Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS
1 de noviembre de 2007
Aislamiento de linfocitos utilizando el kit de Miltenyi MAC es una manera confiable para purificar las células de todo homogeneizados de tejido linfoide. Células purificadas utilizando el sistema de Miltenyi suelen ser ≥ 96% de pureza. Este sentido, demuestran las medidas adoptadas para aislar las células CD4 + T, uno de los kits que se ofrecen por Miltenyi.
Este es un imán Max MIDI. Indica: precaución, campos magnéticos extremadamente fuertes. Hola, soy Melanie Matthew del laboratorio de Mike Collins en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine.
Hoy les vamos a mostrar una preparación por selección negativa de células T CD4 positivas utilizando los kits de Milton Biotechnology. Aquí tenemos el Minimax y los imanes Minimax; los Minimax se utilizan para separaciones más grandes. Puede procesarse hasta 10⁹ células a través de una columna que se coloca en el Minimax, y los Minimax se utilizan para volúmenes de células mucho más pequeños.
Entonces, dependiendo de si está realizando una separación positiva o negativa, etiquetará sus células con el anticuerpo apropiado. Estos tienen una microesfera magnética que se une al imán. En el caso de una selección negativa, las células de su interés pasarán a través de la columna y podrá recolectar el efluente, que contendrá sus células de interés.
Debo mencionar que las técnicas que les muestro esta noche no son estériles. Por lo tanto, si desea utilizar estas células para cultivo celular, debe realizar todos los pasos en la cabina de cultivo de tejidos con instrumentos estériles. Aunque les estoy mostrando un procedimiento para la preparación de células T positivas para CD4, muchas de estas técnicas son aplicables en la purificación de otros tipos celulares utilizando los kits de Miltenyi Biotecnología.
Vale, he extraído los ganglios linfáticos del ratón, y les muestro cómo hacerlo en detalle en el número siete de JoVE sobre la preparación de ganglios linfáticos para imágenes de dos fotones. Ahora voy a triturar los ganglios linfáticos hasta obtener una suspensión de células individuales dentro de un filtro celular de 70 micrones. Bien, ahora voy a triturar los ganglios linfáticos hasta obtener una suspensión de células individuales utilizando la parte trasera de una jeringa de seis mililitros.
Los ganglios linfáticos están en RPMI dentro de un filtro, y es importante obtener una suspensión adecuada de células individuales. La razón por la que hacemos esto en un filtro es asegurarnos de no tener grumos celulares. Por lo tanto, cuando termine de moler, retiraré el filtro del medio y luego usaré las células que han pasado a través del tamiz y la suspensión de células individuales.
Cuando esté moliendo, debe asegurarse de interrumpir todo el tejido tanto como sea posible. Esta suspensión de células individuales es de lo que purificaremos nuestras células T positivas para CD cuatro. Bien, ahora he terminado de moler el tejido y puede ver que la mayor parte de los ganglios linfáticos ha desaparecido casi por completo.
Aún tenemos algunos fragmentos pequeños de grasa y una especie de cápsula de un ganglio linfático aquí, con un poco de tejido conectivo que todo está adherido procedente de los seis ganglios linfáticos. Ahora retiro el filtro celular. Y pueden ver aquí que el medio está muy turbio.
Está lleno de células de la suspensión individual de células para asegurarnos de obtener el número máximo de células del filtro, ya que algunas de ellas se adhieren al mismo. Lo lavo con unos pocos mililitros de medio y luego aspiro todo el medio hacia un tubo Falcon de 15 ml, que centrifugo para formar un sedimento celular destinado a la posterior purificación. Aquí tengo mi suspensión individual de células, centrifugada y sedimentada a 300 G durante 10 minutos.
Si cree que va a tener una alta población de células muertas en su suspensión de células individuales, es recomendable utilizar el kit de eliminación de células muertas de Miltenyi. Ahora que he sedimentado esta muestra, voy a decantar el medio y realizar una lisis de glóbulos rojos, luego contaré las células y a continuación aplicaré un kit de selección negativa de células T CD4 positivas sobre estas células particulares. Muy bien, ahora voy a realizar una lisis de GR.
Vamos a lisar los glóbulos rojos que hemos sedimentado junto con los linfocitos reduciendo la osmolaridad de la solución, primero agregando agua y luego restableciéndola a una solución 1x mediante la adición de D-P-B-S 10x. Nuestros linfocitos son más resistentes al cambio de osmolaridad que los glóbulos rojos, pero aún así debemos trabajar rápidamente para no lisar los linfocitos, lo cual no deseamos. Parte de trabajar rápidamente consiste en que lleno previamente los volúmenes que necesitaré para la lisis antes de agregar agua al sistema.
Entonces, quiero poder agregar mis 10 X-D-B-P-S unos segundos después de agregar el agua para asegurarme de no lisar mis linfocitos y así solo lisar los glóbulos rojos. Así que tomo 900 microlitros de agua, casi un mililitro, y cien microlitros de 10 X-D-B-P-S.
Tengo ambas pipetas listas para usar. En la lisis, agrego el agua, espero unos segundos, tal vez agito un poco el tubo y luego añado el D-B-P-S 10X, agitando un poco más el tubo. Y si tiene muchas células rojas que está lisando, verá formarse un gran agregado amorfo compuesto por todas las membranas celulares rotas.
Tenemos un poco aquí y se puede observar que hay algunas membranas celulares rotas. Entonces, después de realizar la lisis, por si hubo algún error al pipetear, me gusta agregar unos pocos mililitros de medio a las células para asegurarme de que la osmolaridad sea correcta y no se continúe con más lisis. Bien, ahora tengo mis linfocitos en suspensión de células individuales.
Una vez más, he realizado la lisis de los glóbulos rojos y voy a centrifugarlos para obtener el precipitado. Antes de hacer esto, los voy a contar en el hemocitómetro para determinar cuánto anticuerpo necesitamos agregar para el kit de selección negativa de células T CD4 positivas. Bien, ahora centrifugo las células en tampón max y pueden ver que el precipitado es mucho más blanco después de haber realizado la lisis de los glóbulos rojos.
Y voy a realizar una selección negativa de linfocitos T CD4 positivos. Así que voy a verter todo el medio, todo el tampón máximo en el que sedimenté las células. Y voy a etiquetar con el cóctel de anticuerpos biotinilados, que es el paso uno en la selección negativa de linfocitos T CD4 positivos.
Luego, incubaré en el refrigerador durante 10 minutos. Muy bien, mis células ya terminaron su incubación inicial. Ahora voy a añadir el antibiótico a las microesferas y volveré a colocarlas en el refrigerador durante 15 minutos.
Para esta separación celular en particular, utilizamos una columna LS de Miltenyi Biotec y, lo que vamos a hacer es colocarla en el soporte magnético y preparar la columna pasando tres mililitros de tampón MACS a través de ella. Vamos a abrir la columna y colocarla de modo que las púas estén orientadas hacia el interior del imán. Ahora voy a añadir el tampón MACS a la columna, y deberías ver cómo desciende por la columna LS y comienza a gotear por la parte inferior. No te preocupes si la columna se queda sin líquido.
La tensión superficial del líquido evitará que se seque hasta que agregue sus células. Antes de agregar sus células, es importante permitir que el tampón máx se absorba completamente a través de la columna. Bien, después de la incubación de 15 minutos con nuestras perlas magnéticas de an ti biotina que he agregado a las células y al tampón máx, voy a verter el tampón, y resuspenderlas en una cantidad de tampón adecuada para nuestro recuento celular.
Por lo tanto, deberá verificar su protocolo milimétrico para ello. Luego, voy a aplicarlos a la columna que acabamos de lavar con tampón max. Ahora vamos a agregar la suspensión celular a la columna.
Y dado que esta es una columna de selección negativa, vamos a recolectar las células que pasaron a través de ella, las cuales en este caso deberían ser todas células T CD4 positivas. Ahora voy a lavar la columna con 12 milis de tampón máx, y nuevamente, estaremos recolectando el eluido, que debería contener únicamente células T CD4 positivas. A continuación, voy a centrifugar las células T CD4 positivas, resuspenderlas y luego marcarlas con el colorante adecuado que voy a utilizar para la imagenología de tau.
También voy a tomar una pequeña muestra de las células que he purificado y las voy a marcar con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4, y luego las analizaré mediante citometría de flujo para asegurarme de que tengo una población pura de linfocitos T positivos para CD4. Aquí se muestra un vistazo a las células que acabamos de centrifugar. Esta debería ser una población pura de linfocitos T positivos para CD3 y CD4.
Acabo de mostrarles la selección negativa de linfocitos T CD4 positivos. Utilizando el kit de Miltenyi Biotec, vamos a transferir adoptivamente estas células a un ratón y emplearlas en uno de nuestros propios experimentos de T Photón y máquina. Buena suerte con sus propios experimentos.
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Descripción general
Este artículo demuestra el aislamiento de células T CD4+ mediante el uso del kit Miltenyi MACs, un método confiable para purificar linfocitos a partir de homogeneizados completos de tejido linfático. El proceso produce células que típicamente son ≥ 96% puras.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Inmunología
- Técnicas de purificación celular
Antecedentes
- El aislamiento de linfocitos es fundamental para diversos estudios inmunológicos.
- El kit Miltenyi MACs se utiliza ampliamente por su eficiencia y fiabilidad.
- Las células T CD4+ desempeñan un papel importante en la respuesta inmunitaria.
- Los altos niveles de pureza son esenciales para aplicaciones posteriores.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método de selección negativa para el aislamiento de células T CD4+.
- Destacar la eficacia del kit Miltenyi MACs.
- Proporcionar una guía paso a paso para investigadores.
Métodos Utilizados
- Uso de imanes Max MIDI para la separación de células.
- Técnica de preparación por selección negativa.
- Aplicación de kits de biotecnología Miltenyi.
- Procesamiento de grandes volúmenes de células mediante columnas especializadas.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de células T CD4+ con alta pureza.
- Demuestra la eficiencia del kit Miltenyi MACs.
- Ofrece un protocolo confiable para investigadores.
- Ilustra el uso de imanes en la separación celular.
Conclusiones
- El kit Miltenyi MACs es una herramienta eficaz para el aislamiento de linfocitos.
- Niveles elevados de pureza en las células aisladas mejoran los resultados experimentales.
- Este método puede aplicarse a diversos entornos de investigación inmunológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de células T CD4+ altamente puras a partir de ganglios linfáticos de ratón permite ensayos inmunológicos confiables y estudios de transferencia adoptiva. Este protocolo de selección negativa que utiliza la tecnología Miltenyi MACS permite la validación de dianas y el cribado fenotípico al proporcionar células T funcionales e intactas con una pureza ≥96%. El método reduce la variabilidad experimental y mejora la confianza predictiva en la investigación inmunológica preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función de las células T CD4+ en la prueba de hipótesis terapéuticas y la aclaración de vías.
- Valor operativo: Proporciona células T CD4+ vírgenes e intactas para evaluar la interacción con el blanco sin artefactos de activación.
- Valor predictivo: El aislamiento de alta pureza apoya la reducción mecanicista de riesgos en blancos inmunomoduladores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos funcionales posteriores y perfilado de citocinas.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante una viabilidad y pureza celular constante.
- Escalabilidad: Compatible con columnas LS para procesar grandes números de células, lo que permite cribados de throughput medio.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades al proporcionar linfocitos T CD4+ primarios de ratón para transferencia adoptiva.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la preparación estandarizada de células.
- Reducción de riesgos: Facilita la confianza predictiva en las lecturas funcionales y de imágenes al minimizar los tipos celulares contaminantes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta los estudios de imagen preclínicos, especialmente cuando se asocia con protocolos de disección de ganglios linfáticos y de imágenes mediante fotones dobles.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la reducción del riesgo biológico mediante el aislamiento de linfocitos T CD4+ funcionales para estudios mecanicistas.
- Selección: Proporciona células listas para ensayos con resultados cuantitativos para la validación mediante citometría de flujo y lecturas funcionales.
- Análisis: Permite la evaluación de pureza tras el aislamiento mediante FACS utilizando tinción para CD3/CD4, apoyando decisiones basadas en datos de avance o detención.
- Investigación Traducional: Se conecta con imágenes preclínicas mediante la transferencia adoptiva de linfocitos T purificados para su seguimiento in vivo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de aislamiento de linfocitos aplicable en proyectos de inmunología e inmuno-oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Confianza predictiva, validación de dianas y reducción de ambigüedad mecanicista en las vías mediadas por linfocitos T.
- Valor Operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del aislamiento de células primarias.
- Valor Estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en el desarrollo de inmunomoduladores.
- Impacto en el Portafolio: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos fiables de interacción con la diana.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el procesamiento de tejidos primarios y en técnicas de separación celular basadas en microesferas magnéticas.
- Depende de columnas LS de Miltenyi, soportes magnéticos y sistemas de tampón adecuados.
- Necesita una estandarización entre equipos para obtener recuentos celulares consistentes, evaluación de viabilidad y validación mediante FACS.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la ejecución estéril frente a no estéril según el uso final (por ejemplo, cultivo celular frente a transferencia adoptiva).
- Las limitaciones prácticas incluyen el posible estrés celular durante los pasos de molienda y lisis, lo que requiere un manejo suave para mantener la viabilidad.
