La inmunohistoquímica wholemount de Topografía Revelando Complex Brain
5 de abril de 2012
Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.
El objetivo general de este procedimiento es revelar patrones complejos de expresión génica en una estructura cerebral completa e intacta. Esto se logra primero perfundiendo el animal y extrayendo el cerebro. Luego, se disecciona el cerebelo y se procesa utilizando el protocolo de tinción en montaje completo.
El paso final consiste en visualizar la expresión génica mediante una reacción colorimétrica histoquímica. Finalmente, se utiliza microscopía de campo brillante para obtener imágenes de los patrones de expresión génica en la superficie. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunohistoquímica en cortes de tejido es la capacidad de visualizar patrones complejos en tres dimensiones sin necesidad de reconstrucción.
Quien demuestra el procedimiento es Joshua White, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Después de sacrificar al animal y extraer el cerebro del cráneo, separe el cerebelo del resto del encéfalo insertando primero las puntas de un par de pinzas en la parte media de los cuerpos callosos superior e inferior. Luego, utilizando un segundo par de pinzas, separe lentamente los cuerpos callosos y la corteza del cerebelo.
Oriente el cerebelo de modo que el lado anterior quede hacia abajo y el tronco encefálico apunte hacia arriba. Ahora inserte la pinza en el cuarto ventrículo entre el tronco encefálico y los lóbulos nueve y diez del cerebelo. Corte los pedúnculos presionando con la pinza en ambos lados y luego levante suavemente el cerebelo separándolo del tronco encefálico.
Postfije el cerebelo por inmersión en paraformaldehído al 4 % a cuatro grados Celsius durante un mínimo de 24 a 48 horas. El cerebelo puede almacenarse en paraformaldehído al 4 % durante un período prolongado de tiempo mientras se trabaja en una campana extractora. Vierta suavemente la solución de paraformaldehído y sustitúyala por fijador denso.
Coloque el tubo que contiene el cerebelo y la solución fijadora sobre un agitador y agite suavemente durante seis a ocho horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, vierta cuidadosamente la solución fijadora densa y sustitúyala por lejía concentrada. Incube el cerebelo en esta solución durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación continua al día siguiente.
Sustituya la solución en el tubo por metanol al 100 %. Coloque el tubo en el agitador y agite suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, sustituya la solución por metanol fresco al 100 % y repita la incubación para asegurar la deshidratación del cerebelo.
Ahora, congele y descongele el tejido en metanol al 100 % colocando el tubo en un recipiente con hielo seco y dejándolo congelar durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo, use pinzas para retirar el tubo del hielo seco y colóquelo sobre la superficie de trabajo para descongelarlo durante 15 minutos. Repita el procedimiento de congelación y descongelación al menos cuatro veces para mejorar la penetración de las soluciones de tinción.
Después del último descongelado, coloque el tubo en un congelador a menos 80 grados Celsius durante la noche. El tejido puede almacenarse durante períodos prolongados de tiempo a menos 80 grados Celsius, ya sea inmediatamente antes o después de los pasos de congelación-descongelación. De lo contrario, se debe continuar con el protocolo.
Al día siguiente, rehidrate el cerebelo mediante inmersión con agitación en 50% metanol, 50% PBS; luego 15% metanol, 85% PBS; y finalmente 100% PBS, durante 60 a 90 minutos cada uno a temperatura ambiente. A continuación, para el cerebelo de ratón adulto, someta el tejido a digestión enzimática con 10 microgramos por mililitro de proteinasa K en PBS durante dos a tres minutos a temperatura ambiente con agitación.
Este paso de digestión no es necesario para cerebelos de ratones de P cinco o menores. Después de la digestión, deseche inmediatamente la proteinasa K y lave el cerebelo en PBS tres veces durante 10 minutos cada vez para evitar una digestión excesiva. Después del último lavado, reemplace la solución con P-B-S-M-T y ROCK y deje en refrigeración durante la noche a cuatro grados Celsius para bloquear el tejido al día siguiente.
Vierta la solución bloqueante de P-B-S-M-T e incube el tejido en anticuerpo primario diluido en P-B-S-M-T, suplementado con 5 % DMSO, durante 48 horas a cuatro grados Celsius con agitación. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, lave el cerebelo de dos a tres veces, durante dos a tres horas cada vez, en P-B-S-M-T a cuatro grados Celsius con agitación para eliminar los anticuerpos primarios no unidos.
Luego, incubar el tejido en el anticuerpo secundario en una solución de P-B-S-M-T con 5 % de DMSO a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, con agitación, lavar el cerebelo en P-B-S-M-T como antes. A continuación, realizar un lavado final en PBT de una a dos horas con agitación a cuatro grados Celsius.
Este paso elimina el exceso de leche y mejora la claridad de la tinción. Finalmente, incube el tejido en la solución de DAB. Hasta que se alcance la intensidad de tinción óptima, es mejor usar DAB en la oscuridad.
Dado que la luz provoca la precipitación del cromógeno, lo que puede aumentar la coloración de fondo. El producto de reacción marrón debe ser claramente visible dentro de los 10 minutos cuando se alcance la intensidad óptima de tinción. Detenga la reacción colocando el cerebelo en PBS con 0,4 % de azida sódica.
El tejido puede almacenarse a largo plazo en esta solución. El tejido teñido en montaje completo debe observarse mientras está sumergido en PBS o en otro medio que proporcione un índice de refracción óptimo. Para facilitar la posición del montaje completo durante la observación, prepare un gel de agar al 1 % en una placa de Petri de plástico.
A continuación, corte pequeños orificios en el gel y luego inserte el cerebelo en estos orificios en la orientación deseada para la imagen. Cubra el cerebelo con PBS. El tejido teñido ya está listo para ser observado mediante microscopía óptica. ZEIN two Adelaide c.
La inmunohistoquímica revela bandas sagitales en secciones transversales del cerebelo. En el diagrama se etiquetan los labios cuatro, cinco y tres. A efectos de orientación, la barra de escala representa 500 micrones.
ZEIN dos. La C de Adelaide se expresa exclusivamente en subconjuntos de células kinji sata y dendritas. En esta imagen, la barra de escala representa 150 micrones.
Esta imagen muestra un encéfalo completo del cerebelo teñido para zein dos, Adela C, que revela bandas de células bikini en imágenes de las zonas anterior, central y posterior del cerebelo. Los números romanos indican los lóbulos cerebelosos. LS es el lóbulo simplex.
PML significa labial paramediano. COP indica los parámetros y etiquetas copulares. Corteza uno y corteza dos denotan los nombres de dos LOE de hemisferios, las designaciones P uno y P tres se basan en una nomenclatura estándar utilizada para indicar franjas específicas de BR dos.
Para más detalles, véase Sillitoe y Hawks 2002. La barra de escala representa un milímetro. Aquí, el cerebelo ha sido inmunotincionado con un anticuerpo contra el péptido regulado por la cocaína y la anfetamina (cocaine and amphetamine regulated transcript).
Puede observarse. Ese cart se expresa en subconjuntos de fibras trepadoras que atraviesan la capa de células de bikini etiquetada como PCL y terminan en la capa molecular etiquetada como ml. Aquí, la barra de escala representa 100 micrones.
Puede observarse en esta imagen que las fibras cart positivas proyectan unas franjas de dendritas de células de bikini en la capa molecular de la corteza cerebelosa, incluyendo regiones como el Oculus etiquetado como PFL y el Oculus etiquetado como fl. Al realizar este procedimiento, es importante recordar evitar cortar el cerebelo. Cualquier daño externo oscurecerá la visibilidad de los patrones de tinción complejos.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo revelar patrones complejos e interesantes de expresión génica en neuronas y en las fibras que las contactan en el cerebro intacto.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para revelar la topografía cerebral global mediante tinción inmunohistoquímica en preparaciones completas. La técnica permite la visualización de patrones complejos de expresión génica en tres dimensiones, aplicada específicamente al cerebelo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunohistoquímica
- Topografía cerebral
Antecedentes
- Los circuitos neuronales están organizados en compartimentos funcionales.
- Comprender la topografía cerebral es fundamental para la investigación en neurociencia.
- Los métodos tradicionales pueden no visualizar eficazmente patrones complejos.
- La tinción en montaje completo ofrece un enfoque novedoso para estudiar estructuras cerebrales.
Objetivo del estudio
- Revelar patrones complejos de expresión génica en estructuras cerebrales intactas.
- Mostrar la utilidad de la tinción inmunohistoquímica en preparación completa (wholemount).
- Visualizar los patrones de expresión génica en tres dimensiones.
Métodos Utilizados
- Perfusión del animal y extracción del cerebro.
- Diseción del cerebelo.
- Aplicación del protocolo de tinción en montaje completo.
- Visualización de la expresión génica mediante reacciones colorimétricas histoquímicas.
Resultados principales
- Visualización exitosa de los patrones de expresión génica en la superficie.
- Demuestra las ventajas del método frente a la inmunohistoquímica en secciones de tejido.
- Capacidad para observar patrones complejos sin necesidad de reconstrucción.
Conclusiones
- La técnica de tinción en preparación completa es efectiva para estudiar la topografía cerebral.
- Este método mejora la comprensión de la organización de los circuitos neuronales.
- Proporciona una herramienta valiosa para la investigación futura en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inmunohistoquímica en preparaciones completas permite la visualización directa de patrones complejos de expresión proteica en estructuras cerebrales intactas, proporcionando una vista tridimensional de la topografía molecular sin artefactos de reconstrucción. Este enfoque facilita la validación de objetivos al revelar distribuciones espacialmente resueltas de biomarcadores en circuitos neuronales relevantes para la enfermedad, aumentando la confianza predictiva en modelos preclínicos. El método es particularmente valioso para reducir los riesgos en programas dirigidos al SNC al aclarar las relaciones anatómico-funcionales al inicio del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cartografía de la expresión proteica en la arquitectura tridimensional nativa del cerebro.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la observación directa de la compartimentalización molecular.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al aclarar la localización de biomarcadores en las vías cerebelosas y aferentes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para análisis posteriores mediante la conservación de la topología intacta del tejido.
- Valor operativo: Aborda la estandarización de ensayos mediante protocolos reproducibles de tinción en montaje completo.
- Escalabilidad: Destaca la reutilización de la plataforma para estudios comparativos entre especies y etapas del desarrollo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Traductiva: Analiza la relevancia de la enfermedad mediante la visualización de proyecciones aferentes y la topografía molecular.
- Alineación Preclínica: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica, utilizando zebrinII/aldolaseC como ejemplo de biomarcador.
- Decisiones Ajustadas al Riesgo: Se centra en la reducción predictiva de riesgos al revelar patrones complejos en la conformación nativa.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, apoyando la reducción de riesgos biológicos y la aclaración de vías en la investigación del SNC.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis al revelar patrones de expresión génica en lóbulos y zonas cerebelosos intactos.
- Selección: Describe la preparación del ensayo mediante tinción e imagen estandarizadas de la expresión génica superficial en tres dimensiones.
- Análisis: Destaca lecturas cuantitativas obtenidas a partir de reacciones colorimétricas histoquímicas que permiten comparar la intensidad de expresión entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica mediante la visualización de proyecciones de fibras aferentes y sus campos terminales en capas moleculares.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable para estudios comparativos de topografía en modelos de roedores y regiones cerebrales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en la cartografía de circuitos neuronales.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la tinción en preparaciones completas para análisis de patrones de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas del desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos espacialmente resueltos de biomarcadores.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en neuroanatomía, inmunohistoquímica y microscopía.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo micrótomos, agitadores orbitales, congeladores y microscopios de campo claro.
- Requisitos de estandarización entre equipos para protocolos de fijación, deshidratación, bloqueo e incubación con anticuerpos.
- Consideraciones de adaptación entre sistemas modelo, incluyendo cerebelos de ratón y rata, y diferentes etapas del desarrollo.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía, como evitar daños mecánicos durante la disección para preservar la claridad de la tinción.
