La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic C. elegans

El objetivo de este procedimiento es cuantificar de manera eficiente las dimensiones y el brillo de las señales fluorescentes puntuales en gans. Así pueden analizarse poblaciones grandes de objetos. Se obtienen imágenes de proteínas sinápticas estadísticamente.

En esta demostración, el primer paso del procedimiento consiste en generar cultivos sincronizados de alta densidad de ELEGANS de interés. A continuación, obtenga imágenes confocales de las sinapsis marcadas, minimizando la variabilidad individuo a individuo en las imágenes. Las punciones sinápticas se identifican y distinguen automáticamente de la fluorescencia de fondo.

El paso final consiste en tabular y organizar los datos para un análisis posterior eficiente. En última instancia, los resultados pueden mostrar con precisión cómo las condiciones experimentales afectan la distribución de las proteínas sinápticas o cualquier otra proteína localizada en perforaciones de alto contraste. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el análisis de proyecciones Zack, es que se conservan todos los datos, incluyendo los volúmenes de sinapsis, y la identificación automatizada permite reunir rápidamente cientos de muestras por condición. Probado.

Este protocolo requiere cultivos de alta densidad de gusanos adultos CL egan's cultivados en placas de agar NGM con péptido alto de 10 centímetros sobre bacterias NA 22 e Coli. Tenga preparada exactamente una placa para cada tinción inmunológica que se tenga prevista. Comience por cosechar los gusanos con unos pocos mililitros de agua. Trasférilos a un tubo cónico de 15 mililitros y repita este proceso hasta que se hayan recolectado la mayoría de los gusanos.

Centrifugar los gusanos y lavar el sedimento con agua hasta tres veces hasta que el sobrenadante esté claro. Esto elimina las bacterias residuales; siempre transferir las soluciones que puedan o contengan gusanos o huevos con pipetas de plástico, ya que pueden adherirse al vidrio. Ahora es fundamental avanzar rápidamente a través de los pasos restantes para evitar la pérdida de viabilidad de los huevos.

Suelte los huevos del gusano doblando nuevamente los especímenes en cinco mililitros de solución alcalina de hipoclorito. Agite suavemente los tubos y examínelos al microscopio estereoscópico aproximadamente una vez por minuto. Después de cinco minutos, o tan pronto como aproximadamente la mitad de los gusanos en un tubo parezcan doblados y abiertos.

Llene el tubo hasta arriba con tampón de huevo e inviértalo varias veces. Después de centrifugar los gusanos, aspire y deseche el sobrenadante. Luego lave el sedimento tres veces con tampón de huevo.

Después de los lavados, Reese suspende el sedimento en cinco mililitros de agua, seguido por la adición de cinco mililitros de sacarosa estéril al 60% en agua y mezclar bien. Después de sedimentar la suspensión, los huevos se ubicarán en el menisco y tendrán un aspecto turbio.

Transfiera cada colección de huevos a su propia placa de agar NGM de 10 centímetros sin sembrar. Se puede usar agua para enjuagar X hacia la placa, pero intente minimizar la cantidad de líquidos transferidos. Incube las placas durante la noche a 20 grados Celsius durante las primeras horas. Ventile las placas dejando las tapas ligeramente abiertas, pero asegúrese de cubrirlas durante la noche.

Después de la eclosión, transfiera las larvas L1 a un tubo cónico de 15 mililitros lleno con S basil. Pelote las L1 y resuspenda en un volumen mínimo de S basil. Luego, divida cada colección de L1 en dos placas de agar NGM de 10 centímetros sembradas con bacterias NA22.

Monitoree los cultivos una o dos veces al día. Si están en peligro de sufrir inanición, transfiéralos a placas frescas de NA 22 antes de que ocurra la inanición, mientras las líneas de tipo N se agrupan y avanzan juntas como una ola alejándose de las zonas desprovistas de alimento; en estas placas, el alimento se agotará por completo en unas pocas horas.

Cuando los gusanos alcancen la edad deseada, estarán listos para la inmunotinción o para imágenes en vivo para montarlos. Para imágenes confocales, use un medio de montaje Antifa para ajustar su densidad a unos pocos cientos de gusanos por microlitro.

Con experiencia, esta densidad puede reconocerse por la turbidez de la suspensión. Idealmente, los gusanos estarán densamente empaquetados en la preparación microscópica, pero sin superponerse excesivamente. En la preparación, haga una almohadilla de 2%aros en ESP albahaca rodeada por un anillo delgado de vaselina.

Para evitar la evaporación durante la imagen, aplique la vaselina mediante una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 25 cortada. Ahora, pipete unas pocas microlitros de la suspensión de gusanos sobre un cubreobjetos utilizando una punta de pipeta con el extremo cortado para evitar el cizallamiento de los gusanos, y coloque suavemente la almohadilla de agarosa sobre el cubreobjetos, distribuyendo uniformemente los gusanos sobre la almohadilla bajo el microscopio. Las sinapsis de interés deben orientarse de manera que apunten directamente hacia la lente o dentro de un ángulo de 45 grados respecto a ella únicamente.

Pasen unos segundos en esto para evitar el blanqueo por luz. El cultivo y las condiciones deben proporcionar suficientes gusanos para cumplir con este criterio estricto mostrado aquí como una orientación ideal, con el cordón ventral orientado directamente hacia la lente del objetivo. Este siguiente sería rechazado porque el cordón ventral está orientado directamente en sentido opuesto a la lente del objetivo.

Observe cómo la cuerda dorsal orientada hacia el objetivo en este espécimen produce una imagen más nítidamente enfocada. Aquí hay otro ejemplo que sería rechazado porque las cuerdas dorsal y ventral están orientadas en los bordes del gusano. Por lo tanto, la luz de excitación y emisión debe atravesar más tejido del gusano y se distorsionaría.

El principal desafío consiste en minimizar la variabilidad dentro de los grupos de tratamiento; la sincronización por edad y la selección de gusanos en los que la estructura de interés esté orientada directamente hacia el objetivo del lente pueden ayudar considerablemente. Comenzar con cultivos grandes aumenta la disponibilidad de gusanos para lograr la máxima consistencia. Para obtener los mejores resultados de imagen, elija muestras relativamente planas que puedan incluirse dentro de una serie de 14 imágenes o menos.

Secciones de 0,4 micrones de grosor. Imágenes de alta velocidad y baja resolución son suficientes para una recolección rápida y precisa de datos. Evite saturar el detector con intensidades de señal excesivas, ya que esto provocará una subestimación de las señales de fluorescencia.

Esta demostración utiliza el paquete de software disponible comercialmente Velocity, que debe ser al menos la versión 4.0. Muchas alternativas de software pierden información tridimensional. Después de abrir los archivos de salida multi-TIFF del microscopio confocal, seleccione imagen, luego enfoque extendido y después trazado manual.

La ROI ahora recorta áreas de la imagen que no contienen la estructura de interés. Al utilizar la herramienta activada, el enfoque extendido proporciona una proyección del plano Z para facilitar la selección de la ROI. Esto no afecta los datos subyacentes.

Asimismo, los ajustes de brillo y contraste no afectan los datos subyacentes. Finalice el recorte seleccionando acciones y recortar a la selección. A continuación, mida la longitud del área analizada.

Al utilizar la herramienta de línea, se calculará la longitud de la línea y se agregará a la tabla de datos. A continuación, identifique los objetos utilizando el filtro de objetos por intensidad en el modo de mediciones. La inclusión de un marcador sináptico independiente marcado con un color único puede ayudar a identificar sin ambigüedades las sinapsis; especifique un umbral de manera que los cúmulos sinápticos queden resaltados y el fondo no sináptico no lo esté.

Haga esto solo una vez utilizando una muestra control y utilícelo para el umbral de todas las muestras posteriores; umbralizar cada muestra por separado no es aceptable porque introduce la posibilidad de sesgo del experimentador. Los objetos se seleccionan y tabulan automáticamente. Las sinapsis típicas varían desde unos pocos hasta cientos de pocos vóxeles; antes de exportar los datos, ordene los datos por tamaño de objeto.

Esto facilita la eliminación posterior de objetos de dos vóxeles o menos, que generalmente son solo artefactos del fondo. Ahora, exporte los datos en formatos CSV, que pueden abrirse con cualquier programa de hojas de cálculo. Cada imagen produce un archivo de salida para ordenar y exportar micrografías del cordón nervioso ventral de los gansos CL que muestran 49 receptores GABA producidos con el protocolo descrito.

Todos los animales parecían muy similares en tamaño y madurez. Se normalizaron los valores totales de fluorescencia sináptica de cinco gusanos, según la longitud del cordón nervioso analizado. Estos datos mostraron valores de error estándar de aproximadamente el 10 % de la media.

La imagen de la izquierda es cruda, sin umbral ni eliminación de fondo específico. Las sinapsis se trataron con muscarmal, un agonista del receptor GABA que provoca la regulación a la baja de los receptores tras una exposición prolongada. Se cuantificó la fluorescencia total y se normalizó respecto a la longitud del cordón nervioso y a la probabilidad acumulativa.

Se calcularon histogramas del contenido de fluorescencia de sinapsis individuales. Se realizó el mismo cálculo para el volumen sináptico. Estas mediciones muestran que la exposición al agonista reduce significativamente el contenido y el volumen sinápticos.

En general, los resultados cuantitativos siempre deben reflejar lo que puede apreciarse visualmente. Si no es así, el examen de las imágenes y de los objetos identificados por la velocidad debe revelar dónde ocurrió el error y sugerir medidas correctivas, como el ajuste del umbral o la eliminación de artefactos, durante el intento de este procedimiento. Es fundamental elegir los gusanos para el análisis de imágenes en función de su orientación geométrica, y no de una evaluación subjetiva de la calidad de la imagen; siempre que sea posible, se recomienda encarecidamente la puntuación ciega.