos en las células epiteliales y la pérdida de funciones epiteliales centrales causan finalmente la oclusión tubárica, lo que resulta en un transporte reducido o completamente abolido del óvulo desde los ovarios hasta el útero. A tal fin, se recolectan y almacenan trompas de Falopio humanas provenientes de mujeres sometidas a histerectomía. Las trompas se disecan y se abren cuidadosamente.Seg&uacute;n el dise&ntilde;o experimental, se cortan en peque&ntilde;os espec&iacute;menes e infectan con cuerpos elementales infecciosos de *Chlamydia trachomatis* durante 24 a 48 horas tras los respectivos puntos de tiempo. Los espec&iacute;menes se fijan con fijador de Monty durante al menos tres d&iacute;as hasta su posterior preparaci&oacute;n. Almacene las trompas de Falopio humanas (HFT) de mujeres sometidas a histerectom&iacute;a inmediatamente despu&eacute;s de la cirug&iacute;a.En RPMI que contiene 5 %FCS sin antibióticos a cuatro grados Celsius hasta su preparación. Diseque el tubo falopio humano en una placa de Petri que contenga RPMI con 5 %FCS sin antibióticos durante todo el procesamiento. El tubo debe estar sumergido en medio para evitar que se seque; corte y deseche el tejido conectivo y el tejido dañado durante la cirugía.Después de la disección, abra cuidadosamente el TFM con un escalpelo pequeño. Evite el daño del tejido mediante un manejo descuidado con pinzas y escalpelo. Prepare pequeños fragmentos de tejido de un tamaño de cinco por cinco milímetros para la infección; almacene la muestra de TFM en un mililitro de RPMI que contenga 5 % de FCS sin antibióticos y agregue C track.Los cuerpos elementales de la muestra HFT de OMAS se incuban durante un máximo de 48 horas a 37 grados Celsius, 5 %CO₂ y 20 %O₂ dentro de una incubadora normal o en un ambiente de bajo oxígeno, inferior al 5 %O₂ en una cámara de hipoxia. Tras los tiempos de incubación correspondientes, las muestras se recogen y almacenan en el fijador de Monty durante al menos tres días a cuatro grados Celsius hasta su preparación para microscopía electrónica de barrido (SEM) o microscopía electrónica de transmisión (TEM). El tejido fijado se corta en pequeños fragmentos, se lava e incuba con osmio al 1 % y tetraóxido durante la noche.Después de varios pasos de lavado y secado, los especímenes deshidratados se transfieren a aite recién preparado y se polimerizan durante 48 horas a 60 grados Celsius. Después del recorte, se cortan secciones semifinas y ultradelgadas, que se transfieren a portaobjetos o rejillas, respectivamente. Después de la tinción, las secciones semifinas pueden examinarse mediante un microscopio óptico para microscopía electrónica de transmisión.Retire el espécimen del fijador de Monty y córtele en trozos de hasta dos por dos por cinco milímetros. Después de lavar y la incubación con tampón diluido de sodio CCO y lavado con óxido de osmio y deshidratación y concentraciones ascendentes de etanol, transfiera el espécimen a una mezcla de 50% de óxido de propileno y aite durante la noche. Al día siguiente, transfiera a aite recién preparado durante al menos una hora.Luego transfiera a moldes planos y llénelos con aite y deje que el aite polimerice durante 48 horas a 60 grados Celsius. Después de recortar la muestra embebida, corte secciones semifinas de aproximadamente 700 nanómetros o secciones ultradelgadas de 70 nanómetros utilizando un ultramicrotomo equipado con un cuchillo de vidrio o, preferiblemente, un cuchillo de diamante. Analice las secciones semifinas y ultradelgadas mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión. Para microscopía electrónica de barrido.Los especímenes se sujetan con el epitelio hacia arriba sobre placas de corcho, se lavan y se deshidratan utilizando concentraciones crecientes de acetona. Después de secarlos en un secador de punto crítico, los especímenes se transfieren a un soporte para muestras de microscopía electrónica de barrido y se recubren con platino, oro o paladio mediante un evaporador de pulverización catódica. Luego están listos para ser analizados en un microscopio electrónico de barrido para microscopía electrónica de barrido.Retire el espécimen del fijador de Monty y oriente el fragmento de tejido con el epitelio hacia arriba sobre una hoja de corcho, fijando su posición con agujas para insectos. Después de lavar con tampón de caco dilatado al sodio, seque el espécimen mediante un tratamiento con acetona en un secador de punto crítico. Tras transferir el espécimen del corcho a un soporte para microscopía electrónica de barrido (SEM), prepare un recubrimiento conductor de platino, oro o paladio sobre el espécimen utilizando un sputter coater; luego transfiera el espécimen pulverizado al microscopio electrónico de barrido para su análisis posterior.La alta incidencia invariable de infecciones por lumus en mujeres y las enormes consecuencias clínicas de las infecciones al ascendentes constituyen la justificación para intensificar la investigación básica y traslacional en este campo. Hicimos uso de un modelo de tejido exvivo de la trompa de Falopio humano, previamente establecido por el grupo de St.Perus, para caracterizar morfológicamente el daño celular inducido por Chlamydia en la trompa de Falopio. Mediante el uso de este método, se observa la formación de inclusiones intracelulares en diferentes estadios de desarrollo, evidenciando tanto infecciones replicativas como persistentes.Sin embargo, aún falta evidencia experimental sobre la presencia de clamidia persistente en el tejido de la trompa de Falopio humana, lo que requiere un análisis adicional de clamidia, descendencia y regulación positiva de la transcripción de genes de persistencia. Una de las limitaciones principales de este modelo es la ausencia de células inflamatorias, lo que dificulta el análisis de efectos secundarios derivados de la infección glaucomatosa inicial por KLA. No obstante, este modelo parece adecuado para analizar condiciones ambientales como el contenido de oxígeno en el contexto del daño celular epitelial de la trompa de Falopio, así como para analizar la respuesta inmunitaria inicial del huésped frente a la infección glaucomatosa aguda.Uno de los objetivos futuros consiste en establecer un modelo más elaborado para la prueba de la CMI de las UTC en el modelo de tejido tubárico humano con pH controlado, y utilizar este modelo para definir realmente las distintas etapas de desarrollo de las CLI desde el punto de vista metabólico, haciendo uso de la técnica de microscopía de barrido láser de dos fotones.

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La trompa de Falopio (FT) se está convirtiendo en un sitio alternativo de origen para el carcinoma de ovario seroso (SOC). Este protocolo describe un nuevo método para el aislamiento...

Ex Vivo Cultura de células humanas primarias epiteliales del tubo de Falopio

Trichuris muris infección intestinal es un modelo de la inmunidad Th2 en ratones resistentes al generar una respuesta Th2 protección y ratones susceptibles de generar una respuesta Th1 patológicos.

Trichuris muris infección: un modelo de tipo 2 inmunidad y la inflamación en el intestino

Fuente: O'Brien, V. P., et. al., Infección urinaria recurrente de Escherichia coli desencadenada por exposición a la vejiga a Gardnerella vaginalis en ratones. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el uso de microscopía electrónica de barrido para visualizar la colonización bacteriana y las interacciones huésped-patógeno en el epitelio de vejiga de un modelo murino preinfectado.

Preparación del tejido de vejiga de ratón para la visualización de infecciones bacterianas

Fuente:Ocean E. Clarke1, Romy A. Dop1, Tom Hasell1, Joanne L. Fothergill1, Daniel R. Neill21Universidad de Liverpool, 2 Universidad de DundeeEste video demuestra el uso de un dispositivo recubierto de silicona impreso en 3D que imita la superficie interna de los catéteres urinarios para simular la infección del tracto urinario asociada al catéter.

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Este video demuestra el establecimiento de una infección uropatógena por Escherichia coli en una vejiga de ratón hembra a través de la instilación de catéter transuretral. Las bacterias inyectadas establecen con éxito una infección del tracto urinario dentro de la vejiga, proporcionando una valiosa plataforma para estudiar las enfermedades asociadas a la atención médica relacionadas con el tracto urinario.

Cateterismo transuretral e inoculación bacteriana para generar un modelo de infección del tracto urinario en ratones machos

Establecimiento de un modelo de infección del tracto urinario en ratones hembra

El modelo establecido de cateterización transuretral de ratones permite el estudio de patologías de vejiga, incluyendo infección del tracto urinario, pero puede realizarse solamente en las hembras. Un nuevo modelo de hombre instilación transuretral, presentado aquí, permitirá que la investigación en un área marcada por fuertes diferencias clínicas y epidemiológicas entre los sexos.

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Exploramos un método citológico de trompas mediante el muestreo de la trompa de Falopio directamente escisión post-quirúrgica como una herramienta de detección temprana de cáncer de ovario. Aquí, presentamos un protocolo para recoger las células de trompas de Falopio recién recibidos muestras quirúrgicas.

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Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Este protocolo describe un método de un día para el aislamiento de células epiteliales de trompas de Falopio humanas. Las células epiteliales aisladas se pueden sembrar en cultivo bidimensional (2D) o disociarse en suspensiones unicelulares y utilizarse en experimentos posteriores, incluida la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular.

Un método eficiente para extraer epitelios de trompas de Falopio humanas para análisis de células individuales

Este protocolo detalla el desarrollo de modelos de ratón de carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir de la derivación de organoides de trompas de Falopio murinos, su modificación genética para recapitular la genética HGSOC humana y su introducción en la bolsa ovárica de ratones singénicos para el desarrollo in vivo de tumores.

Desarrollo de líneas de organoides derivados de ratones a partir de células epiteliales de trompas de Falopio para el modelado de carcinoma de ovario seroso de alto grado

Aprende a establecer un modelo ex vivo de trompas de Falopio humanas para estudiar infecciones por C. trachomatis. Este método permite analizar daño celular y respuestas inflamatorias en tejido humano real.

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