Las formulaciones para la liofilización de las bacterias y su influencia en la supervivencia celular

El objetivo del siguiente experimento es observar el efecto que diferentes tipos de formulaciones para liofilización tienen sobre la supervivencia celular. Para comenzar, se preparan distintas formulaciones para liofilizar cultivos celulares. A continuación, cada formulación se mezcla con el cultivo celular, luego se liofiliza, se rehidrata posteriormente y se miden las tasas de supervivencia.

Los resultados muestran diferencias en las tasas de supervivencia que pueden relacionarse con las propiedades caracterizadas. Este método puede ayudarle a comprender qué propiedades físicas y estructurales de una formulación son importantes para la supervivencia celular durante la deshidratación. Para preparar un cultivo inicial de pseudomonas putter, comience por inocular 100 mililitros de caldo tripticasa de soja, o TSB, con una colonia de células que se hayan cultivado en agar suplementado con caldo tripticasa de soja o TSB; incube el cultivo a 30 grados Celsius, agitando a 130 RPM durante siete horas.

Transfiera una alícuota del cultivo a TSB fresco y crezca durante 16 horas. Recopile las células mediante centrifugación a 1.500 ×g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave el sedimento celular mediante Resus, suspendiéndolo en cloruro de sodio 150 milimolar.

Centrifugar las células y resuspender. Suspenderlas en medio de formulación. Para preparar soluciones de formulación para la liofilización de células.

Pese los componentes de la matriz respectivos y disuélvalos en agua para alcanzar condiciones isotónicas. Ajuste la solución con el excipiente, cloruro de sodio, u otros solutos compatibles con las células. Para resuspender homogéneamente las células en una solución de baja viscosidad, agite en vórtex las soluciones de alta viscosidad.

Agregue una barra magnética y agite la mezcla. A continuación, divida las formulaciones en viales para liofilización previamente pesados y pese los viales. Tome 100 microlitros de cada muestra y realice diluciones seriadas de diez en diez; plaque las diluciones deseadas e incube a temperatura ambiente. Si los viales se van a sellar dentro del liofilizador, coloque un tapón de hule en cada vial a partir de las células plaqueadas.

Enumere las células en cada formulación. Utilizando el método du Nouy, mida la tensión superficial de las mezclas bacterianas secas. Limpie el anillo de platino colocándolo en una llama incolora hasta que se vuelva rojo.

Utilice acetona y un tejido sin pelusa para enjuagar y limpiar el recipiente de medición, y use una llama para quemar el interior. Llene el recipiente con la solución y deje que la superficie se estabilice antes de medir, en el caso de soluciones que tardan en alcanzar el equilibrio. La configuración utilizada aquí proporcionará datos cualitativos para formulaciones con altas viscosidades.

Utilice una solución de concentración más baja para medir la tensión superficial y extrapole que las condiciones de liofilización deben ajustarse a las propiedades físicas de la formulación. El parámetro más importante es la temperatura de transición vítrea o TG de la formulación, denotada como TG prima para la muestra concentrada por congelación, lo que indica que aún está presente agua. Para determinar el comportamiento de congelación de la fórmula, encierre de cinco a diez miligramos de la muestra en un recipiente de aluminio para calorimetría diferencial de barrido o DSC, con tapa.

Prepare una cápsula vacía como referencia. Configure el programa de barrido de temperatura del DSC para imitar el paso de congelación en el programa de liofilización. Esto se realiza porque la cinética de enfriamiento puede influir en la TG prima de las formulaciones no liofilizadas antes de que comience el barrido de calentamiento.

Reduzca la temperatura considerablemente por debajo de la tg esperada. En primer lugar, para las formulaciones investigadas, elija una velocidad de calentamiento adecuada. La señal de flujo de calor registrada se expresa en vatios y será influenciada por la velocidad de calentamiento.

Una velocidad de calentamiento más alta proporcionará una señal más grande de TG prima; establezca el rango de temperatura de modo que abarque tanto la TG prima como la fusión de la formulación. Una vez determinado el comportamiento de congelación, ajuste los parámetros del proceso de liofilización para que la temperatura de la muestra esté siempre por debajo de la TG de la muestra y de manera que la presión de la cámara permita la sublimación rápida del hielo y del agua residual en la formulación. Para proteger los productos secos tras la liofilización.

Controle la atmósfera de la muestra sellando las muestras en el liofilizador antes de liberar el vacío al final del ciclo de liofilización. Alternativamente, los viales pueden llenarse con una atmósfera preferida. Es importante evitar exponer las muestras a las condiciones ambientales, ya que cualquier humedad u oxígeno presente en la atmósfera de almacenamiento influirá en la supervivencia de las células.

Finalmente, pese los viales para analizar las muestras mediante rayos X. Coloque una pequeña cantidad de la matriz bacteriana sobre un portamuestras y monte el portamuestras en el refractómetro de rayos X. Utilice el software compatible con el equipo de rayos X para analizar cualquier fase cristalina presente en la muestra.

Para analizar la matriz bacteriana mediante microscopía electrónica, monte una pequeña cantidad sobre cinta de carbono fijada en un portaobjetos para microscopía electrónica de barrido. Introduzca el portaobjetos en un evaporador de oro y paladio o platino, y recubra la muestra para obtener imágenes. Coloque el portaobjetos en la cámara del microscopio y seleccione los parámetros de imagenación adecuados.

Por ejemplo, en este instrumento utilizamos un voltaje de aceleración de cinco kilovoltios, un tamaño de punto de tres, una distancia de trabajo de cinco milímetros y el detector de electrones secundarios. Esta tabla enumera los datos de diferentes formulaciones, incluidos los eventos térmicos registrados por DSC durante el calentamiento de las formulaciones congeladas, la estructura de las muestras secas y la tensión superficial de las soluciones de formulación. La temperatura de transición vítrea (Tg') de la sacarosa es de menos 40 grados Celsius y puede ser difícil detectar concentraciones de sacarosa inferiores al 20 % en peso por peso.

El evento térmico a menos 35 grados Celsius probablemente esté relacionado con el inicio de la disolución del hielo mostrado aquí. Datos de supervivencia para la bacteria gramnegativa P putter y la bactería grampositiva, a CHLOROPHYL cus, formuladas en diferentes formulaciones basadas en sacáridos. Obsérvese que la tendencia en la capacidad de la formulación para mantener la supervivencia celular es similar en ambas especies bacterianas.

Este gráfico ilustra la correlación entre la supervivencia tras la liofilización y las tensiones superficiales de las formulaciones, lo que indica que tensiones superficiales más altas producen mayores tasas de supervivencia. Las imágenes de MEB mostradas aquí representan formulaciones secas de cuatro polímeros diferentes cuyas matrices presentan el aspecto de papel crujiente o láminas lisas interconectadas con patrones corrugados de bacterias embebidas para fi, ccal y sacarosa. Las láminas tienen aproximadamente un micrón de grosor y entre 10 y 20 micrones de ancho, siendo la superficie de fi ccal más lisa que la de HPMC y HEC, que forman láminas mucho más delgadas.

Y las bacterias son más fácilmente visibles, posiblemente porque la relación polímero-bacteria es menor en estas formulaciones a base de celulosa. Además, se observaron cristales de sal en HEC y HPMC, siendo este último el que mostró una mayor cantidad de precipitados en la superficie de las láminas de polímero. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la supervivencia celular depende de las propiedades de la formulación utilizando las técnicas mostradas aquí.