Protocolos de tinción de islotes pancreáticos humanos
23 de mayo de 2012
Este vídeo muestra los procedimientos para la caracterización de los islotes pancreáticos humanos con hematoxilina y eosina (H & E) e inmunohistoquímica (IHC). Secciones de páncreas de la cabeza, el cuerpo y las regiones de la cola se tiñen tanto por H & E y de IHC para determinar la composición endocrina islote (insulina, glucagón y polipéptido pancreático), la replicación celular (Ki 67), e infiltrado inflamatorio (H & E, CD3). La región se localiza uncinado con IHC para el polipéptido pancreático.
El objetivo general de este procedimiento es caracterizar los islotes pancreáticos humanos mediante tinción con hematoxilina y eosina e inmunohistoquímica. Esto se logra creando secciones seriadas a partir de una muestra de páncreas embebida en un bloque de parafina. Luego, las secciones se colocan sobre portaobjetos manteniendo su orientación original.
Una porción de las laminillas se tiñe con hematina y eosina, mientras que las laminillas restantes se tiñen mediante inmunohistoquímica; el paso final consiste en escanear las laminillas teñidas y organizarlas por caso. En última instancia, estas imágenes pueden cargarse en una base de datos en línea de patología, donde otros investigadores del campo pueden visualizarlas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que las laminillas se tiñen en serie manteniendo su orientación original.
La procedimiento será demostrado por Linda Snyder, histotecnóloga; Emily Montgomery, científica biológica; y Tiffany Hippo, técnica de laboratorio en mi laboratorio. Para comenzar, prepare el baño de agua y el microtomo siguiendo los procedimientos estándar para microtomía en parafina. A continuación, etiquete portaobjetos con carga positiva con el número de caso, la región del páncreas y el número de portaobjetos.
Una vez que todo esté preparado, coloque el bloque de parafina en el portamuestras del micrótomo con la etiqueta del casete en el lado izquierdo. Siguiendo los procedimientos normales de microtomía, corte el bloque hasta que el tejido quede uniformemente expuesto. Una vez que el tejido aparezca de manera uniforme, produzca una tira de cortes seriados de aproximadamente cuatro micrómetros de grosor.
Se necesitan de tres a seis secciones dependiendo del número de tinciones iniciales requeridas. A continuación, separe las secciones de la tira. Recoga cada sección en orden y colóquela sobre un portaobjetos.
Registre el número de sección con un lápiz. Si una sección no es utilizable, omita ese número y continúe numerando las secciones en orden exacto. Tenga cuidado de mantener la misma orientación en el portaobjetos que la que tenía en la cubeta, con la etiqueta del portaobjetos orientada hacia la izquierda.
A continuación, coloque los portaobjetos en una gradilla y déjelos secar durante la noche. A temperatura ambiente, selle nuevamente la superficie del bloque de parafina con una capa delgada de parafina para preservar el tejido y almacénelo a temperatura ambiente o a menos 20 grados Celsius. Repita este procedimiento para la siguiente muestra.
Es importante mantener la numeración de las secciones seriadas en cada nivel, como se muestra anteriormente para la tinción con H y E. Coloque el primer portaobjetos de cada bloque en un porta portaobjetos y luego coloque el soporte en la primera bandeja del colorante automático. Seleccione el programa estándar de HE e inicie el proceso de tinción.
Una vez finalizada la tinción, retire los portaobjetos del tinción automática y colóquelos en la campana extractora para colocarles la cubreobjetos. Coloque una cubreobjetos sobre cada portaobjeto utilizando técnicas estándar. Por último, etiquete los portaobjetos con una etiqueta impresa y déjelos secar completamente en la campana extractora.
Comience por configurar el tinción automática y preparar todos los reactivos necesarios. Seleccione el programa Daco para tinciones dobles. Ingrese el número de portaobjetos y el tratamiento que recibirá cada uno.
Cargue todos los reactivos en el tintador automático según las recomendaciones del fabricante. A continuación, prepare TBST y citrato, tampones, anticuerpos y otros reactivos necesarios para el procedimiento. Desparafine las láminas colocándolas en xileno durante cinco minutos.
No permita que los portaobjetos se sequen, ya que esto provocará un fondo excesivo y tinción de los poros mientras los portaobjetos están en depa. Vierta tampón citrato en un vaporizador para precalentarlo antes de su uso. A continuación, someta los portaobjetos depa a una serie de lavados con etanol.
Lave las laminillas una última vez con agua desionizada. Coloque las laminillas en el tampón de citrato precalentado y déjelas al vapor durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo, transfiera inmediatamente las laminillas a un baño de agua a temperatura ambiente hasta que se enfríen completamente.
Una vez enfriadas, transfiera las laminillas a las bandejas del autostain Dayco, teniendo cuidado de mantener la secuencia adecuada. Finalmente, ejecute el programa de tinción doble que se cargó previamente; cuando el programa de tinción doble haya finalizado, retire las laminillas del autostain y déjelas secar durante al menos una hora antes de deshidratarlas.
Para continuar la deshidratación, transfiéralos a etanol al 80 % durante un minuto. Continúe deshidratando las laminillas sumergiéndolas en etanol al 95 % y luego en etanol al 100 %. Por último, sumerja y mantenga las laminillas en xileno durante un minuto.
Monte inmediatamente las laminillas con cubreobjetos utilizando cyto seal para completar el procedimiento. Imprima etiquetas que contengan la información del caso, incluyendo el órgano y el número del bloque, el tipo de tinción y la fecha. Coloque una etiqueta en cada portaobjetos para escanear las laminillas teñidas.
Colóquelos en la bandeja de un escáner y siga los procedimientos estándar. Almacene las láminas teñidas a temperatura ambiente y las láminas sin teñir restantes a menos 20 grados Celsius para su uso futuro. Finalmente, organice las imágenes teñidas según el donante y el tipo de tejido observado.
Aquí se muestra un ejemplo de tinción de KI 67 más insulina a niveles tanto bajos como altos de aumento. Las imágenes de las secciones pancreáticas teñidas se envían a una base de datos patológica en línea, creando un biobanco virtual. Mediante esta base de datos, los investigadores pueden acceder rápidamente a la información necesaria para la investigación y la diabetes tipo uno.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y teñir láminas de alta calidad a partir del páncreas humano.
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Resumen
Este video demuestra los procedimientos para la caracterización de islotes pancreáticos humanos mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E) e inmunohistoquímica (IHC). La técnica permite evaluar la composición endocrina de los islotes, la replicación celular y los infiltrados inflamatorios.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Endocrinología
- Histología
Antecedentes
- Los islotes pancreáticos humanos desempeñan un papel crucial en el metabolismo de la glucosa.
- La caracterización de la composición de los islotes es esencial para comprender la diabetes.
- La tinción con H&E y la inmunohistoquímica (IHC) son técnicas estándar para el análisis de tejidos.
- Mantener la orientación original de los cortes es fundamental para una evaluación precisa.
Objetivo del estudio
- Caracterizar los islotes pancreáticos humanos.
- Determinar la composición endocrina de los islotes.
- Evaluar la replicación celular y las respuestas inflamatorias.
Métodos Utilizados
- Creación de cortes seriados a partir de muestras de páncreas embebidas en parafina.
- Tinción de cortes con H&E e inmunohistoquímica (IHC).
- Escaneo de láminas teñidas para su análisis.
- Organización de imágenes por caso para la carga en la base de datos.
Resultados principales
- Identificación de insulina, glucagón y polipéptido pancreático en los islotes.
- Evaluación de la replicación celular mediante tinción de Ki67.
- Evaluación de los infiltrados inflamatorios mediante tinción con H&E y CD3.
- Localización exitosa de la región uncinada mediante inmunohistoquímica (IHC).
Conclusiones
- El método proporciona una caracterización integral de los islotes pancreáticos.
- Mantener la orientación original del portaobjetos mejora la precisión del análisis.
- Los resultados contribuyen al entendimiento de la función pancreática en la salud y la enfermedad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los protocolos estandarizados de histopatología para islotes pancreáticos humanos permiten una caracterización reproducible de las células endocrinas, lo que apoya la validación de dianas en la investigación de la diabetes. Al conservar la orientación de cortes seriados y generar imágenes digitales completas de portaobjetos, el método facilita el intercambio de datos entre distintas funciones y el biobanco para la reducción de riesgos mecanicistas de terapias dirigidas a los islotes. Este enfoque mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al proporcionar datos cuantificables y resueltos espacialmente sobre la composición, replicación e infiltrados inmunitarios de los islotes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante histopatología rigurosa y la inmunolocalización de células endocrinas de los islotes.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico al caracterizar la morfología, tamaño, densidad y composición de las células endocrinas de los islotes mediante tinciones con H&E e IHC.
- Valor predictivo: Ayuda en la selección de carteras al evaluar la replicación de islotes y las células apoptóticas mediante Ki67 y otros marcadores de proliferación.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el procesamiento estandarizado del páncreas humano en regiones definidas (cabeza, cuerpo, cola) y secciones transversales.
- Valor Operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante la numeración y designación alfabética de subsecciones según su tamaño, para un análisis completo de las secciones transversales.
- Valor de Plataforma: Destaca la preparación para cribado y la escalabilidad mediante imágenes digitales completas de portaobjetos organizadas en una base de datos en línea de patología, accesible para más de 200 investigadores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad mediante la evaluación de islotes para detectar inflamación, fibrosis, amiloide e infiltrados de linfocitos T utilizando tinción con H&E y CD3.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la evaluación de compartimentos endocrinos y exocrinos, incluyendo patología ductular y neoplasia.
- Avance ajustado al riesgo: Se centra en la desintensificación predictiva mediante la caracterización de la neoplasia intraductal pancreática y su relación con el sistema ductal.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la evaluación preclínica, permitiendo el corte en serie, la tinción estandarizada y el biobanco digital de tejido pancreático humano.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante histopatología y inmunolocalización de islotes pancreáticos y células endocrinas.
- Selección: Asegura la disponibilidad y reproducibilidad del ensayo mediante el mantenimiento de la orientación original del portaobjetos durante el corte y tinción seriados.
- Análisis: Destaca las mediciones cuantitativas del área de los islotes, su número, la composición de células endocrinas, la replicación y los infiltrados de linfocitos T mediante H&E e inmunohistoquímica (IHC) para permitir comparaciones entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la evaluación de amiloide en los islotes, fibrosis e infiltrados inflamatorios relevantes para la patogénesis de la diabetes tipo 1.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable mediante una base de datos en línea de patología que facilita el intercambio rápido de datos y la selección de bloques para cortes seriados en parafina o congelados.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en la composición endocrina de los islotes y sus interacciones inmunitarias.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del corte en serie, tinción y archivo digital de portaobjetos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la identificación temprana de la patología de los islotes y su estado de replicación.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la morfología, densidad y fenotipos celulares endocrinos de los islotes cuantificables.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en histotecnología, inmunohistoquímica y flujos de trabajo en patología digital.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo microtomo, tinción automática, escáner de portaobjetos y acceso a bases de datos patológicas en línea.
- Requisitos de normalización entre equipos, particularmente en relación con la etiquetación de portaobjetos, numeración de cortes y mantenimiento de la orientación entre los equipos de histología y de imágenes.
- Consideraciones de adaptación entre distintos sistemas modelo, especialmente al aplicar un procesamiento regional estandarizado (cabeza, cuerpo, cola) a páncreas no humanos.
- Limitaciones prácticas incluyen la variabilidad del tejido procedente de donantes de órganos y la necesidad de una validación optimizada de anticuerpos para tinciones multiplex por inmunohistoquímica.
