Modelado Colitis asociada a cáncer con azoximetano (AOM) y Sodio sulfato de dextrano (DSS)

En el día cero, Myer inyectó azoximetano o un OM a la semana siguiente. Su agua de bebida se reemplaza con una solución que contiene sulfato de sodio dextrano o DSS. En la semana tres, los ratones reciben agua durante las dos semanas siguientes.

Este ciclo de DSS en agua se repite dos veces adicionales. Después del segundo ciclo de DSS, los ratones pueden evaluarse para tumores mediante endoscopia de reflejo.

Después de la semana 10, se sacrifican los ratones y se extraen los colones. Los colones se lavan y se abren longitudinalmente. Se evalúan el tamaño y el número de tumores en los colones.

Se puede incluir e incluir un corte longitudinal del colon en tercios para su análisis histológico. Mediante microscopía óptica, se pueden contar y clasificar los tumores. Demostramos un protocolo en el que se administra el agente genotóxico a OM, seguido de tres ciclos del agente proinflamatorio.

El DSS genera rápidamente y de manera consistente tumores de colon en ratones, con similitudes morfológicas y moleculares a los observados en el cáncer asociado a colitis humana. Etiquete individualmente los ratones con marcas en la cola o pinzas en las orejas en el día cero, registre el peso basal de cada ratón en una tabla, luego inyecte a cada ratón una solución de 10 miligramos por kilogramo de un ejercicio OM. Tenga precaución al manipular el OM, ya que es un agente genotóxico. En el día siete, proporcione a los ratones una solución de DSS al 2,5 % como agua de bebida durante la semana siguiente. Para preparar esta solución, agregue polvo de DSS a agua destilada y mezcle hasta que se disuelva.

La solución está lista después de pasar por un filtro de acetato de celulosa de 0,2 micrones. Para proporcionar un suministro continuo de solución de DSS durante siete días, reemplace el DSS cada dos o tres días.

Después de este período, cambie las jaulas de nuevo al agua durante dos semanas. Pese a los ratones dos o tres veces por semana y observe la presencia de sangrado rectal y diarrea. Los ratones con tumores grandes pueden desarrollar temporalmente prolapso rectal, aunque esto generalmente no reduce el porcentaje de supervivencia.

La pérdida de peso en relación con el valor basal se utiliza como una medida sustituta de la gravedad de la colitis. Se puede esperar una pérdida de peso de hasta el 10 %, junto con dos o tres días de diarrea y sangrado rectal, durante la semana posterior a un ciclo completo de endoscopia con DSS. Puede realizarse un segundo o tercer ciclo de DSS para confirmar el crecimiento tumoral in vivo antes del sacrificio.

Dado que el modelo A-O-M-D-S-S es bastante confiable para inducir tumores, este paso generalmente no es necesario. Solo se deberían evaluar unos pocos ratones mediante este método, ya que tiene el potencial de alterar los tumores en los ratones. Su área de trabajo debe incluir un vaso con solución salina tamponada con fosfatos estéril o PBS, así como un vaso vacío.

Para desechar el PBS usado, aspire de ocho a 10 mililitros de PBS en una jeringa y acople esta al extremo del endoscopio por cada uso. Al lavar los contenidos intraluminales, anestesie cada ratón con sedación inhalada o inyectable y sujete al ratón sobre una tabla plana con cinta adhesiva en la cola y el pecho; se pueden pinzar las almohadillas de las patas del ratón. Para asegurar una sedación adecuada, utilice el pulgar y el dedo índice para pinzar el abdomen inferior del ratón y exponer el ano, luego introduzca el endoscopio murino en el recto del ratón.

Usar suavemente PBS para inflar e irrigar con el fin de mejorar la vista intraluminal y eliminar el contenido fecal. Continuar avanzando lentamente el endoscopio mientras se observa la pantalla. En presencia de tumores evidentes el día 70, cada ratón tratado con A-O-M-D-S-S debe albergar múltiples tumores de colon y estar listo para su evaluación.

Este estado puede retrasarse semanas o meses si se desean tumores más grandes. Prepare una jeringa llena de PBS conectada a una aguja de gavaje. Una jeringa cargada con formalina al 10 %, tijeras quirúrgicas básicas, tijeras con puntas redondeadas.

Una jeringa pequeña cargada con solución de Ian Blue al 1 % y pinzas finas. Además, prepare una bandeja fría, un bote de recolección con PBSA frío, una cuchilla nueva para seccionar y un recipiente de fijación lleno con formalina al 10 %. Eutanasiar cada ratón mediante isoflurano y dislocación cervical o mediante otro método aprobado institucionalmente. Pueden realizarse la medición del peso final y otras mediciones.

En este momento, coloque al ratón con su lado ventral expuesto sobre una tabla de cortar. Rocíe el abdomen con etanol al 70 % para mantener los pelos alejados del área de disección. Utilice pinzas para sujetar la línea media del abdomen y realice una pequeña incisión a través de la piel para exponer el peritoneo.

Utilice tracción suave para separar la piel del peritoneo y exponer toda la cavidad abdominal. Haga una incisión en el peritoneo y extienda esta incisión a lo largo del margen costal bilateralmente. Utilice tijeras cerradas para desplazar el intestino delgado y el colon hacia un lado.

Esto expondrá los ganglios linfáticos mesentéricos, que pueden recolectarse opcionalmente. Para la evaluación, desplace hacia abajo el tracto genital urinario para exponer el colon descendente y el recto, y extirpe la vejiga y los órganos reproductivos según sea necesario para exponer aún más la pelvis, teniendo cuidado de no alterar los tejidos adyacentes.

Corte a través de los ramas púbicas inferior y superior para exponer la unión ano-rectal. Corte la piel alrededor de la unión ano-rectal para liberar el colon mientras se aplica una tracción suave hacia arriba. Con fórceps mesentéricos, los ligamentos de fijación del colon pueden seccionarse o separarse cuidadosamente.

Es importante conservar parte de la piel en la unión ano-rectal, ya que esta zona suele verse afectada por displasia. Seccione el intestino grueso del intestino delgado justo proximal al ciego. Separe el ciego del colon adyacente utilizando una aguja de sonda de calibre 18 conectada a una jeringa de cinco mililitros.

Lave el colon con PBS frío con hielo de manera que el líquido salga en dirección fisiológica utilizando tijeras de bordes redondeados. Abra el colon a lo largo de su mesenterio. Extienda el colon abierto sobre la bandeja fría.

Asegúrese de que la bandeja haya descongelado lo suficiente como para no congelar el tejido. Aplique unas gotas de Azul de Ian al 1% con el dedo para visualizar mejor los tumores. Evalúe el número y tamaño de los tumores con una regla o tome fotografías para análisis digital.

Pequeñas secciones de tumor en tejido normal adyacente pueden extirparse en este momento para su análisis posterior mediante métodos de proteínas de ARN o inmunohistoquímicos, dejando una porción del colon para evaluación histológica. Aplique formal al 10 % en el colon restante sobre la bandeja fría mediante jeringa o con el dedo, permitiendo que el tejido se fije durante al menos 30 segundos. De esta manera, se facilita la transferencia a la cubeta de fijación.

Asegúrese de eliminar todo el formol residual antes de colocar un nuevo colon abierto en la misma bandeja. Transfiera el colon a un recipiente lleno de formol al 10 % y sujételo por los bordes. Después de tres horas de fijación, deseche el formol y reemplácelo con etanol al 70 %.

Los colones pueden conservarse indefinidamente en etanol al 70%. Use calor bajo para preparar una solución al 2% de agar y aparte un portaobjetos limpio sobre una placa de vidrio. Corte el colon fijado en tres partes e introduzca las piezas no utilizadas nuevamente en la cuba de etanol.

Recorte las secciones a un tamaño uniforme utilizando dos cuchillas. Incruste secciones y capas del colon en agar sobre un portaobjetos limpio. Repita este proceso para el siguiente colon.

Seccione transversalmente, elimine el exceso de agar y coloque el colon incluido en un casete para su procesamiento y tinción con hematina y eosina. La figura uno describe el protocolo para la inducción de cáncer asociado a colitis. La figura dos muestra el peso del ratón en relación con la línea base durante la administración de OM y DSS.

Téngase en cuenta que en la semana posterior a cada ciclo de DSS, los ratones pierden entre un 5 y un 10 % de su peso corporal. La pérdida de peso en este experimento es un marcador sustituto de la gravedad de la colitis. La figura tres muestra una vista de los tumores en el colon distal mediante endoscopia murina al día 50 del tratamiento con A-O-M-D-S-S.

Téngase en cuenta las múltiples masas polipoides que obstruyen la luz del colon distal en los paneles B y C, en comparación con el colon normal. En el panel A, la figura cuatro muestra un colon de ratón abierto longitudinalmente que ilustra el aspecto macroscópico de los tumores. Obsérvese la mayor carga tumoral en el colon distal y la textura característica plicada del colon proximal con escaso crecimiento tumoral.

La figura cinco muestra tumores resaltados mediante la aplicación del colorante lc y azul. Observe cómo el colorante enfatiza la textura normal del colon, así como los bordes de cada tumor individual. Dicha tinción puede ser útil para la medición precisa de las áreas tumorales mediante regla o medición digital.

La figura seis muestra la distribución representativa del número promedio de tumores por ratón tratado con OM y DSS. Obsérvese que la mayoría de los tumores se localizan en el colon distal y tienen menos de dos milímetros de tamaño. La figura siete muestra secciones longitudinales del colon embebidas en parafina, colocadas en una cubeta, y una laminilla teñida con hematoxilina y eosina.

Téngase en cuenta que la mancha residual de S y la tinción azul no interfieren con la tinción con H y E. Un tumor grande está marcado con un círculo en la imagen del portaobjetos. Las designaciones distal, media y proximal resultan de seccionar todo el colon en tercios entre el ciego y el ano.

La figura ocho muestra la histología representativa de un tumor resultante de la administración de OM y DSS en el colon distal. Las microfotografías mostradas están teñidas con H y E-B-R-D-U y beta-catenina, y demuestran cambios displásicos similares a los adenocarcinomas humanos del colon. En este video, hemos demostrado un protocolo para la tumorigénesis colónica inducida por inflamación en ratones, que utiliza una inyección única de OM seguida de tres ciclos de siete días de DSS.

En un período de 10 semanas, este modelo induce tumores con cambios histológicos y moleculares que se asemejan estrechamente a los que ocurren en el cáncer asociado a la colitis humana, y proporciona un modelo altamente valioso para el estudio de la oncogénesis y la quimioprevención en esta enfermedad.