Name: La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Aprende a convertir un ensayo ELISA de TNF Alpha a la plataforma Luminex xMAP evaluando pares de anticuerpos alternativos. Este método multiplex aumenta la sensibilidad y el rango dinámico mientras reduce costos en detección de citocinas.

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Este trabajo fue financiado por Luminex Corporation.

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<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

Este trabajo fue realizado a Luminex Corporation con equipos fabricados en el Luminex Corporation. R &amp; D Systems y EMD Millipore son socios estratégicos de Luminex Corporation, con licencia para desarrollar y comercializar los ensayos multiplex xMAP base.

La conversión de un ensayo ELISA para la plataforma Luminex xMAP puede ser tan simple como la sustitución de estreptavidina peroxidasa de rábano (SA-HRP) en un típico kit de ELISA con estreptavidina ficoeritrina (SA-PE), y la optimización del rendimiento. Para aquellos que desean crear un inmunoensayo xMAP desde cero, esto se puede lograr con un protocolo sencillo que también permite la evaluación rápida, múltiplex de los pares de anticuerpos. Los reactivos para el ensayo xMAP se prepararon fácilmente con el kit de anticuerpos xMAP de acoplamiento para acoplar los anticuerpos de captura designados para MagPlex baja concentración de microesferas. El uso de microesferas de baja concentración se reduce el coste de desarrollo de ensayos mientras que proporciona el rendimiento del ensayo mismo de mayor concentración de microesferas. La cantidad de tiempo requerido para preparar acoplado MagPlex microesferas es aproximadamente 3 horas, que es mucho más rápido que el 22 - 24 horas requerido para recubrir el pocillo de una placa de ELISA, seguido por el tratamientode los pocillos recubiertos. El rendimiento del ensayo xMAP es también superior a la de ELISA en términos de límite de detección (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / ml) y rango dinámico (&lt;4 pg / ml a&gt; 8000 pg / ml frente a 16 pg / ml a 1000 pg / ml). Lectores de la placa tienen una limitada gama de DO que es 3 o 4 OD, restringiendo el límite superior del rango dinámico para un ensayo. Sin duda, no todos los anticuerpos funcionan en un formato ELISA y no todos los anticuerpos que funcionan bien en un método de ELISA son fácilmente transferibles a el formato de ensayo xMAP. Sin embargo, puesto que los ensayos de xMAP pueden ser multiplexados (es decir, ejecutar simultáneamente), es posible evaluar la captura de varias combinaciones de detección de anticuerpos y simultáneamente para identificar el mejor par de usar para un ensayo. Este proceso ahorra tiempo y reactivos en comparación con el procedimiento de desarrollo de ELISA, que está limitada a la evaluación de un par a la vez. Si dos o más pares de anticuerpos realizar equivalentemente; otros parámetros del ensayo puedeconsiderarse para determinar la idoneidad del par (por ejemplo, disponibilidad, coste, etc.) Además de un rendimiento mejorado y ensayo de flexibilidad con el ensayo xMAP, también hay un ahorro significativo. La cantidad recomendada de anticuerpo necesaria para recubrir un solo pozo de una placa de ELISA es 400ng, mientras que la cantidad necesaria para las perlas utilizadas en un pocillo de un ensayo xMAP es de aproximadamente 7,5 ng. Así, la cantidad de anticuerpo necesaria para un ELISA bien proporcionará más de 50 resultados de la prueba, si se utiliza en un ensayo xMAP. Para aplicaciones que implican muestras preciosas, xMAP también tiene una ventaja significativa. El volumen de muestra recomendado para el ELISA es 100 l, mientras que el volumen requerido para el ensayo xMAP puede ser un medio de que, o menos. En resumen, la conversión de un ensayo de ELISA para la plataforma Luminex xMAP es sencillo, eficiente y ahorro de costes, mientras que la producción de un ensayo con un rango dinámico superior y la sensibilidad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Descripción </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Humanos TNF-α/TNFSF1A DuoSet kit ELISA </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Incluye monoclonales y biotina acoplados anticuerpos policlonales y proteína recombinante estándar de TNF-α </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Captura de anticuerpos, el clon CH8820 </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotina acoplado Detección de anticuerpos, el clon AS1 </td></tr><tr><td> La proteína TNF alfa </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> TNF-α recombinante de proteínas estándar </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> Captura de anticuerpos, el clon 4H31 </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Biotina acoplado Detección de anticuerpos, el clon MAb11 </td></tr><tr><td> La proteína TNF alfa </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> TNF-α recombinante de proteínas estándar </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Captura de anticuerpos, clonar 3C7.2 </td></tr><tr><td> Anticuerpos policlonales a TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Detección de anticuerpo de conejo policlonal </td></tr><tr><td> Estreptavidina-ficoeritrina </td><td> Musgo </td><td> SAPE-001 </td><td> Reactivo fluorescente reportero de Luminex xMAP Ensayo </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software XPONENT </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Aparato Luminex </td></tr><tr><td> xMAP anticuerpos de acoplamiento (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Incluye reactivo de la EDC, el reactivo sulfo-NHS, el tampón de activación, el tampón de lavado, tubos de 1,5 mL de reacción y pipetas desechables </td></tr><tr><td> MagPlex microesferas, la baja concentración </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, ID-MC10013, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Cuentas de baja concentración (2,5 x @ 10 6 bolas / ml) </td></tr><tr><td> EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Biotinilación kit para la detección de anticuerpos sin modificar </td></tr><tr><td> Tecan Infinite F200 Reader </td><td> Tecan </td><td></td><td> Lector de placas ELISA </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% de PBS-BSA, Tampón de ensayo </td></tr><tr><td> Una pinta-limpiador ultrasónico compacto, 115 VCA </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08.849-00 </td><td> Produce una frecuencia de operación efectiva de 55 kHz </td></tr><tr><td> Separador de tubo magnético </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288 a 01 </td><td> Para la separación solo tubo 1,5 ml magnético en los pasos de lavado de acoplamiento </td></tr><tr><td> Separador placa magnética </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Para 96-así separación placa magnética en los pasos de lavado de ensayo </td></tr></tbody></table>

la conversión de un elisa de captura para un ensayo de luminex xmap utilizando un anticuerpo multiplex método de detección

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

La prueba de inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) ha sido durante mucho tiempo la principal herramienta para la detección de analitos de interés en las muestras biológicas tanto para la investigación en ciencias biológicas y diagnóstico clínico. Sin embargo, ELISA tiene sus limitaciones. Se realiza típicamente en una microplaca de 96 pocillos, y los pocillos se revisten con anticuerpo de captura, que requiere una cantidad relativamente grande de la muestra para capturar un antígeno de interés. La gran superficie de los pocillos y la unión hidrofóbica de anticuerpo de captura puede también conducir a no específica la unión de fondo y mayor. Además, la mayoría de ELISA depender enzima mediada por la amplificación de la señal con el fin de lograr una sensibilidad razonable. Tal amplificación no siempre es lineal y puede por lo tanto los resultados de inclinación. En los últimos 15 años, una nueva tecnología ha surgido, que ofrece los beneficios de la prueba ELISA, sino que también permite un mayor rendimiento, mayor flexibilidad, reducción del volumen de la muestra, y un menor coste, con un ¡ay similaresrkflow 1, 2. Luminex xMAP Technology es una microesfera (bola) plataforma matriz que permite tanto monoplex y ensayos multiplex que se pueden aplicar tanto a la proteína y las aplicaciones de ácido nucleico 3-5. Las perlas tienen el anticuerpo de captura covalentemente inmovilizado sobre una superficie más pequeña, requiriendo menos anticuerpo de captura y pequeños volúmenes de muestra, en comparación con el ELISA, y la unión no específica se reduce significativamente. Pequeños volúmenes de muestra son importantes cuando se trabaja con muestras limitantes como el líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc 6. Multiplexación el ensayo reduce aún más los requisitos de volumen de la muestra, lo que permite múltiples resultados de una sola muestra. Las recientes mejoras de Luminex incluyen: el nuevo sistema de MAGPIX, uno más pequeño, menos costoso, más fácil de usar analizador; baja concentración magnética MagPlex microesferas que eliminan la necesidad de costosas placas de filtro y vienen en una concentración de trabajo más adecuado para el desarrollo y ensayobajo rendimiento de aplicaciones, y el anticuerpo xMAP kit de acoplamiento (ABC), que incluye un protocolo, reactivos y consumibles necesarios para el acoplamiento de cuentas para el anticuerpo de captura de interés. (Vea la sección de Materiales para obtener una lista detallada del contenido del kit.) En este experimento, convertir un ensayo de pre-optimizado ELISA para TNF-alfa citoquina a la plataforma xMAP y comparar el rendimiento de los dos métodos 7-11. TNF-alfa es un marcador biológico utilizado en la medición de las respuestas inflamatorias en pacientes con trastornos autoinmunes. Comenzamos por el acoplamiento de cuatro anticuerpos de captura candidatos a cuatro conjuntos de microesferas y regiones diferentes. Cuando se mezclan, estos cuatro conjuntos de permitir el análisis simultáneo de todos los cuatro candidatos con cuatro anticuerpos de detección separadas para determinar el mejor par de anticuerpos, reactivos de ahorro, la muestra y el tiempo. Dos ensayos xMAP luego se construye con los dos pares de anticuerpos más óptimos y es su rendimientoen comparación con la del original ensayo ELISA en cuanto a intensidad de la señal, el rango dinámico, y la sensibilidad.

Un ELISA se puede convertir fácilmente a un ensayo de Luminex xMAP y, a través de los beneficios de anticuerpos de multiplexación, varios pueden ser examinados simultáneamente para identificar un par de anticuerpos óptima, dando lugar a una mayor sensibilidad y rango dinámico, mientras que reduce el coste del ensayo.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) ha sido durante mucho tiempo la herramienta principal para la detección de analitos de interés en muestras biológicas, tanto para las ciencias de la vida...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en convertir un ensayo Eliza previamente optimizado para la citocina TNF alfa a la plataforma Xap, al mismo tiempo que se evalúan pares alternativos de anticuerpos. Esto se logra acoplando el anticuerpo de captura del kit ELIZA, junto con otros tres anticuerpos de captura candidatos, a cuatro conjuntos diferentes de microesferas o partículas, que se mezclan entre sí. Estos cuatro conjuntos permiten probar simultáneamente los cuatro candidatos con cuatro anticuerpos de detección distintos, con el fin de determinar el mejor par de anticuerpos.A continuación, se construyen dos ensayos Xap con los dos pares de anticuerpos más óptimos. Luego, se compara el rendimiento de los ensayos con el del ensayo EISA original en cuanto a intensidad de señal, rango dinámico y sensibilidad. Los resultados muestran que anticuerpos similares pueden tener un comportamiento muy diferente bajo las mismas condiciones y que varios anticuerpos pueden cribarse simultáneamente utilizando el ensayo Xap de Luminex, lo que revela que este ensayo presenta una sensibilidad y un rango dinámico aumentados en comparación con el EISA.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el EIS A es que los inmunoensayos basados en xap permiten al investigador probar múltiples dianas, o como en este caso, probar múltiples anticuerpos simultáneamente. Para identificar el mejor anticuerpo demostrado. El procedimiento lo realizará Erica Lopez, científica asociada en Luminex Corporation.Comience este protocolo con la selección y preparación de cuatro anticuerpos de captura y cuatro anticuerpos de detección específicos para el TNF alfa humano, tal como se describe en el protocolo escrito. Además, prepare un anticuerpo de confirmación específico para la especie huésped de los anticuerpos de captura. Lleve los reactivos del kit de acoplamiento de anticuerpos a temperatura ambiente.Etiquete cuatro tubos de reacción con los números de región de las perlas seleccionados para la reacción de acoplamiento. Transfiera el contenido de los cuatro viales de microesferas mag plex a los cuatro tubos de reacción etiquetados. Lave cada conjunto de perlas dos veces con 500 microlitros de tampón de activación y active cada conjunto de perlas con las soluciones de sulf ONHS y EDC según se describe en el kit de acoplamiento de anticuerpos.Manual del usuario: tras una incubación de 20 minutos en un rotador, repita el paso anterior de lavado con las perlas ahora activadas un total de tres veces con 500 microlitros de tampón de activación. Para cada lavado, prepare cuatro soluciones separadas de 500 microlitros, cada una conteniendo 7,5 microgramos de anticuerpo de captura en tampón de inactivación.Agregue estas cuatro soluciones de anticuerpos de captura a sus respectivos tubos de reacción. Vortexee inmediatamente cada tubo e incube durante dos horas en un rotador. Repita el paso de lavado con las perlas ya acopladas un total de tres veces con 500 microlitros del tampón de lavado incluido en el kit de acoplamiento de anticuerpos.Después del último paso de lavado, añada 500 microlitros de tampón de lavado a cada tubo de reacción para obtener una concentración final de stock de 5 millones de microesferas acopladas a anticuerpos por mililitro, vortexee y luego someta los tubos de reacción a sonicación para dispersar las microesferas. Cuente el número de microesferas recuperadas tras la reacción de acoplamiento utilizando un contador de células o un hemocitómetro. La recuperación tras la reacción de acoplamiento suele ser superior al 90 %. Confirme que la reacción de acoplamiento fue exitosa preparando soluciones de prueba de los stocks de microesferas acopladas para cada conjunto, con una concentración final de 100 microesferas por microlitro en tampón de ensayo, y prepare una dilución de la especie antis marcada con eritrina FICO.Anticuerpo de confirmación de IgG a cuatro microgramos por mililitro en tampón de ensayo. Aliquotar 50 microlitros de cada solución de prueba en cuatro pozos de una placa de 96 pozos con fondo redondo, para un total de 16 pozos. Luego, añadir 50 microlitros de tampón de ensayo en ocho de los pozos para medir el fondo, y 50 microlitros del anticuerpo de confirmación diluido en los ocho pozos restantes. Mezclar suavemente las reacciones pipeteando arriba y abajo varias veces con un pipetador multicanal.Cubra la placa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador para placas. Coloque la placa sobre un separador magnético durante uno o dos minutos para atraer las perlas fuera de la solución. Luego, elimine el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está sobre el separador, por encima de un recipiente de desecho.Lave cada pocillo dos veces añadiendo 100 microlitros de tampón de ensayo y eliminando el SANE de la placa de manera similar. Utilizando el separador magnético de placas, re suspenda las perlas en 100 microlitros de tampón de ensayo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces con un pipetizador multicanal. Analice en un instrumento Luminex xap, como el instrumento magix.La intensidad de la señal fluorescente de esta reacción es directamente proporcional a la cantidad de proteína en la superficie de las perlas, lo que proporciona una evaluación rápida de la cantidad relativa de proteína acoplada a las perlas. Para determinar el par de anticuerpos más eficaz en el ensayo xap, prepare una mezcla inicial de los cuatro conjuntos de perlas añadiendo 10 microlitros de cada uno a 0,96 mililitros de tampón de ensayo. Prepare las soluciones de anticuerpo de detección diluyendo cada anticuerpo a un microgramo por mililitro en tampón de ensayo.También un tampón de ensayo. Prepare el estándar de proteína TNF alfa a 2000 picogramos por mililitro y diluya la estreptavidina R FICO erina a ocho microgramos por mililitro. Añada 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos acoplados a perlas a cada uno de los 16 pozos de una placa de 96 pozos con fondo redondo CoStar para el ensayo de cribado.Luego, agregue 50 microlitros de tampón de ensayo a ocho de los 16 pocillos para medir el fondo. A continuación, pipetee 50 microlitros del estándar de TNF alfa en los otros ocho pocillos para medir la respuesta. Incube durante una hora a temperatura ambiente, protegido de la luz, agitando en un agitador para placas de ensayo.Luego, agregue 50 microlitros de cada uno de los cuatro anticuerpos de detección a cuatro pocillos, dos de los cuales son pocillos de fondo y dos de los cuales son pocillos de respuesta. Incube durante 30 minutos en las mismas condiciones tras la adición de 50 microlitros del reactivo SAPE a todos los pocillos. Incube nuevamente durante 15 minutos en las mismas condiciones.Coloque la placa sobre un separador magnético durante un minuto. Luego, retire el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está sobre el separador, por encima de un recipiente de desecho. Pipetee 100 microlitros de tampón de ensayo en cada uno de los 16 pocillos.Luego, retire el líquido de las perlas utilizando separación magnética. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de ensayo a cada uno de los 16 pozos. Lea la placa con el instrumento Luminex mag picks, consultando el manual del usuario para su correcto funcionamiento.Seleccione un par de anticuerpos que cumpla con la intensidad de señal deseada. Después de seleccionar el mejor anticuerpo de captura, diluya 100 microlitros del anticuerpo acoplado al stock de perlas en 10 mililitros con tampón de ensayo. Añada 50 microlitros de las perlas diluidas a 78 pocillos de dos placas de 96 pocillos de fondo redondo CoStar.Cada placa se utilizará para evaluar el rendimiento de un anticuerpo de detección diferente. A continuación, prepare una curva patrón de 12 puntos que comience en 8.000 picogramos por mililitro y finalice en cuatro picogramos por mililitro. Con los sistemas r y d.Añada seis réplicas de 50 microlitros de cada dilución del estándar de TNF alfa a cada una de las placas, más seis pocillos con 50 microlitros de tampón de ensayo cada uno como fondo, para un total de 78 pocillos por placa. Incube las placas durante una hora a temperatura ambiente, protegidas de la luz y agitando en un agitador para placas de ensayo. A continuación, añada 50 microlitros del primer anticuerpo de detección a los 78 pocillos de la primera placa.Repita el procedimiento para el segundo anticuerpo de detección en la segunda placa. Incube las placas durante 30 minutos en las mismas condiciones. Luego, agregue 50 microlitros del reactivo SAPE a todos los pocillos de cada placa.Después de agitar las dos placas durante 15 minutos protegidas de la luz, coloque las placas sobre separadores magnéticos durante un minuto. Elimine el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está sobre el separador, encima de un recipiente de desecho. A continuación, pipetee 100 microlitros de tampón de ensayo en cada uno de los 78 pozos de las placas antes de eliminar el líquido de las perlas magnéticas como se hizo anteriormente.Tras agregar cien microlitros de tampón de ensayo a las perlas en cada uno de los 78 pozos de las placas, analice las placas en el instrumento mag picks consultando el manual del usuario para su correcto funcionamiento. Siguiendo las instrucciones incluidas con el kit ELISA DUOset de TNF alfa humano TNFSF1A de R&D Systems, mida la respuesta generada por el estándar proporcionado con el kit de R&D.Repita el ensayo ELI a tres veces más, sustituyendo los anticuerpos de captura y detección de los sistemas r y d por los anticuerpos de los otros proveedores. Por simplicidad, empareje los anticuerpos según su proveedor y evalúe cada par independientemente según exija el formato EISA con cada uno de los tres estándares de proteína TNF alfa. Los ensayos Luminex Xap se realizaron como un multiplex para evaluar los cuatro anticuerpos de captura como una mezcla, combinando cuatro conjuntos de anticuerpos anti-TNF alfa acoplados a microesferas Mag PLX; los anticuerpos de captura se evaluaron con cada uno de los cuatro anticuerpos de detección biotinilados individualmente, de modo que se pudiera determinar simultáneamente la interacción de un anticuerpo de detección con cada uno de los cuatro anticuerpos de captura.Los resultados indicaron que el par de anticuerpos del conjunto DUO de los sistemas r y d tuvo el mejor desempeño, con una respuesta resultante de 6.183 unidades de intensidad de fluorescencia mediana o MFI. También se observó que los anticuerpos de detección de Millipore y ABAM proporcionaron una respuesta razonable en el ensayo XAP cuando se combinaron con el anticuerpo de captura del sistema RD; los anticuerpos de captura de Millipore, ACAM y Novus produjeron una respuesta menos deseable en el ensayo XAP. Se utilizó el protocolo del conjunto DUO de los sistemas r y d para comparar los cuatro pares de anticuerpos en un formato EISA.Se utilizó el protocolo de los sistemas r y d con todos los pares de anticuerpos porque refleja los protocolos típicos de EIA ampliamente utilizados en la actualidad, y es análogo a los protocolos empleados con la tecnología xap. Las pruebas de EISA mostraron que el par de anticuerpos de los sistemas r y d volvió a dar los mejores resultados. El par de anticuerpos de Acam no produjo ninguna respuesta, y los pares de anticuerpos de Millipore y Novas produjeron respuestas modestas con el fin de evaluar cualquier variación en la reactividad de los anticuerpos.Con el estándar, se probaron los cuatro pares de anticuerpos con tres proteínas estándar recombinantes de TNF alfa procedentes de tres proveedores diferentes. Los datos muestran que las proteínas estándar recombinantes de TNF alfa de los tres proveedores produjeron resultados equivalentes. La proteína de TNF alfa de los sistemas r y d se utilizó para generar curvas estándar con los ensayos ELSA y XAP.Aunque el ensayo ELI A se realizó con el par de anticuerpos de r and d system, los ensayos xap utilizaron el anticuerpo de captura de r and d system y bien el anticuerpo de detección de r and d systems o de Millipore. La proteína TNF alfa de r and d systems se diluyó para producir una serie de concentraciones que iban desde 8.000 hasta cuatro picogramos por mililitro únicamente. El par de anticuerpos de r and d systems produjo el resultado esperado en el ensayo Xap, con una respuesta superior a 20.000 MFI, tal como se muestra.Cuando el anticuerpo de detección de Millipore se utilizó con el ensayo Xap en lugar del anticuerpo de detección de los sistemas r y d, la respuesta fue aproximadamente del 30 % de la respuesta obtenida con el anticuerpo de detección de los sistemas RD. La línea verde en este gráfico representa la curva patrón del ELA, que tenía un rango recomendado por el fabricante para el TNF alfa de 16 a 1000 picogramos por mililitro. Debido al límite del espectrofotómetro, no fue posible aumentar el rango del ensayo Eliza.Además, el rango dinámico y la sensibilidad de ambos métodos se ilustran mejor cuando se representan en una escala logarítmica. Puede observarse una clara distinción entre la pendiente de la respuesta del EISA y las respuestas de los ensayos xap, lo que indica aún más una capacidad más limitada para la detección del TNF alfa con el EL iza tanto en concentraciones más altas como más bajas. Los límites de detección o LOD para los dos ensayos funcionales xap del TNF alfa se aproximaron identificando la concentración más baja de TNF alfa con un nivel de respuesta observado mayor que el fondo, más tres veces su desviación estándar o SD a partir de seis réplicas.Aquí se puede observar que al utilizar el par de sistemas r y d, la concentración más baja de TNF alfa de 3,91 picogramos por mililitro produjo una respuesta de 66 MFI, lo cual es mayor que la respuesta correspondiente al fondo más tres desviaciones estándar cumpliendo este criterio. Cuando se utilizó el anticuerpo de detección Millipore junto con el anticuerpo de captura de los sistemas r y d, el límite de detección fue inferior a 7,81 picogramos por mililitro.En este caso, la segunda concentración más baja de TNF alfa produjo una respuesta aceptable de 17 MFI, superior a la respuesta de la concentración más baja de TNF alfa más tres veces su desviación estándar. De manera similar, se estimó que el límite de detección para el conjunto dúo de sistemas r y d en el ensayo Eliza estaba entre 63 y 31 picogramos por mililitro. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros pasos como pruebas, diversas matrices de muestras o concentraciones de anticuerpo en el sistema de detección, con el fin de optimizar aún más el ensayo xap.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

Gracias a la tecnología Luminex Corporation microesfera xMAP, hemos desarrollado el inmunoanálisis fluorométrico multiplexada (MFIA) para la vigilancia serológica de las diversas especies de animales de laboratorio. El MFIA es un microarray de suspensión donde se covalentemente con el antígeno, tejido de control o inmunoglobulinas vinculado a microesferas de poliestireno con código de color. El método de prueba MFIA, así como diversos temas de solución de problemas se aborda.

Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

El video muestra la implementación de la tecnología de chip instantáneo para inmunoensayos sándwich multiplexados sin reactividad cruzada. La simple acción de encajar dos portaobjetos de microarrays, cada uno de los cuales contiene diferentes reactivos, garantiza la transferencia de reactivos sin contaminación cruzada y ayuda a detectar múltiples proteínas mediante inmunoensayo sándwich.

Una tecnología de chip a presión para un inmunoensayo sándwich multiplexado sin reactividad cruzada

Este video demuestra la detección cuantitativa de bacterias multiplexadas empleando microesferas de poliestireno magnético carboxilado teñidas en conjuntos distintos. El procedimiento abarca la formación de complejos de perlas y bacterias, la separación magnética y el análisis basado en flujo, lo que permite la cuantificación precisa y simultánea de múltiples bacterias en el mismo pozo de reacción.

Detección cuantitativa multiplexada de bacterias mediante microesferas magnéticas marcadas con colorantes

Biomarcadores de medición en muestras biológicas complejas es cada vez guían la toma de decisiones clínicas. Se describe un método altamente sensible para medir simultáneamente la miosina cardíaca proteína de unión-C, creatina quinasa MB, troponina I cardiaca y en muestras de suero de pacientes con infarto de miocardio y los sujetos de control sanos.

Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

En el clima actual de escasez de recursos, están surgiendo nuevas tecnologías que permiten a los investigadores realizar estudios más baratos, más rápidos y con más precisión. En este trabajo describimos el desarrollo de un inmunoensayo múltiple de anticuerpos salivales basado en perlas para medir la exposición humana a múltiples patógenos ambientales simultáneamente.

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Modelamos un ensayo ECL multiplexado simple que combina 7 ensayos de autoanticuerpos. El ensayo es capaz de detectar DT1 y muchas otras enfermedades autoinmunes, simultáneamente, incluida la enfermedad celíaca, la enfermedad tiroidea autoinmune y el síndrome poliglandular autoinmune 1.

Un ensayo de electroquimioluminiscencia 7-plex de alto rendimiento que detecta simultáneamente la diabetes tipo 1 y múltiples enfermedades autoinmunes

Se utilizó un sistema de análisis de flujo para ensayos multiplexados basados en perlas que proporciona una lectura de dos reporteros para el desarrollo de ensayos serológicos multiplex y de neutralización de anticuerpos que pueden medir simultáneamente anticuerpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

En línea con la necesidad urgente de detección de diabetes tipo 1, enfermedad celíaca y enfermedad por coronavirus 2019, desarrollamos un ensayo de electroquimioluminiscencia 6-Plex de alto rendimiento para detectar simultáneamente los cuatro autoanticuerpos de los islotes, los autoanticuerpos de transglutaminasa tisular y los anticuerpos contra el dominio de unión al receptor del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo.

Una detección multiplexada de alto rendimiento para diabetes tipo 1, enfermedades celíacas y COVID-19

Se utilizó un sistema de análisis de flujo de fluorescencia de doble reportero de tres canales para desarrollar un inmunoensayo múltiple basado en perlas que evalúa simultáneamente muestras de suero para IgG e IgM provocadas contra múltiples antígenos de diferentes especies de Borrelia que causan borreliosis de Lyme en Europa y América del Norte.

Detección simultánea de diferentes clases de anticuerpos en una prueba serológica multiplexada

Aprende a convertir un ensayo ELISA de TNF Alpha a la plataforma Luminex xMAP evaluando pares de anticuerpos alternativos. Este método multiplex aumenta la sensibilidad y el rango dinámico mientras reduce costos en detección de citocinas.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

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