La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

El objetivo general del siguiente experimento es convertir un ensayo Eliza preoptimizado para la citocina alfa del TNF a la plataforma Xap mientras se evalúan pares de anticuerpos alternativos. Esto se logra acoplando el anticuerpo de captura del kit ELIZA, junto con otros tres anticuerpos de captura candidatos a cuatro microesferas o conjuntos de perlas diferentes cuando se mezclan. Estos cuatro conjuntos permiten la prueba simultánea de los cuatro candidatos con cuatro anticuerpos de detección separados para determinar el mejor par de anticuerpos.

Los siguientes dos ensayos Xap se construyen con los dos pares de anticuerpos más óptimos. A continuación, se compara el rendimiento de los ensayos con el del ensayo EISA original en lo que respecta a la intensidad de la señal, el rango dinámico y la sensibilidad. Los resultados muestran que anticuerpos similares pueden funcionar de manera muy diferente en las mismas condiciones y que varios anticuerpos se pueden analizar simultáneamente utilizando el ensayo Luminex Xap, lo que revela que el ensayo tiene una mayor sensibilidad y rango dinámico en comparación con EISA.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como EIS A es que los inmunoensayos basados en xap permiten al investigador probar múltiples objetivos o, como en este caso, probar múltiples anticuerpos simultáneamente. Identificar el mejor anticuerpo demostrado. El procedimiento estará a cargo de Erica López, científica asociada de Luminex Corporation.

Comience este protocolo con la selección y preparación de cuatro anticuerpos de captura y cuatro anticuerpos de detección específicos para el TNF alfa humano, tal como se describe en el protocolo escrito. Además, prepare un anticuerpo de confirmación específico para la especie huésped de los anticuerpos de captura. Lleve los reactivos del kit de acoplamiento de anticuerpos a temperatura ambiente.

Etiquete cuatro tubos de reacción con los números de región del cordón seleccionados para la reacción de acoplamiento. Transfiera el contenido de los cuatro viales de microesferas mag plex a los cuatro tubos de reacción marcados. Lave cada uno de los juegos de perlas dos veces en 500 microlitros de tampón de activación y active cada juego de perlas con las soluciones de sulfo, ONHS y EDC como se describe en el kit de acoplamiento de anticuerpos.

Manual de usuario Después de una incubación de 20 minutos en un rotador, repita el paso de lavado anterior con las perlas ahora activadas un total de tres veces con 500 microlitros de tampón de activación. Para cada lavado, prepare cuatro soluciones separadas de 500 microlitros. Cada uno contiene 7,5 microgramos de tampón de inactivación de anticuerpos de captura.

Agregue estas cuatro soluciones de anticuerpos de captura a sus respectivos tubos de reacción. Agite cada tubo inmediatamente e incube durante dos horas en un rotador. Repita el paso de lavado con las perlas ahora emparejadas un total de tres veces con 500 microlitros del tampón de lavado incluido con el kit de acoplamiento de anticuerpos.

Después del paso de lavado final, agregue 500 microlitros de tampón de lavado a cada tubo de reacción para proporcionar una concentración final de 5 millones de perlas acopladas a anticuerpos por vórtice de mililitro y, a continuación, sonique los tubos de reacción para dispersar las perlas. Cuente el número de perlas recuperadas después de la reacción de acoplamiento utilizando un contador de células o un hemocitómetro. La recuperación de la reacción de acoplamiento suele ser superior al 90%Confirme que la reacción de acoplamiento fue exitosa mediante la preparación de soluciones de prueba de las existencias de perlas acopladas para cada conjunto con una concentración final de 100 perlas por microlitro en tampón de ensayo, prepare la dilución de las especies antis marcadas con FICO erything.

Anticuerpo de confirmación de IgG a cuatro microgramos por mililitro en tampón de ensayo, alícuota de 50 microlitros de cada solución de prueba en cuatro pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo para un total de 16 pocillos. A continuación, añada 50 microlitros de tampón de ensayo en ocho de los pocillos para medir el fondo y 50 microlitros de anticuerpo de confirmación diluido en los ocho pocillos restantes. Mezcle las reacciones suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta multicanal.

Cubra el plato e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de platos. Coloque la placa en un separador de placas magnéticas durante uno o dos minutos para extraer las perlas de la solución. A continuación, retire el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está en el separador sobre un receptáculo de residuos.

Lave cada pocillo dos veces agregando 100 microlitros de tampón de ensayo y retirando el SANE de la placa de manera similar. Con el separador de placas magnéticas, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de ensayo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo cinco veces con un pipeteador multicanal. Analice en el instrumento luminex xap, como el instrumento magix.

La intensidad de la señal fluorescente de esta reacción es directamente proporcional a la cantidad de proteína en la superficie de las perlas, lo que proporciona una evaluación rápida de la cantidad relativa de proteína acoplada a las perlas. Para determinar el par de anticuerpos más eficaz en el ensayo xap, prepare una mezcla inicial de los cuatro conjuntos de perlas añadiendo 10 microlitros de cada uno a 0,96 mililitros de tampón de ensayo. Prepare las soluciones de anticuerpos de detección diluyendo cada anticuerpo a un microgramo por mililitro en tampón de ensayo.

También un tampón de ensayo. Prepare el estándar de proteína alfa TNF de los sistemas r y d a 2000 picogramos por mililitro y diluya la estreptavidina R FICO eryn a ocho microgramos por mililitro. Agregue 50 microlitros de la mezcla de perlas acopladas a anticuerpos a cada uno de los 16 pocillos de una placa CoStar de 96 pocillos de fondo redondo para el ensayo de detección.

A continuación, añada 50 microlitros de tampón de ensayo a ocho de los 16 pocillos para medir el fondo. A continuación, pipetee 50 microlitros del patrón alfa TNF a los otros ocho pocillos para medir la respuesta. Incubar durante una hora a temperatura ambiente, protegido de la luz mientras se agita en un agitador de placas de ensayo.

A continuación, añada 50 microlitros de cada uno de los cuatro anticuerpos de detección a cuatro pocillos, dos de los cuales son pocillos de fondo y dos de los cuales son pocillos de respuesta. Incubar durante 30 minutos en las mismas condiciones después de la adición de 50 microlitros del reactivo SAPE a todos los pocillos. Incubar de nuevo durante 15 minutos en las mismas condiciones.

Coloque la placa en un separador de placas magnéticas durante un minuto. A continuación, retire el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está en el separador sobre un receptáculo de residuos. Pipetear 100 microlitros de tampón de ensayo en cada uno de los 16 pocillos.

A continuación, retire el líquido de las perlas mediante separación magnética. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de ensayo a cada uno de los 16 pocillos. Lea la placa con el instrumento de selecciones magnéticas Luminex consultando el manual del usuario para un funcionamiento adecuado.

Seleccione un par de anticuerpos que cumpla con la intensidad de señal deseada. Después de seleccionar el mejor anticuerpo, diluya 100 microlitros de ese anticuerpo acoplado a 10 mililitros con tampón de ensayo. Agregue 50 microlitros de las perlas diluidas a 78 pocillos de dos placas CoStar de 96 pocillos de fondo redondo

Cada placa se utilizará para evaluar el rendimiento de un anticuerpo de detección diferente. A continuación, prepare una curva estándar de 12 puntos que comience en 8.000 picogramos por mililitro y termine en cuatro picogramos por mililitro. Con los sistemas de investigación y desarrollo.

El estándar TNF Alpha añade seis réplicas de 50 microlitros de cada dilución a cada una de las placas, además de seis pocillos con 50 microlitros de tampón de ensayo cada uno como fondo para un total de 78 pocillos por placa. Incubar las placas durante una hora a temperatura ambiente, protegidas de la luz mientras se agitan en un agitador de placas de ensayo. A continuación, añada 50 microlitros del primer anticuerpo de detección a los 78 pocillos de la primera placa.

Repita para el segundo anticuerpo de detección en la segunda placa. Incubar las placas durante 30 minutos en las mismas condiciones. A continuación, añada los 50 microlitros del reactivo SAPE a todos los pocillos de cada placa.

Después de agitar las dos placas durante 15 minutos protegidas de la luz, coloque las placas en separadores de placas magnéticos durante un minuto. Retire el líquido invirtiendo con fuerza la placa mientras está en el separador sobre un recipiente de desechos. A continuación, pipetee 100 microlitros de tampón de ensayo en cada uno de los 78 pocillos de las placas antes de eliminar el líquido de las perlas magnéticas.

Después de agregar cien microlitros de tampón de ensayo a las perlas en cada uno de los 78 pocillos de las placas, analice las placas en el instrumento de selecciones magnéticas consultando el manual del usuario para un funcionamiento adecuado. Siguiendo las instrucciones incluidas con los sistemas r y d, el kit humano TNF Alpha T NF SF one a DUO set ELI A. Mida la respuesta generada por el estándar provisto con el kit r y d.

Repita el ensayo ELI a tres veces más, sustituyendo los anticuerpos de captura y detección de los sistemas r y d por los anticuerpos de los otros proveedores. Para simplificar, empareje los anticuerpos por proveedor, evalúe cada par de forma independiente según lo requiera el formato EISA con cada uno de los tres estándares de proteína TNF Alfa. Los ensayos Luminex Xap se realizaron como un multiplex para evaluar los cuatro anticuerpos de captura como una mezcla mediante la combinación de cuatro conjuntos de anticuerpos TNF alfa acoplados a microesferas Mag PLX, los anticuerpos de captura se evaluaron con cada uno de los cuatro anticuerpos de detección biotinilados individualmente, de modo que la interacción de un anticuerpo de detección con cada uno de los cuatro anticuerpos de captura pudo determinarse simultáneamente.

Los resultados indicaron que el par de anticuerpos del conjunto DUO de los sistemas r y d se comportó mejor con una respuesta resultante a 6.183 unidades medias de intensidad de fluorescencia o MFI. También se observó que los anticuerpos de detección de Millipore y ABAM proporcionaron una respuesta razonable en el ensayo XAP cuando se combinaron con los anticuerpos de captura de los sistemas RD, los anticuerpos de captura de Millipore, ACAM y Novus produjeron una respuesta menos deseable en el ensayo XAP. Se utilizó el protocolo DUO set de los sistemas r y d para comparar los cuatro pares de anticuerpos en un formato EISA.

El protocolo de sistemas r y d se utilizó con todos los pares de anticuerpos porque refleja los protocolos típicos de EIA ampliamente utilizados en la actualidad, y es análogo a los protocolos utilizados con la tecnología xap. Las pruebas EISA mostraron que el par de anticuerpos de los sistemas r y d volvió a dar los mejores resultados. El par de anticuerpos de Acam no produjo ninguna respuesta, y los pares de anticuerpos de Millipore y Novas produjeron respuestas modestas para evaluar cualquier variación en la reactividad de los anticuerpos.

Con el estándar, los cuatro pares de anticuerpos se probaron con tres estándares diferentes de proteína alfa TNF recombinante de tres proveedores diferentes. Los datos muestran que los estándares de proteína alfa TNF recombinante de los tres proveedores dieron resultados equivalentes. La proteína alfa TNF de los sistemas r y d se utilizó para generar curvas estándar con los ensayos ELSA y XAP.

Mientras que el ensayo ELI A se realizó con el par de anticuerpos del sistema r y d, los ensayos xap utilizaron el anticuerpo de captura del sistema r y d y el anticuerpo de detección de los sistemas r y d o Millipore. La proteína alfa TNF de los sistemas r y d se diluyó para producir un rango de concentraciones de 8.000 a cuatro picogramos por mililitro solamente. El par de anticuerpos de los sistemas r y d produjo el resultado esperado en el ensayo Xap con una respuesta superior a 20.000 MFI, como se muestra.

Cuando se utilizó el anticuerpo de detección de Millipore con el ensayo Xap en lugar del anticuerpo de detección de los sistemas r y d, la respuesta fue de aproximadamente el 30% de la respuesta obtenida con el anticuerpo de detección de los sistemas RD. La línea verde en este gráfico representa la curva estándar del ELA, que tenía un rango de TNF alfa recomendado por el fabricante de 16 a 1000 picogramos por mililitro. Debido al límite del espectrofotómetro, no fue posible aumentar el rango del ensayo Eliza.

Además, el rango dinámico y la sensibilidad de ambos métodos se ilustran mejor cuando se trazan en una escala logarítmica. Se puede observar una clara distinción entre la pendiente de la respuesta de EISA y las respuestas de los ensayos xap, lo que indica además una mayor capacidad limitante para la detección de TNF alfa con el EL iza tanto a concentraciones más altas como más bajas. Los límites de detección o LOD para los dos ensayos funcionales de TNF alfa xap se aproximaron identificando la concentración más baja de TNF alfa con un nivel de respuesta observado mayor que el fondo, más tres veces su desviación estándar o SD de seis repeticiones.

Aquí se puede observar que cuando se utiliza el par de sistemas r y d, la concentración más baja de TNF alfa a 3,91 picogramos por mililitro produjo una respuesta de 66 MFI, que es mayor que la respuesta para la reunión de fondo más tres SD. Este criterio. Cuando se utilizó el anticuerpo de detección de miliporos con el anticuerpo de captura de los sistemas r y d, el límite de detección fue inferior a 7,81 picogramos por mililitro.

En este caso, la segunda concentración más baja de TNF alfa producida en una respuesta aceptable de 17 MFI mayor que la respuesta de la concentración más baja de TNF alfa más tres veces su desviación estándar. Del mismo modo, el límite de detección para el conjunto dúo de sistemas de investigación y desarrollo Eliza se estimó entre 63 y 31 picogramos por mililitro. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros pasos como pruebas, varias matrices de muestras o concentraciones de anticuerpos en el reportero para optimizar aún más el ensayo xap.