Name: Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a aislar rápidamente células dendríticas y macrófagos intestinales de ratón mediante digestión de lámina propia y citometría de flujo. Este método optimiza la viabilidad celular para estudios funcionales de inmunidad intestinal.

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Damos las gracias a Aaron Rae (Universidad de Emory, Departamento de Pediatría y Salud Infantil de núcleo de flujo de Atlanta) para la clasificación de células. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención AA01787001, el Premio de Desarrollo de Carrera de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America, y una investigación de Emory-Egleston Children Center de semillas de subvención para TLD

1. La disección y la disociación de las células intestinales Preparación de los reactivos y equipos: <ul><li> Cálido Ca 2 + / Mg 2 + libre de PBS (CMF PBS) a temperatura ambiente. </li><li> Caliente Ca 2 + / Mg 2 +-libres HBSS con FBS al 5% (HBSS CMF / FBS) y 2 mM EDTA a temperatura ambiente. </li><li> Cálido agitador orbital a 37 º C. </li></ul> Nota: Los pasos de 1,1 a 1,7 debe realizarse lo más rápidamente posible para minimizar el grado de muerte celular y para lograr el máximo rendimiento celular. <ol><li> La eutanasia de los ratones en una cámara de CO 2 y etanol al 70% de pulverización en el abdomen y el tórax. </li><li> Hacer una pequeña incisión horizontal en el centro del abdomen con una tijera y remueva la piel para exponer el peritoneo. </li><li> Proceder a separar el estómago en el intestino delgado superior por el corte en el esfínter pilórico. Tease de distancia del mesenterio con unas pinzas y cortar de nuevo enla válvula ileocecal para liberar todo el intestino delgado del intestino grueso. Haga un corte en el orificio anal y otra vez separar el mesenterio del intestino grueso hasta que esté libre. </li><li> Cortar los dos puntos longitudinalmente con tijeras y lavar contenido fecal y el moco de la luz intestinal en CMF PBS a temperatura ambiente. </li><li> Con unas tijeras y pinzas de disección macroscópica de las placas de Peyer a lo largo de la superficie antimesentérico del intestino delgado y se abre el intestino delgado en sentido longitudinal. </li><li> Lavar el lumen del intestino delgado de contenido fecal y moco en CMF PBS a temperatura ambiente. </li><li> Por otro corte en el intestino delgado / de gran tamaño en aproximadamente 1,5 cm de piezas y ponerlas en diferentes tubos de 50 ml cónicos que contienen 30 ml de pre-calentado HBSS CMF / FBS y EDTA 2 mM. No agregue más de un intestino por 50 ml tubo cónico. </li><li> Horizontalmente colocar cada tubo cónico de 50 ml en un agitador orbital y agitar durante a 250 rpm durante 20 min a 37 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Colocación de un filtro de malla de alambre sobre un solo cubo de la basura y verter el contenido de cada tubo cónico de 50 ml a través de recuperar las piezas de 1,5 cm de intestino y colocarlos en diferentes tubos de 50 ml cónicos que contienen 30 ml de precalentado CHBSS / FBs con 2 mM EDTA. </li><li> Repita 1.8. </li></ol> 2. La digestión del tejido y aislamiento de las células intestinales Preparaciones de reactivos y equipamiento: <ul><li> Colagenasa solución: 1,5 mg / ml de colagenasa tipo VIII disolvió en pre-calentado HBSS CMF / FBS con 40 mg / ml de DNasa I. </li><li> Pre-caliente CMF HBSS / FBS y EDTA 2 mM. </li><li> Pre-caliente agitador orbital a 37 º C. </li><li> Helada CMF HBSS / SFB. </li></ul><ol><li> Después de la segunda ronda de agitación, verter el contenido de cada tubo cónico de 50 ml a través del filtro y transferir 1,5 cm piezas de intestino a un pequeño de plástico pesan barco después frotando suavemente el exceso de material de distancia usando una toalla de papel. </li><li> Rápidamente el picadillo de un.5 Piezas cm de intestino usando tijeras directamente en el bote de peso y añadir intestino picada a 20 ml de solución de colagenasa. Horizontalmente colocar cada tubo cónico de 50 ml en un agitador orbital y digerir a 200 rpm durante 10-20 min a 37 ° C. Por favor, ver más adelante en relación con la optimización. </li><li> Brevemente vórtice para asegurar la disociación completa de cualquier tejido restante intestinal y filtrar a través de un colador micras 100 células directamente en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Parte superior de cada tubo cónico de 50 ml con HBSS CMF / SFB y se centrifuga a 1500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Si un sólido precipitado no se observa para las muestras de colon después de la centrifugación, las muestras deben ser centrifugadas de nuevo por 3,5 min. Repita este paso de lavado, una vez más. </li><li> Retirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en el hielo frío HBSS CMF / SFB y muestras lugar en el hielo. </li><li> Proceda a la Sección 3 para la adquisición de FACS / o análisis de la Sección 4 de cordón magnético de enriquecimiento para celular sorti de alta velocidadng. </li></ol> 3. Anticuerpos de tinción para el Análisis de Flujo Multi-Color de citometría de países en desarrollo y los macrófagos Preparaciones de reactivos y equipamiento: <ul><li> Helado de PBS CMF. </li><li> Helado de buffer de tinción (CMF PBS + 5% de SFB). </li><li> Prepare la mancha de células muertas en el hielo frío CMF PBS a una dilución 1:1000 con LIVE / DEAD Se fija Kit de Aqua Dead Cell Mancha. </li><li> Preparar el cóctel tinción de anticuerpos mediante la adición de los siguientes fluorescencia-etiquetados anticuerpos monoclonales (mAb) a la tampón enfriado con hielo tinción: CD45-PerCP, PE-CD103, CD11c APC-, MHC II-(IA b)-Alexa Fluor 700, CD11b -eFluor 450, F4/80-PE-Cy7. </li></ul><ol><li> Transferir las células en un 5 poliestireno ml de fondo redondo (FACS) del tubo. </li><li> Lave las células dos veces en helado CMF PBS. </li><li> Incube las muestras con células muertas mancha durante 15 minutos en hielo en la oscuridad. </li><li> Lave las células dos veces en helado CMF PBS. </li><li> Las células de bloques con 2.4G2 anti-FcγRIII/II en helado tincióntampón durante 10 minutos en hielo. </li><li> Lavar las células en tampón de tinción enfriado con hielo. </li><li> Incubar las muestras con cóctel de anticuerpos tinción durante 20 minutos en hielo en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con tampón enfriado con hielo tinción dos veces y resuspender las muestras en 400 l de tampón enfriado con hielo tinción y pasar a través de la tapa 40 micras filtro en tubos FACS. </li><li> Adquirir muestras de LSR II citómetro (BD), según la definición de la estrategia de puerta en la Sección 5 y la Figura 1. </li></ol> 4. El enriquecimiento de los países en desarrollo y los macrófagos en el intestino Preparaciones de reactivos y equipamiento: <ul><li> Helado de buffer de tinción (CMF PBS + 5% de SFB). </li></ul><ol><li> Incubar única suspensión celular obtenida de la etapa con 2,5 CD11b y perlas MACS CD11c de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar las células con tampón de tinción enfriada con hielo, seguido por centrifugación. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en un tampón de tinción ml enfriado con hieloy pasar a través de un colador micras 100 celular, seguido por un filtro de células 40 micras. </li><li> Enriquecer de bolas magnéticas adheridas a las células por la selección positiva utilizando MACS columna LS magnético. </li><li> Repita el paso 4.2 y desechar el sobrenadante. </li><li> Se incuban las células con mAbs marcador de superficie tal como se describe en el paso 3,7. </li><li> Lavar magnéticos talón enriquecidos con células dos veces con tampón de tinción enfriado con hielo. Resuspender sedimentos celulares en tampón de 500 l tinción helado sin azida de sodio, y pasan a través de 40 micras filtro de células en un tubo FACS. </li><li> Proceda a la FACS, la clasificación en el Clasificador de BD ARIA de la célula para ordenar II DC intestinal y / o subconjuntos de macrófagos de interés. </li></ol> 5. Estrategia para la apertura de puerta LP APC Nota: Obsérvese que no teñidas células intestinales se puede utilizar como un control negativo para ayudar en la colocación correcta de las puertas para separar poblaciones positivas y negativas. <ol><li> Como se muestra en la Figura1, crear un diagrama de puntos y no incluyen células que son positivas para la tinción de células muertas (fig. 1A), seguido por la exclusión de eventos doblete (Fig. 1B y C). Entonces, la puerta de las células de interés de acuerdo para avanzar y dispersión lateral asegurarse de excluir a los residuos (Fig. 1D). </li><li> Crea otro gráfico de puntos y la puerta sobre CD45 + y b + IA células, lo que caracteriza fenotípicamente APC (Fig. 1E). </li><li> En un gráfico de puntos por separado, el análisis de la expresión de CD11b y CD11c para distinguir las DC específico y subconjuntos de macrófagos (R1, R2 y R3;. Fig. 1F). Las células de R1 son CD11c + CD11b mate / - las células. La región, R2, se delinea de manera que estas células tienen niveles similares de expresión en la superficie para CD11c como en las células de R1 pero las células de R2 también CD11b expresa. Después de ello, la región R3 es designado para las células que son + CD11b y opaco / CD11c -. </li><li> Uncatalizar regiones R1, R2, R3 y de expresión adicional para F4/80 y CD103 para diferenciar los macrófagos y las poblaciones de CC, respectivamente. El CD11c + CD11b aburrida / - las células de R1 expresan niveles elevados de la integrina αE, CD103, y bajos niveles de F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + en las células de R2 se componen de los países en desarrollo y los macrófagos sobre la base de su expresión dicotómica de CD103 y F4/80 (Fig. 1H). Por último, CD11b + CD11c mate / - las células de los macrófagos constituyen R3 en función del perfil fenotípico de F4/80 + y CD103 - (Fig. 1i) 16. </li></ol> 6. Los resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" /> Figura 1. La estrategia de apertura de puerta para los países en desarrollo y los macrófagos intestinales. Las células muertas (A) y dobletes (B y C) fueron excluidos del análisis primero y luego pequeños intestinalnales células fueron separadas de acuerdo a la dispersión frontal y lateral (D), y vehículos blindados se define como CD45 + IA + B (E). Los macrófagos y los DC se identificaron mediante la expresión de CD11b y CD11c (F). CD103 y F4/80 expresión para células pre-bloqueado en R1 (G), R2 (H) y R3 (I) se analizó la población. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" /> Figura 2. Rendimiento de la célula y la calidad tinción de anticuerpos depende del tiempo de digestión. CD11b y CD11c patrón de tinción y el rendimiento total de células de bajo-(A, D), de manera óptima-(B, E) o más digerido-(C, F) del tejido intestinal. Células intestinales fueron aisladas de un intestino ratón C57BL / 6 pequeño y los DC y los macrófagos se analizaron por FACS en el II BD LSR. Voltaje y la indemnización se establece mediante teñidas y de un solo fluorocromo manchadas de esplenocitos. Las células muertas (Fig. 1A) y dobletes (Fig. 1B y C) fueron excluidos de primerael análisis. Las células de interés se analizaron a continuación de acuerdo con frontal y lateral de dispersión (Fig. 1D), seguido por inyección en CD45 + b + e IA células (Fig. 1E). Posteriormente, CD11b y CD11c expresión se evaluó entre el CD45 + IA b + células para delinear tres regiones (R1, R2 y R3;. Fig. 1F). CD103 y F4/80 expresión en las tres regiones se evaluó para distinguir entre los DC y macrófagos, respectivamente. El CD11c + CD11b aburrida / - las células de R1 expresaron altos niveles de la integrina αE, CD103, y bajos niveles de F4/80 (Fig. 1G). CD11b + CD11c + en las células de R2 se compone de los dos países en desarrollo y los macrófagos sobre la base de su expresión dicotómica de CD103 y F4/80 (Fig. 1H), mientras que CD11b + CD11c mate / - las células de R3 constituyen los macrófagos basados ​​en el perfil fenotípico de F4 / 80 + y CD103 - ( <strong&gt; fig. 1I) 16. Los macrófagos dentro de la puerta de R2 y los macrófagos en la puerta de R3 tiene de avance similar y las propiedades de dispersión y secundarios se distinguen por la expresión de CD11c. La dicotomía funcional de estos subconjuntos sigue siendo no del todo comprendidas. La relación entre la duración de la digestión del tejido sobre el rendimiento total de células y la expresión de CD11b y CD11c se ilustra en la Figura 2. Tejido intestinal que se digirió durante 3 minutos (bajo-digestión) produjo bajo número total de células (Fig. 2D) y por lo tanto pocos países en desarrollo y macrófagos disponibles para la caracterización (Fig. 2A). Digestión de tejido durante 11 minutos produce un rendimiento sólido de células vivas (Fig. 2E) con poblaciones de países en desarrollo y los macrófagos que expresaban altos niveles de CD11b y CD11c y eran fenotípicamente distinta (Fig. 2C). En contraste, la digestión durante 50 min (sobre-digestión) resultó en un rendimiento celular similar cuando compared a la digestión optimizada (Fig. 2E y F), sin embargo, la delineación de diferentes poblaciones de células que utilizan CD11b y CD11c se hizo más oscuro como la expresión de CD11c disminuida (Fig. 2C) y el número de células muertas se incrementó (datos no presentados).

<ol><li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li>
<li>Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+antigen+presentation+and+the+control+of+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity.</a> Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).</li>
<li>Abraham, C., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+host+innate+immune+system+and+microbes+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).</li>
<li>Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regula+tine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regula tine.</a> Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).</li>
<li>Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal dendritic cells.</a> Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).</li>
<li>Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+independent+subset+of+TLR+expressing+CCR2-dependent+macrophages+promotes+colonic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation.</a> J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).</li>
<li>Coombes, J. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal immune regulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).</li>
<li>Kelsall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+the+phenotype+and+function+of+intestinal+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages.</a> Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).</li>
<li>Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor%2C+plasticity%2C+and+crosstalk+between+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).</li>
<li>Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamina+propria+macrophages+and+dendritic+cells+differentially+induce+regulatory+and+interleukin+17-producing+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses.</a> Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).</li>
<li>Niess, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1-mediated+dendritic+cell+access+to+the+intestinal+lumen+and+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance.</a> Science. 307, 254-258 (2005).</li>
<li>Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+DCs+interact+with+intestinal+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How do DCs interact with intestinal antigens.</a> Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).</li>
<li>Bilsborough, J., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dendritic+cells+play+a+role+in+immunity%2C+tolerance%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease.</a> Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).</li>
<li>Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell%3A+its+role+in+intestinal+inflammation+and+relationship+with+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria.</a> Gut. 52, 1522-1529 (2003).</li>
<li>Medina-Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+regulates+intestinal+macrophage+homeostasis%2C+bacterial+translocation%2C+and+colitogenic+Th17+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice.</a> J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Specializations+of+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+That+Control+Th17+and+Regulatory+T+Cell+Responses+Are+Dependent+on+the+T+Cell%2FAPC+Ratio%2C+Source+of+Mouse+Strain%2C+and+Regional+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization.</a> J. Immunol. , 187-733 (2011).</li>
<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nod2+sensor+promotes+intestinal+pathogen+eradication+via+the+chemokine+CCL2-dependent+recruitment+of+inflammatory+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes.</a> Immunity. 34, 769-780 (2011).</li>
<li>Schulz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+CD103%2B%2C+but+not+CX3CR1%2B%2C+antigen+sampling+cells+migrate+in+lymph+and+serve+classical+dendritic+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions.</a> J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).</li>
<li>Jaensson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestinal+CD103%2B+dendritic+cells+display+unique+functional+properties+that+are+conserved+between+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans.</a> J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).</li>
<li>Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+humoral+and+cellular+gut+immunity+by+lamina+propria+dendritic+cells+expressing+Toll-like+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5.</a> Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).</li>
<li>Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1--expressing+intestinal+macrophages+crucially+amplify+chronic+inflammation+in+experimental+colitis+and+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases.</a> J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).</li>
<li>Sun, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Kamada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormally+differentiated+subsets+of+intestinal+macrophage+play+a+key+role+in+Th1-dominant+chronic+colitis+through+excess+production+of+IL-12+and+IL-23+in+response+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria.</a> J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+Th+cells+resembling+regulatory+T+cells+that+inhibit+chronic+colitis+differentiate+in+the+absence+of+interactions+between+CD4+and+class+II+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC.</a> J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).</li>
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No hay conflictos de interés declarado.

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Factores importantes para la optimización del rendimiento de la célula y la expresión del antígeno de superficie. Rendimiento de la célula y la expresión del antígeno de superficie son afectados directamente por la duración de la digestión del tejido, las características específicas de la colagenasa, el grado de tejido picado, y la presencia o ausencia de inflamación, que puede afectar a la integridad del tejido y celularidad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> PBS 1X, Ca 2 + - y Mg 2 + libre </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con rojo fenol </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3001603 </td><td></td></tr><tr><td> De bicarbonato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M en NaCl al 0,85% </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (SFB) </td><td> Atlanta biológicos </td><td> S11150H </td><td> Inactivado por calor </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M (pH 8,0) </td><td> Cellgro </td><td> 46 a 034-CI </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase tipo VIII </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Roche </td><td> 14785000 </td><td> Una solución de archivo: 100mg/ml </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Se fija de Aqua kit de Dead Cell Mancha para la excitación de 405 nm </td><td> Invitrogen </td><td> L34957 </td><td> Utilice a 1:1000 </td></tr><tr><td> CD45-PerCP MAB (30F11) </td><td> BD </td><td> 557235 </td><td> Utilice a 1:100 </td></tr><tr><td> CD103-PE MAB (M290) </td><td> BD </td><td> 557495 </td><td> Utilice a 1:100 </td></tr><tr><td> FcγRIII / II MAB (2.4G2) </td><td> BD </td><td> 553141 </td><td> El uso de 1:200 </td></tr><tr><td> CD11c-APC MAB (N418) </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82 </td><td> Utilice a 1:100 </td></tr><tr><td> MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 MAB </td><td> eBioscience </td><td> 56-5321-82 </td><td> Utilice a 1:100 </td></tr><tr><td> CD11b-450 eFluorMAB (M1/70) </td><td> eBioscience </td><td> 48-0112-82 </td><td> El uso de 1:200 </td></tr><tr><td> F4/80-PE-Cy7 MAB (BM8) </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801-82 </td><td></td></tr><tr><td> CD11b microperlas </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-049-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c microperlas </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubos cónicos </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td> Sola malla colador de alambre </td><td> Chefmate </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pequeño barco de peso </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-732-116 </td><td></td></tr><tr><td> 100 micras filtro de células </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> 40 micras filtro de células </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mL de poliestireno de fondo redondo tubos </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td> Utilice a 1:100 </td></tr><tr><td> MaxQ 4450 de sobremesa agitador orbital </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LS MACS columna </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> LSR II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Dentro del intestino residen poblaciones únicas de las células inmunitarias innatas y adaptativas que están involucrados en la promoción de la tolerancia hacia la flora comensal y antígenos alimentarios, mientras que concomitantemente a punto restante para montar las respuestas inflamatorias hacia el 1,2 patógenos invasores. Células presentadoras de antígeno, en particular los PED y los macrófagos, juegan un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis inmune intestinal a través de su capacidad de detectar y responder apropiadamente a la microbiota 3-14. El aislamiento eficiente de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales es un paso fundamental en la caracterización del fenotipo y la función de estas células. Mientras que muchos métodos eficaces de aislar intestinales células inmunes, incluyendo los DC y macrófagos, han sido descritos 6,10,15-24, muchas veces se basan en digestiones largas que pueden influir negativamente superficie celular expresión del antígeno, la viabilidad celular, y / o el rendimiento de la célula. Aquí, detalles de una metodología para el aislamiento rápido de un gran número de viable, los países en desarrollo y los macrófagos intestinales. Caracterización fenotípica de los DC intestinales y macrófagos se lleva a cabo por tinción aislados directamente con las células intestinales específicas fluorescencia-etiquetados anticuerpos monoclonales para el análisis de flujo de múltiples colores citometría. Por otra parte, CC de alta pureza y de las poblaciones de macrófagos están aislados de los estudios funcionales utilizando CD11c y CD11b magnética activadas por cuentas de células de clasificación seguido por la selección de células.

Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

En el intestino residen poblaciones únicas de células inmunitarias innatas y adaptativas que participan en el fomento de la tolerancia hacia la flora comensal y...

El objetivo general de este procedimiento es aislar rápidamente células dendríticas intestinales o CD y macrófagos de ratón para su caracterización fenotípica y funcional. Esto se logra primero obteniendo el tejido intestinal. El segundo paso consiste en disociar el epitelio intestinal de la lámina propia.A continuación, la lámina propia intestinal se digiere durante las etapas finales del procedimiento. Las células de la lámina propia se tiñen con anticuerpos conjugados con fluorescencia y se seleccionan para poblaciones celulares específicas. En última instancia, las poblaciones de DC intestinales y macrófagos pueden caracterizarse y purificarse con mayor precisión para estudios funcionales destinados a evaluar la producción de citoquinas, la presentación de antígenos y la regulación de las células inmunitarias.Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que la rapidez de la digestión del tejido asegura una expresión óptima de los antígenos de superficie celular, la viabilidad celular y o la integridad celular. Tras la eutanasia del ratón y la confirmación de la muerte mediante el reflejo de pellizco en el dedo del pie, rocíe una prueba c

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aislamiento de linfocitos utilizando el kit de Miltenyi MAC es una manera confiable para purificar las células de todo homogeneizados de tejido linfoide. Células purificadas utilizando el sistema de Miltenyi suelen ser ≥ 96% de pureza. Este sentido, demuestran las medidas adoptadas para aislar las células CD4 + T, uno de los kits que se ofrecen por Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Existe un creciente interés en la comprensión de las funciones inmunológicas de subpoblaciones específicas de células en las placas de Peyer (PP), los sitios primarios de inducción de los tejidos linfoides asociados al intestino. Aquí resumimos los protocolos paralelos para preparar PP preparativos de célula única para el análisis de citometría de flujo y cryosections PP para inmunoticción.

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Este protocolo detalla un método para aislar células presentadoras de antígeno de timo humano a través de diferentes etapas de la digestión enzimática del tejido seguido por centrifugación de densidad de la suspensión de células individuales y la clasificación finalmente magnético y / o FACS de las poblaciones de células de interés.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Aquí describimos un método para aislar y purificar las células dendríticas de diferentes compartimentos anatómicos en el tracto reproductor femenino humano para la evaluación de sus características fenotípicas y funcionales. Este método puede adaptarse para aislar a otras células inmunes o las células dendríticas de otros tejidos de la mucosa.

Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.

Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E

Este estudio utiliza citometría de flujo y dos estrategias diferentes de gating en ratones perfundidos aislados plexos coroideos cerebrales; este protocolo identifica los principales subconjuntos de células inmunes que pueblan esta estructura cerebral.

Aislamiento y caracterización de las células inmunes de plexos coroideos de ratón microdisecados

Aprende a aislar rápidamente células dendríticas y macrófagos intestinales de ratón mediante digestión de lámina propia y citometría de flujo. Este método optimiza la viabilidad celular para estudios funcionales de inmunidad intestinal.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

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