Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

El objetivo general del siguiente procedimiento es medir la cinética y progresión del ciclo celular. Primero, las células se marcan mediante el método de pulso-captura con romo, deoxiuridina o BRDU, que se incorpora al ADN celular en lugar de timidina. Luego, las células se inmunotincionan con anticuerpos contra BRDU y se analizan mediante citometría de flujo inmediatamente después de la tinción.

Solo las células en fase S quedan marcadas, ya que las células marcadas avanzan a través del ciclo celular hacia G dos. Se detectan con un contenido de ADN de cuatro N tras la mitosis. El contenido de ADN se reduce a dos N. Por lo tanto, el análisis de los perfiles de fluorescencia generados por citometría de flujo puede utilizarse para determinar la cinética de la progresión del ciclo celular.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros protocolos que utilizan productos químicos para la sincronización celular es que no existen perturbaciones fisiológicas que puedan afectar inadvertidamente al mecanismo de división celular. Utilizamos este método por primera vez cuando nuestros intentos de estudiar la velocidad de progresión del ciclo celular mediante sincronización química nos dieron resultados inesperados que interfirieron con nuestro análisis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular.

Por ejemplo, ¿cuál es la base de las tasas diferenciales de crecimiento entre diferentes tipos de células? Comience este protocolo con una marcaje pulsado y posterior seguimiento de las células con BRDU para hacer esto. Comience marcando una placa de 10 centímetros para cada punto temporal, más una para cada uno de los siguientes controles.

BRDU solo, PI solo, BRDU negativo, PI negativo. Siembre cada placa con cinco veces 10 a la quinta células MCF7 en DMEM suplementado. Incube las placas durante 24 a 48 horas para permitir que las células se recuperen y se adhieran. Una vez que las células alcancen el 60 % de confluencia, reemplace el medio con DMEM fresco que contenga 10 micromolares.

Incube las células con BRDU durante una hora a 37 grados Celsius y 5 %CO2 para permitir la incorporación de BRDU en el ADN. Asegúrese de dejar una placa sin tratar para utilizarla como control negativo o punto de tiempo cero tras una hora. Retire el medio de marcado por pulso y enjuague brevemente las células con PBS para los puntos de tiempo de dos a ocho horas.

Añada medio de crecimiento fresco y coloque las placas nuevamente en el incubador. Luego, coseche inmediatamente las placas de los puntos temporales cero y una hora según se describe en la siguiente sección. Para cosechar las células, aspire el medio y enjuague la placa.

Una vez con PBS, luego la tripsina actúa sobre las células para desprenderlas de la placa y recogerlas en DMEM, centrifugando a 390 ×g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante. A continuación, lave las células con uno a cinco mililitros de PBS frío, centrifugue a 390 ×g durante cinco minutos; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y re suspenda las células en cien microlitros de hielo.

PBS frío que contiene 1 % de FBS. El FBS ayuda a prevenir la agregación celular. Uno de los aspectos más importantes de este procedimiento es asegurarse de que se tenga una suspensión de células individuales a partir de las células recolectadas.

Para hechos. Para lograr esto, puede agregar sus células directamente a la etanol gota a gota. Esto es crítico. A continuación, para fijar las células, use la pipeta para agregar las células gota a gota a cinco mililitros de etanol helado.

Etileno al 70 % en un tubo cónico de 15 mililitros. Incubar las células en hielo durante 30 minutos o almacenarlas a cuatro grados Celsius durante la noche. Este es un paso ideal para detener la recolección de muestras de los diferentes puntos temporales; las muestras pueden dejarse en etanol durante varios días, lo que permite procesarlas simultáneamente en el resto del protocolo para realizar la tinción con BRDU y yoduro de propidio.

Retire las células de cuatro grados Celsius y centrifúgelas a 390 ×g durante cinco minutos. Tras la centrifugación, aspire la mayor parte del fijador dejando aproximadamente 50 microlitros. Luego, vortex.

Para aflojar el sedimento y desnaturalizar el ADN durante la agitación en vórtex. Añada lentamente un mililitro de HCl dos normal con Triton X-100 gota a gota, luego incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos. Sedimente las células centrifugando las muestras durante cinco minutos a 390 ×g; a continuación, aspire y deseche el sobrenadante.

Luego, resuspenda el sedimento celular en un mililitro de borato de sodio 0,1 molar. Tras centrifugar, aspire nuevamente las células y deseche el sobrenadante. A continuación, resuspenda el sedimento celular en 75 microlitros de tinción de BRDU.

Mezcle e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos, protegido de la luz tras la incubación. Pelé las células por centrifugación como antes y resuspenda el botón celular en un mililitro de PBS que contenga cinco microgramos por mililitro de yoduro de propidio. Al analizar la muestra positiva para yoduro de propidio en el citómetro de flujo, cree un gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral para asegurar la distribución adecuada del tamaño celular.

Ambos parámetros deben representarse en una escala lineal. Visualice simultáneamente un gráfico de FL tres H frente a FL dos W para observar la tinción con PI frente al ancho del pulso de fluorescencia. Este gráfico se utiliza para crear una compuerta que aísle la fracción de células que se considera que se encuentra dentro del patrón de distribución normal del ciclo celular.

En general, este patrón de distribución se caracteriza por dos grupos de células con contenidos de N y cuatro NDNA de la tinción con PI, que representan las fases G uno y G dos del ciclo celular, respectivamente. Una cadena de células ubicada entre estos dos grupos representa la replicación continua de ADN que ocurre en la fase S del ciclo celular. Cree un gráfico que muestre las células seleccionadas con FL uno H o FITC en una escala logarítmica en el eje Y y PI en una escala lineal en el eje X.

Este gráfico se utilizará para establecer los parámetros restantes mediante los diversos controles, así como para recopilar datos. Para el análisis, coloque la muestra teñida solo con PI en el puerto de carga del citómetro de flujo y ajuste la ganancia para posicionar G1 aproximadamente en 200 en el eje x. Será más fácil visualizarlo en un gráfico de histograma de la tinción con PI.

A continuación, coloque la muestra solo con BRDU en el puerto de carga y ejecute. Ajuste la ganancia de modo que las dos poblaciones de células, positivas y negativas para BRDU, aparezcan en el gráfico. Idealmente, las células negativas para BRDU deben ubicarse justo en o por debajo de 10 a la potencia de uno.

El control final es la muestra negativa de BDU más PI. Ejecute este control negativo para asegurarse de que las células no aparezcan en ninguno de los cuadrantes superiores ni derechos. Una vez que se hayan establecido los parámetros de los distintos gráficos, se calibra el citómetro de flujo y queda listo para procesar las células teñidas con BRDU y PI. Recolecte datos de un mínimo de 10.000 células seleccionadas mediante PI para cada muestra.

Luego, utilizando software como FlowJo o FACS Diva, cree un gráfico de FITC frente a PI con las células seleccionadas como positivas para PI a partir del gráfico de dos parámetros de PI frente a FL. Para distinguir la población en ciclo. A continuación, genere una segunda compuerta para aislar la población positiva para BRDU.

Luego, para rastrear el curso temporal de la progresión del ciclo celular, grafique el número de células positivas para BRDU con contenido en G uno o G dos en función del tiempo, a fin de comparar la progresión del ciclo celular. La cinética entre las dos líneas celulares colorrectales HT 29 y LS 180. Las células se recolectaron cada hora durante ocho horas tras la eliminación del pulso de A-B-R-D-U.

Al comparar la cinética de los dos perfiles, es evidente la aparición de un pico en G uno a las t igual a cuatro horas posteriores a BRDU en las células LS 180 en comparación con el punto temporal correspondiente para la línea celular HT 29, que carece de este pico. Esto indica una progresión acelerada del ciclo celular a través de la fase G dos del ciclo celular. En la línea celular colorrectal LS 180 para generar un perfil de ciclo de la línea celular de cáncer de mama.

Se recolectaron células MC siete cada hora durante ocho horas. Tras la eliminación del pulso de BRDU, las células marcadas por inmunomarcaje y con tinción de contraste de ADN se clasificaron según sus señales fluorescentes.

Como puede observarse aquí, las células CF7 ciclaron a una velocidad significativamente más lenta que cualquiera de las dos líneas celulares de cáncer colorrectal evaluadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la marcación metabólica del ADN en conjunto con la recolección en puntos temporales permite rastrear la cinética del ciclo celular.