Protocolos de tinción de islotes pancreáticos humanos
May 23rd, 2012
Este vídeo muestra los procedimientos para la caracterización de los islotes pancreáticos humanos con hematoxilina y eosina (H & E) e inmunohistoquímica (IHC). Secciones de páncreas de la cabeza, el cuerpo y las regiones de la cola se tiñen tanto por H & E y de IHC para determinar la composición endocrina islote (insulina, glucagón y polipéptido pancreático), la replicación celular (Ki 67), e infiltrado inflamatorio (H & E, CD3). La región se localiza uncinado con IHC para el polipéptido pancreático.
El objetivo general de este procedimiento es caracterizar los ojales pancreáticos humanos mediante tinción de hematina y eosina e inmunohistoquímica. Esto se logra mediante la creación de secciones en serie a partir de una muestra de páncreas incrustada en un bloque de parafina. A continuación, las secciones se colocan en portaobjetos en su orientación original.
Una parte de los portaobjetos se tiñe con hematina y eoína, mientras que los portaobjetos restantes se tiñen mediante inmunohistoquímica, el paso final es escanear los portaobjetos teñidos y organizarlos por caso. En última instancia, estas imágenes se pueden cargar en una base de datos de patología en línea donde pueden ser vistas por otros investigadores en el campo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que los portaobjetos se tiñen en serie manteniendo su orientación original.
La demostración del procedimiento estará a cargo de Linda Snyder, tecnóloga de histo, Emily Montgomery, científica biológica, y Tiffany Hippo, técnica de laboratorio en mi laboratorio. Para comenzar, configure el baño de agua y el micrótomo siguiendo los procedimientos estándar para la microtomía de parafina. A continuación, etiquete los portaobjetos cargados positivamente con el número de caso, la región del páncreas y el número de portaobjetos.
Una vez que todo esté preparado, coloque el bloque de parafina en el mandril del micrótomo con la etiqueta del casete en el lado izquierdo. Después de los procedimientos normales de microtomía, corte el bloque hasta que el tejido quede expuesto uniformemente. Una vez que el tejido se encuentre uniformemente, produzca una cinta de secciones seriadas de aproximadamente cuatro micras de grosor.
Se necesitan de tres a seis secciones dependiendo del número de manchas iniciales requeridas. A continuación, separe las secciones de la cinta. Toma cada sección en orden y colócala en un tobogán.
Anota el número de sección con un lápiz. Si una sección está inutilizable, omita ese número y continúe numerando las secciones en el orden exacto. Tenga cuidado de mantener la misma orientación en la diapositiva que se encuentra en el casete con la etiqueta de la diapositiva orientada hacia la izquierda.
A continuación, coloque los portaobjetos en una rejilla para portaobjetos y déjelos secar durante la noche. A temperatura ambiente, vuelva a sellar la superficie del bloque de parafina con una capa delgada de parafina para preservar el tejido y archivarlo a temperatura ambiente o menos 20 grados centígrados. Repita este procedimiento para la siguiente muestra.
Es importante mantener la numeración de las secciones en serie en cada nivel, como se ha visto anteriormente de la tinción h y e. Coloque el primer portaobjetos de cada bloque en una rejilla de portaobjetos y, a continuación, coloque la rejilla en la primera bandeja del tinte automático. Seleccione el programa HE estándar e inicie el proceso de tinción.
Cuando termine de manchar, retire los portaobjetos del tinte automático y colóquelos en el capó para que la cubierta se deslice. Coloque un cubreobjetos en cada portaobjetos utilizando técnicas estándar. Por último, etiquete los portaobjetos con una etiqueta impresa y deje que se sequen completamente en la campana.
Comience configurando el tinte automático y preparando todos los reactivos necesarios. Elija el programa Daco para manchas dobles. Introduzca el número de portaobjetos y el tratamiento que recibirá cada uno.
Cargue todos los reactivos en el tinte automático de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. A continuación, prepare el TBST y el citrato, los tampones, los anticuerpos y otros reactivos necesarios para el procedimiento. Prepare los portaobjetos colocándolos en xileno durante cinco minutos.
No permita que los portaobjetos se sequen, ya que esto dará como resultado un fondo excesivo y manchas de poros mientras los portaobjetos están desgastados. Vierta el tampón de citrato en una vaporera para precalentar antes de usar. A continuación, someta las diapositivas de depa a una serie de lavados con etanol.
Enjuague los portaobjetos por última vez con agua desionizada. Agregue los portaobjetos al tampón de citrato precalentado y déjelos cocer al vapor durante 30 minutos. Después de este período, transfiera inmediatamente los portaobjetos a un baño de agua a temperatura ambiente hasta que se enfríen por completo.
Una vez enfriados, transfiera los portaobjetos a los racks Dayco auto Stainer, teniendo cuidado de mantener la secuencia adecuada. Por último, ejecute el programa de tinción doble que se cargó anteriormente cuando se haya completado el programa de tinción doble. Retire los portaobjetos del tinte automático y déjelos secar durante al menos una hora antes de deshidratarlos.
Para continuar con la deshidratación, transfiéralos al 80%etanol durante un minuto. Continúe deshidratando los portaobjetos sumergiéndolos en etanol al 95% y luego al 100%. Por último, sumerja y sostenga los portaobjetos en xileno durante un minuto.
Monte inmediatamente los portaobjetos con los cubreobjetos utilizando el sello Cyto Para completar el procedimiento. Imprima etiquetas que contengan la información del caso, incluido el número de órgano y bloque, el tipo de mancha y la fecha. Coloque una etiqueta en cada portaobjetos para escanear los portaobjetos.
Colóquelos en una bandeja de escáner y siga los procedimientos estándar. Archive los portaobjetos de tinte a temperatura ambiente y los portaobjetos restantes sin teñir a menos 20 grados centígrados para su uso futuro. Por último, organice las imágenes teñidas por donante y tipo de tejido observado.
A continuación, se muestra un ejemplo de tinción con KI 67 más insulina a niveles bajos y altos de aumento. Las imágenes de las secciones pancreáticas teñidas se envían a una base de datos de patología en línea creando un biobanco virtual. Con esta base de datos, los investigadores pueden acceder rápidamente a la información necesaria para la investigación y la diabetes tipo uno.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y teñir portaobjetos de alta calidad del páncreas humano.
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Visión general
Este video demuestra procedimientos para la caracterización de los islotes pancreáticos humanos utilizando tinción de hematoxilina y eosina (H&E) e inmunohistoquímica (IHC). La técnica permite la evaluación de la composición endocrina del islote, la replicación celular y los infiltrados inflamatorios.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Endocrinología
- Histología
Antecedentes
- Los islotes pancreáticos humanos juegan un papel crucial en el metabolismo de la glucosa.
- La caracterización de la composición del islote es esencial para entender la diabetes.
- H&E e IHC son técnicas estándar para el análisis de tejidos.
- Mantener la orientación original de las diapositivas es crítico para una evaluación precisa.
Propósito del estudio
- Caracterizar los islotes pancreáticos humanos.
- Determinar la composición endocrina de los islotes.
- Evaluar la replicación celular y las respuestas inflamatorias.
Métodos utilizados
- Crear secciones seriadas de muestras de páncreas embebidas en parafina.
- Tinción de secciones con H&E e IHC.
- Escaneo de diapositivas teñidas para análisis.
- Organización de imágenes por caso para carga en base de datos.
Principales resultados
- Identificación de insulina, glucagón y polipéptido pancreático en los islotes.
- Evaluación de la replicación celular utilizando tinción Ki67.
- Evaluación de infiltrados inflamatorios a través de tinción H&E y CD3.
- Localización exitosa de la región uncinada utilizando IHC.
Conclusiones
- El método proporciona una caracterización completa de los islotes pancreáticos.
- Mantener la orientación original de las diapositivas mejora la precisión del análisis.
- Los resultados contribuyen a la comprensión de la función pancreática en salud y enfermedad.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Standardized histopathology workflows for human pancreatic islets enable reproducible endocrine cell characterization, supporting target validation in diabetes research. By preserving serial section orientation and generating digitized whole-slide images, the method facilitates cross-functional data sharing and biobanking for mechanistic de-risking of islet-targeted therapies. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantifiable, spatially resolved data on islet composition, replication, and immune infiltrates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through rigorous histopathology and immunolocalization of islet endocrine cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing islet morphology, size, density, and endocrine cell composition using H&E and IHC stains.
- Predictive Value: Assists in portfolio triage by evaluating islet replication and apoptotic cells via Ki67 and other proliferation markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized processing of human pancreas into defined regions (head, body, tail) and transverse sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility by numbering and alphabetically denoting subsections based on size for complete cross-sectional analysis.
- Platform Value: Highlights screening readiness and scalability via digitized whole-slide images organized in an online pathology database accessible to over 200 researchers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by evaluating islets for inflammation, fibrosis, amyloid, and T-cell infiltrates using H&E and CD3 staining.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by assessing both endocrine and exocrine compartments, including ductular pathology and neoplasia.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by characterizing pancreatic intraductal neoplasia and its relationship to the duct system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment by enabling serial sectioning, standardized staining, and digital biobanking of human pancreatic tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through histopathology and immunolocalization of pancreatic islets and endocrine cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility by maintaining original slide orientation during serial sectioning and staining in series.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of islet area, numbers, endocrine cell composition, replication, and T-cell infiltrates via H&E and IHC to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by evaluating islet amyloid, fibrosis, and inflammatory infiltrates relevant to type 1 diabetes pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through an online pathology database that provides rapid data sharing and block selection for paraffin or frozen serial sections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in islet endocrine composition and immune interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of serial sectioning, staining, and digital slide archiving.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early identification of islet pathology and replication status.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable islet morphology, density, and endocrine cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histotechnology, immunohistochemistry, and digital pathology workflows.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtome, auto stainer, slide scanner, and online pathology database access.
- Cross-team standardization requirements for slide labeling, section numbering, and orientation maintenance across histology and imaging teams.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for applying standardized regional processing (head, body, tail) to non-human pancreata.
- Practical limitations include tissue variability from organ donors and the need for optimized antibody validation for multiplex IHC staining.
