La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic C. elegans

El objetivo de este procedimiento es cuantificar de manera eficiente las dimensiones y el brillo de las señales fluorescentes punteadas en gans. Por lo tanto, se pueden analizar grandes poblaciones de objetos. Estadísticamente, se obtienen imágenes de las proteínas sinápticas.

En esta demostración, el primer paso del procedimiento es generar cultivos sincronizados de alta densidad de los ELEGANS de interés. A continuación, obtenga imágenes confocales de las sinapsis etiquetadas minimizando la variabilidad uno a uno de las imágenes. La punción sináptica se identifica automáticamente y se distingue de la fluorescencia de fondo.

El paso final es tabular y organizar los datos para un análisis posterior eficiente. En última instancia, los resultados pueden mostrar con precisión cómo las condiciones experimentales afectan la distribución de las proteínas sinápticas o de cualquier otra proteína localizada en la punción de alto contraste. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de las proyecciones de Zack, es que se conservan todos los datos, incluidos los volúmenes de sinapsis, y la identificación automatizada permite la recopilación rápida de cientos de muestras por condición. Probado.

Este protocolo requiere cultivos de alta densidad de gusanos CL egan adultos cultivados en placas de agar NGM de péptidos de 10 centímetros de alto en bacterias NA 22 e Coli que tienen lista exactamente una placa para cada tinción inmunológica que se planea. Comience cosechando los gusanos y unos mililitros de agua. Transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros y repita este proceso hasta que se recojan la mayoría de los gusanos.

Granule los gusanos y lave el pellet con agua hasta tres veces hasta que el supinato esté claro. De este modo, se eliminan las bacterias residuales, transfiere siempre soluciones que puedan contener gusanos o huevos con pipetas de plástico, ya que pueden adherirse al vidrio. Ahora es fundamental avanzar rápidamente a través de los pasos restantes para evitar la pérdida de viabilidad del óvulo.

Libera los huevos del gusano volviéndolos a doblar en cinco mililitros de solución alcalina de hipoclorito. Balancee los tubos suavemente y examínelos bajo un microscopio de disección aproximadamente una vez por minuto. Después de cinco minutos, o tan pronto como aproximadamente la mitad de los gusanos en un tubo aparecen doblados y abiertos.

Llene el tubo hasta arriba con tampón de huevo e inviértalo varias veces. Después de peletizar las mentiras, los gusanos aspiran y desechan el supnatante. A continuación, lave el pellet tres veces con tampón de huevo.

Después de los lavados, Reese suspende el pellet en cinco mililitros de agua, seguido de la adición de cinco mililitros de estéril. 60% de sacarosa en agua mezclar bien. Después de peletizar la suspensión, los huevos estarán en el menisco y aparecerán turbios.

Transfiera cada colección de huevos a su propia placa de agar NGM de 10 centímetros sin semillas. Se puede usar agua para enjuagar X en la placa, pero trate de minimizar la cantidad de líquidos transferidos. Incubar las placas durante la noche a 20 grados centígrados durante las primeras horas. Ventile las placas dejando las tapas ligeramente separadas, pero asegúrese de cubrirlas durante la noche.

Después de la eclosión, transfiera las larvas L one a un tubo cónico de 15 mililitros lleno de albahaca S. Pellet las L y resuspenderlas en un volumen mínimo de albahaca S. A continuación, divida cada colección L one en dos placas de agar NGM de 10 centímetros sembradas con la bacteria NA 22.

Monitoree los cultivos una o dos veces al día. Si están en peligro de morir de hambre. Transfiéralos a platos frescos NA 22 antes de morir de hambre, mientras que el tipo N dos líneas de recolección y se mueven juntos como una ola lejos de las zonas agotadas de alimentos en estos platos, la comida se agotará por completo en unas pocas horas.

Cuando los gusanos alcanzan la edad deseada, están listos para la inmunotinción o la obtención de imágenes en vivo para montar los gusanos. Para imágenes confocal. Utilice los medios de montaje Antifa para ajustar su densidad a unos pocos cientos de gusanos por microlitro.

Con la experiencia, esta densidad se puede reconocer por la turbidez de la suspensión. Idealmente, los gusanos estarán densamente empaquetados en el portaobjetos del microscopio, pero sin superponerse excesivamente. En el tobogán, haga una almohadilla de 2%aros en albahaca ESP rodeada por un anillo delgado de vaselina.

Para evitar la evaporación durante la toma de imágenes, aplique la vaselina a través de una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 25. A continuación, pipetee unos pocos microlitros de la suspensión de gusanos en un cubreobjetos utilizando una punta de pipeta con el extremo cortado para evitar el cizallamiento de los gusanos y baje la almohadilla de agro rose sobre el cubreobjetos, distribuyendo los gusanos uniformemente sobre el cubreobjetos bajo el microscopio. Las sinapsis de interés deben orientarse para que apunten directamente hacia o dentro de los 45 grados de la lente únicamente.

Dedique unos segundos a esto para evitar el blanqueo de las fotos. El cultivo y las condiciones deben proporcionar suficientes gusanos para cumplir con este criterio estricto que se muestra aquí como una orientación ideal con el cordón ventral orientado directamente hacia la lente del objetivo. El siguiente sería rechazado porque el cordón ventral está orientado directamente lejos de la lente del objetivo.

Observe cómo el cordón dorsal orientado hacia el cristalino en este espécimen produce la imagen más nítidamente enfocada. Aquí hay otro que sería rechazado porque los cordones dorsal y ventral están orientados a los bordes del gusano. Por lo tanto, la excitación y la emisión de luz deben pasar a través de más tejido de gusano y se distorsionarían.

El mayor desafío es minimizar la variabilidad dentro de los grupos de tratamiento, la sincronización de edades, y elegir gusanos donde la estructura de interés esté orientada directamente hacia la lente objetivo puede ayudar mucho. Comenzar con cultivos grandes aumenta la elección de lombrices para obtener la máxima consistencia. Para obtener los mejores resultados de imagen, elija muestras relativamente planas que se puedan abarcar dentro de una pila de 14 o menos.

Secciones de 0,4 micras de espesor. Las imágenes de alta velocidad y baja resolución son suficientes para una recopilación de datos rápida y precisa. Evite saturar el detector con intensidades de señal excesivas, ya que esto causará una subestimación de las señales de fluorescencia.

Esta demostración utiliza el paquete de software disponible comercialmente velocity, que debe ser al menos la versión 4.0. Muchas opciones de software alternativo pierden información tridimensional. Después de abrir los archivos de salida multi tiff del microscopio confocal, seleccione la imagen, luego el enfoque extendido y luego la mano alzada.

El ROI ahora recorta las áreas de la imagen que no contienen la estructura de interés. Con la herramienta activada, el enfoque extendido proporciona una proyección en el plano Z para facilitar la selección del ROI. Esto no afecta a los datos subyacentes.

Del mismo modo, los ajustes de brillo y contraste no afectan a los datos subyacentes. Finalice el recorte seleccionando acciones y recorte a selección. A continuación, mida la longitud del área analizada.

Con la herramienta de línea, se calculará la longitud de la línea y se agregará a la tabla de datos. Ahora, identifique los objetos usando el filtro de objetos por intensidad en el modo de mediciones. La inclusión de un marcador sináptico independiente etiquetado con un color único puede ayudar a identificar las sinapsis de manera inequívoca, especificar un umbral tal que los grupos sinápticos estén resaltados y el fondo no sináptico no.

Haga esto solo una vez usando una muestra de control y utilícela para todas las muestras subsiguientes, umbralizando cada muestra por separado es inaceptable porque introduce el potencial de sesgo del experimentador. Los objetos se seleccionan y tabulan automáticamente. Las sinapsis típicas van desde unos pocos hasta unos pocos cientos de vóxeles antes de exportar los datos, ordene los datos por tamaño de objeto.

Esto facilita la eliminación posterior de objetos de dos o menos vóxeles, que suelen ser solo especificaciones de fondo. Ahora, exporte los datos en formatos CSV, que pueden ser abiertos por cualquier programa de hoja de cálculo. Cada imagen produce un archivo de salida para clasificar y exportar las micrografías del cordón nervioso ventral CL gans que se muestran en 49 receptores GABA que se produjeron con el protocolo descrito.

Todos los animales parecían muy similares en tamaño y madurez. Se normalizaron los valores de fluorescencia sináptica total de cinco gusanos, por lo que se analizó la longitud del cordón nervioso. Estos datos mostraron valores de error estándar de alrededor del 10% de la media.

La imagen de la izquierda es sin procesar sin umbral ni eliminación de especificaciones de fondo. Las sinapsis se trataron con mus carmal, un agonista del receptor GABA que hace que los receptores se regulen a la baja después de una exposición prolongada. La fluorescencia total se cuantificó y normalizó a la probabilidad acumulada de la longitud del cordón nervioso.

Se calcularon los histogramas del contenido de fluorescencia sinapsica de los individuos. Lo mismo se calculó para el volumen de la sinapsis. Estas mediciones muestran que la exposición a los agonistas reduce significativamente el contenido y el volumen sináptico.

En general, los resultados cuantitativos siempre deben reflejar lo que se puede apreciar visualmente. De lo contrario, la inspección de las imágenes y los objetos identificados por la velocidad debe revelar dónde se produjo el error y sugerir acciones correctivas, como la creación de umbrales o la eliminación de artefactos. Es fundamental elegir los gusanos para la obtención de imágenes en función de cómo están orientados geométricamente, en lugar de una evaluación subjetiva de la calidad de la imagen, donde se recomienda encarecidamente una posible puntuación ciega.