Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar rápidamente células dendríticas intestinales de ratón o dcs y macrófagos para la caracterización fenotípica y funcional. Esto se logra mediante la recolección inicial de tejido intestinal. El segundo paso es disociar el epitelio intestinal de la Lamin propia.

A continuación, el Lamin Propria intestinal se digiere durante los pasos finales del procedimiento. Las células de lamina propia se tiñen con fluorescencia, anticuerpos conjugados y se activan para poblaciones celulares específicas. En última instancia, las poblaciones intestinales de DC y macrófagos pueden caracterizarse y purificarse con mayor precisión para estudios funcionales que evalúen la producción de citocinas, la presentación de antígenos y la regulación de las células inmunitarias.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que la rapidez de la digestión del tejido garantiza una expresión óptima del antígeno de la superficie celular, la viabilidad celular y/o celular. Después de sacrificar al ratón y confirmar la muerte por el reflejo de pellizco del dedo del pie, pruebe el aerosol de etanol al 70% en el abdomen y el tórax del animal. Luego, use un par de tijeras para hacer una pequeña incisión horizontal en el medio del abdomen y retire la piel para exponer el peritoneo.

Abra el peritoneo con unas tijeras después de cortar el esfínter del pilo para separar el estómago de la parte superior del intestino delgado y con pinzas para extraer el mesenterio. Vuelva a cortar en la válvula ileocecal para liberar todo el intestino delgado del intestino grueso. Continúe separando el mesenterio del intestino grueso y haga un corte en el borde anal.

Use tijeras para abrir el colon longitudinalmente y use C-M-F-P-B-S a temperatura ambiente para lavar el contenido fecal y la mucosidad del lumen intestinal. A continuación, utiliza las tijeras y las pinzas para macroscópicamente. Diseccionar los parches de piras a lo largo de la superficie antimesentérica del intestino delgado y cortar el intestino delgado longitudinalmente.

A continuación, limpie la luz del intestino delgado del contenido fecal y la mucosidad con más temperatura ambiente C-M-F-P-B-S. Por separado, corte los intestinos delgado y grueso en trozos de aproximadamente 1,5 centímetros y coloque los trozos en tubos cónicos individuales de 50 mililitros que contengan 30 mililitros de C-M-F-H-B-S-S de antes de la guerra con FBS y dos milimolares de EDTA. Coloque cada tubo cónico de 50 mililitros horizontalmente en un agitador orbital, agitando los tubos a 250 RPM durante 20 minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, coloque un colador de alambre de malla simple sobre un cubo de residuos. Vierta el contenido de cada tubo cónico de 50 mililitros a través de la malla para recuperar los trozos de intestino y luego colóquelos en nuevos tubos cónicos individuales de 50 mililitros que contengan 30 mililitros de Prewarm C-M-F-H-B-S-S con FBS con dos milimolares de EDTA. Por último, vuelva a colocar los tubos en el agitador orbital durante 20 minutos más.

Después de la segunda ronda de agitación, vierta el contenido de cada tubo a través del colador. Nuevamente, frote el exceso de medios con una toalla de papel y luego transfiera los trozos de intestino a un pequeño bote de suero de plástico. El aspecto más difícil de esta técnica es la digestión de los tejidos para garantizar el éxito, todos los diferentes parámetros de la duración de la digestión, las propiedades de la colagenasa, la integridad del tejido y el tamaño del tejido a digerir deben tenerse en cuenta utilizando tijeras rápidamente.

Picar los trozos intestinales y luego agregar el intestino picado en un tubo cónico de 50 milímetros que contiene 20 mililitros de solución de colagenasa. Coloque el tubo cónico horizontalmente en el agitador orbital y digiera los trozos de intestino a 200 RPM durante 10 a 20 minutos a 37 grados centígrados. Ahora agite brevemente el tubo para asegurar una disociación completa de cualquier tejido intestinal restante y luego filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 micrones directamente en un tubo cónico de 50 mililitros.

Finalmente, llene el tubo cónico con C-M-F-H-B-S-S con FBS y centrifugue la solución celular dos veces durante cinco minutos a 425 veces G a cuatro grados Celsius. A continuación, vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en C-M-F-H-B-S-S helado con FBS y coloque las muestras en hielo. Después de teñir las células para las proteínas de superficie de interés.

Comience por crear un diagrama de puntos que excluya las celdas que son positivas para la tinción de células muertas, como se muestra aquí. A continuación, excluya los eventos de doblete como se muestra aquí y aquí. Ahora use los canales de dispersión frontal y lateral para bloquear las celdas de interés, asegurándose de excluir los desechos.

A continuación, cree otro diagrama de puntos en el antígeno CD 45 positivo y el antígeno positivo para IAB. Al presentar las células en un diagrama de puntos separado, se crean regiones para distinguir subconjuntos específicos de DC y macrófagos. La región R one que se muestra aquí captura las células CD 11 C positivas y CD 11 B negativas opacas.

La región R dos delinea las células que tienen un nivel similar de expresión superficial para CD 11 C que las células de la región R uno, pero que también expresan CD 11 B. Las regiones R tres designan las células que son CD 11, B positivo y CD 11 C negativo opaco. Estas tres regiones se pueden analizar más a fondo para la expresión de F, 4, 80 y CD, 1, 0, 3 para diferenciar las poblaciones de macrófagos y DC, respectivamente. Como se ve en este diagrama de puntos, las células CD 11 C positivas CD 11 B negativas opacas en la región R uno expresarán niveles altos de alfa ein CD 1 0 3 y niveles bajos de F 4 80.

Este diagrama de puntos muestra que las células CD 11 B positivas para CD 11 C C en la región R dos estarán compuestas tanto por DCS como por macrófagos en función de su expresión dicotómica de CD 1, 0, 3 y F 4 80. Finalmente, en base a su perfil fenotípico F 4 80 positivo y CD 1 0 3 negativo R tres, las células CD 11 B positivas CD 11 C del negativo consistirán en macrófagos, la relación entre la duración de la digestión de los tejidos en el rendimiento total de células y la expresión de CD 11 B y CD 11 C se ilustra en las siguientes seis figuras. El tejido intestinal que se digiere durante tres minutos produce un número total de células bajo, lo que da como resultado pocas DCs y macrófagos disponibles para la caracterización. La digestión tisular durante 11 minutos produce un rendimiento robusto de células vivas, produciendo poblaciones de DCs y macrófagos que expresan altos niveles de CD11 B y CD-11 C que son fenotípicamente distintos.

Por el contrario, la digestión durante 50 minutos da como resultado un rendimiento celular similar en comparación con la digestión optimizada. Sin embargo, la delineación de diferentes poblaciones celulares utilizando CD 11 B y CD 11 C se vuelve más difícil. A medida que la expresión de CD-11 C disminuye y el número de células muertas aumenta.

Por lo tanto, al optimizar los parámetros para la digestión de los tejidos intestinales, se puede lograr rápidamente un rendimiento celular robusto. Como resultado, el aislamiento rápido de DCs intestinales y macrófagos de ratón puede ser útil para evaluar las propiedades funcionales de las células inmunitarias con antígenos de superficie intactos.