Único ovocito Mutagénesis bisulfito

El objetivo general de este procedimiento es analizar la metilación del ADN en un solo ovocito. Esto se logra eliminando primero las células del cúmulo y la palita de jabón de los ovocitos recolectados. El segundo paso es incrustar el ovocito en una solución de lisis de dos a uno para proteger la pequeña cantidad de ADN de la pérdida o degradación.

A continuación, se realiza la mutagénesis del bisulfito, seguida de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa anidada. El paso final es ligar y clonar el producto de PCR. A continuación, los clones se seleccionan, se amplifican por PCR y se envían para su secuenciación.

En última instancia, la mutagénesis y secuenciación de bisulfito se utiliza para mostrar la metilación del ADN en la guina de fosfato de citosina, o dinucleótidos CPG de una región de interés en un solo ovocito. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la mutagénesis de bisulfito de grandes cantidades de células, es que los datos se pueden obtener de un solo ovocito sin agrupar los citos, el sesgo de PCR y la contaminación de las células de quimioterapia. El día de la recolección de ovocitos, prepare las soluciones enumeradas en el protocolo escrito al hacer soluciones, reduzca la posibilidad de contaminación del ADN cambiando los guantes con frecuencia y usando puntas de filtro, también mantenga los tubos en ángulo cuando estén abiertos y vuelva a tapar todos los tubos cuando no estén en uso.

Comience la recolección de OSI colocando los ovacueductos de ratón disecados en medios M dos y rasgando la polea M para extraer el complejo de células del cúmulo. A continuación, separe los citos del complejo de células del cúmulo utilizando 0,3 miligramos por mililitro de solución de hialuronidasa en una gota de 30 microlitros de medio M dos. Mantenga los citos en solución solo el tiempo que sea necesario para eliminar las células del cúmulo, ya que una exposición prolongada puede dañarlas.

Lave los ovocitos en gotas de 30 microlitros de M dos medios transfiriendo los ovocitos de gota a gota. Retirar las células del cúmulo periódicamente durante un total de tres lavados. Elimine la Z de LUCITA con una solución ácida de tiro.

Primero coloque los ovocitos en una gota de solución de 30 microlitros, luego transfiéralos a otra gota de 30 microlitros. Como cualquier medio que se lleve consigo, diluirá el ácido y reducirá su eficiencia. Mantenga los citos en solución solo el tiempo que sea necesario para eliminar la zona, ya que una exposición prolongada puede dañarlos.

Después de la extracción de la zona, lavar los citos nuevamente en una gota de 30 microlitros de M dos medios para realizar agros incrustando primero coloque la solución de lisis en un bloque de calor a 70 grados centígrados. Agregue el punto de fusión bajo precalentado, o LMP Agros a la solución de lisis, produciendo una solución de AGROS a lisis de dos a uno. A continuación, coloque un solo ovocito en un portaobjetos de vidrio limpio en un medio mínimo M dos.

El siguiente paso es incrustar el cite único en la solución de Agros y lisis. Esto debe hacerse rápidamente, ya que los agros se endurecerán a temperaturas inferiores a 65 grados centígrados. Tome 10 microlitros de la solución de lisis Agros en una punta de pipeta bajo un microscopio.

Expulse suavemente aproximadamente un microlitro o menos de la solución de lisis agrícola en el portaobjetos de vidrio, permitiendo que se mezcle con el medio mínimo. Recoge suavemente el ovocito en la punta de la pipeta. A continuación, pon los 10 microlitros en un tubo de einor con 300 microlitros de aceite mineral para que la cuenta resultante adquiera una forma esférica.

Incubar el tubo en hielo durante 10 minutos para realizar la lisis. Retire los 300 microlitros de aceite mineral y agregue 500 microlitros del tampón de lisis SDS. Incubar la muestra durante la noche en un baño de agua a 50 grados centígrados el segundo día.

Prepare las soluciones de mutagénesis de bisulfuro frescas como se describe en el protocolo escrito. Comience la mutagénesis eliminando por completo los 500 microlitros de tampón de lisis SDS. Tenga en cuenta que cualquier tampón de lisis restante diluirá el agros cuando se caliente y la perla será más susceptible a disolverse en los pasos posteriores.

Después de la eliminación completa del tampón de lisis, agregue 300 microlitros de aceite mineral. Incubar la muestra durante dos minutos y medio en un bloque de calor a 90 grados centígrados. Tome quilates para mezclar o revolver, extender o fluctuar la temperatura.

Después de dos minutos y medio. Incubar la muestra en hielo durante 10 minutos. Para realizar la desnaturalización, retire el aceite mineral y agregue un mililitro de hidróxido de sodio 0.1 molar al tubo e invierta el tubo de cinco a seis veces.

Incubar la muestra durante 15 minutos. En un baño de agua ajustado a 37 grados centígrados invirtiéndose cada tres o cuatro minutos, la perla debe flotar en el hidróxido de sodio. Tenga en cuenta que la cuenta ya no está en la parte inferior del tubo.

Para realizar un tratamiento con sulfitos, primero gire el tubo suavemente después de eliminar el hidróxido de sodio. Agregue 300 microlitros de aceite mineral y 500 microlitros de solución de sulfito BIS. Tenga cuidado de evitar la exposición a la luz e incube el tubo durante tres horas y media en un baño de agua a 50 grados centígrados.

Ahora realiza la desinación. Primero incube la muestra en hielo durante tres minutos antes de retirar la solución de aceite mineral y sulfito BIS. Después de un giro suave, agregue un mililitro de hidróxido de sodio 0.3 molar e invierta el tubo de cinco a seis veces.

Incubar la muestra durante 15 minutos. En un baño de agua a 37 grados centígrados que se invierte cada tres o cuatro minutos, nuevamente, la perla debe flotar en el hidróxido de sodio antes de comenzar la PCR. Lave las muestras girando primero suavemente.

A continuación, retira el hidróxido de sodio y añade un mililitro de un xte pH 7,5. Agite durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Después de un segundo giro suave, retire el XTE.

Repite este proceso de lavado dos veces. Luego agregue un mililitro de autoclave, agua destilada doble. Agite durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente, gire suavemente por tercera vez y retire el agua.

Repita el lavado con agua destilada dos veces. Finalmente, retire todo el sobrenadante, dejando solo la cuenta de aros. Compruebe que el pH del sobrenadante sea 5,0.

Si el sobrenadante sigue siendo demasiado básico, vuelva a lavar las perlas con agua destilada doble. Mientras tanto, agregue la mezcla de PCR de primera ronda al tubo de PCR como se describe en el protocolo escrito. Deslice el solid agro speed hasta el borde del tubo einor.

Luego, transfiera con cuidado la velocidad del agro al tubo de PCR y caliente a 70 grados centígrados durante un minuto y mezcle y luego amplifique se sugiere en el protocolo escrito. Después de la amplificación de la primera ronda, prepare la reacción de PCR de la segunda ronda utilizando cinco microlitros del producto de la primera ronda como plantilla. Asegúrese de bipa debajo de la capa de aceite mineral.

Proceda a realizar la segunda ronda de amplificación como se indica en el texto como prueba diagnóstica. Las muestras de segunda ronda se pueden cortar con una enzima de restricción, es decir, metilación o electroforesis específica de la cepa, los productos de digestión en un gel de acrilamida al 8%. Las bandas heterogéneas resultantes representan más de una secuencia para clonar el ligado del producto de segunda ronda en el vector y realizar la clonación de TA como se describe en el manuscrito que acompaña a este video después de la placa de clonación de TA, toda la reacción se mezcla en una placa de agar y LB, suplementada con ampicilina, ex gal e IPTG e incuba la placa a 37 grados Celsius durante la noche.

A continuación, añada la mezcla maestra de PCR de colonias al tubo de PCR como se indica en el protocolo escrito. Elija una colonia bacteriana blanca de la placa con una punta de pipeta y gírela en 35 microlitros de la mezcla maestra de PCR de la colonia en un tubo de PCR. Proceda a amplificar la suspensión como se describe en el texto después de la electroforesis de amplificación por PCR de cuatro microlitros del producto PCR en un gel AGROS al 1,5%.

Por último, envíe aproximadamente 30 microlitros del producto de PCR para la secuenciación de cinco PCR de colonias por cito. Una vez obtenidos los resultados de la secuenciación, se pueden leer los patrones de metilación de cualquier citosina guanina original que haya permanecido como tal. Por el contrario, cualquier citosina guanina original que ahora es una guanina de tiamina se desmetiló después de la amplificación de PCR anidada utilizando cebadores convertidos en bisulfito.

Es posible confirmar una conversión exitosa visualizando un tamaño de fragmento correcto en una metafase individual de gel aros. Dos ovocitos representan un alelo parental y, en teoría, tienen un patrón de metilación impreso como tal. Los productos de PCR de segunda ronda se pueden analizar para detectar contaminación no intencional.

Se puede utilizar una enzima de restricción sensible a la metilación del ADN para digerir el producto de PCR de segunda ronda para evaluar si contiene un alelo metilado o no metilado. Aquí, se escinde una citosina metilada dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima. Mientras que una citosina no metilada que se convierte en timina ya no es reconocida por la enzima y no se corta, cualquier muestra de ovocito en metafase dos que contenga alelos metilados y no metilados debe descartarse, ya que es indicativa de contaminación de células cúmulos o inclusión de cuerpos polares después de la ligadura y transformación.

La amplificación exitosa de la PCR de colonias se puede visualizar en un gel AROS para garantizar que las muestras con el tamaño de producto correcto se envíen para su secuenciación. Para este ejemplo, el tamaño esperado del amplicón después de la ligadura es de ciento 56 pares de bases. Aquí, el clon cinco tiene un tamaño de amplicón incorrecto y no debe enviarse para su secuenciación.

La secuencia de cinco clones individuales de un ovocito en metafase dos debería producir cinco patrones de metilación idénticos y tasas de conversión no CPG idénticas. Cualquier muestra que contenga más de un patrón debe descartarse. Dado que los dos citos de la metafase ovulada tienen dos copias cromosómicas o un cuerpo polar adjunto, existe la posibilidad de obtener dos patrones de secuencia similares.

Los datos deben descartarse de cualquier cito que tenga patrones de metilación muy diferentes. Dado que no se puede descartar la contaminación de las células cúmulos Al intentar este procedimiento, es importante recordar primero lavar los ovocitos varias veces en medio fresco, siguiendo el tratamiento con HI IDE para eliminar la mayor cantidad posible de células cúmulas. En segundo lugar, los agros de bajo punto de fusión se endurecerán a temperaturas inferiores a 65 grados centígrados, así que trabaje con cuidado pero rápidamente.

Y, por último, el sulfato de bis de sodio y la hidroquinona son sensibles a la luz, por lo que los tubos y soluciones de reacción deben envolverse en papel de aluminio.