Name: El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende a depletar y reconstituir macrófagos polarizados en ratones mediante transferencia adoptiva. Este protocolo permite estudiar su función en la inflamación y enfermedades de manera más rápida que los métodos tradicionales de cría.

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Este trabajo fue apoyado por una &quot;subvención al Servicio de la Investigación&quot; de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of Canada al LMS, que se apoya en una Asociación Canadiense de Gastroenterología / Asociación Canadiense de Investigación en Salud / enfermedad de Crohn &#39;s and Colitis Foundation Premio de Canadá, New Investigator.

1. Los macrófagos que agotan la Utilización de liposomas que contienen clodronato <ol><li> Los liposomas se almacenan a 4 ° C. Dos horas antes de la inyección, retire clodronato que contienen liposomas, los liposomas que contienen PBS o PBS estéril (inyección de control) del refrigerador para permitir que se adapte a la temperatura ambiente (18 ° C). </li><li> Invertir los tubos que contienen liposomas 8-10 veces para asegurar una distribución uniforme antes de cargar 200 l en una jeringa de 1 ml. Colocar una aguja de calibre 26 a la parte superior de la jeringa. </li><li> Con la mano izquierda pescuezo, el ratón debajo de las orejas que sostienen la piel lo suficiente para inmovilizar la cabeza y las extremidades. </li><li> Al girar el ratón por lo que su cabeza es ligeramente hacia el suelo para los órganos internos se mueven lejos del sitio de inyección, que se encuentra en el cuadrante inferior derecho del abdomen. </li><li> Haga rodar la jeringa entre las palmas de las manos e invertirlo 6 veces para distribuir uniformemente la solución de liposomas antes de la inyección. </li> &lt;li&gt; Inserta la aguja en la parte inferior derecha del abdomen del ratón en un ángulo de 30-40. Inyectar 200 l de solución de liposomas o PBS. </li><li> Durante un modelo de inflamación inducida, como la colitis inducida por DSS, inyectar ratones 4 días antes de la aparición de la inflamación experimental para garantizar el agotamiento de los macrófagos residentes y cada 2 días durante el protocolo de agotar los nuevos macrófagos infiltrantes. </li><li> Al final del experimento, junto con los análisis experimentales planificadas, extraer tejidos desde el sitio de interés y fijar con paraformaldehído para confirmar el agotamiento del macrófago por tinción inmunohistoquímica. </li></ol> 2. Derivación de los macrófagos polarizados de aspirados de médula ósea <ol><li> La médula ósea de ratones de entre 8 y 12 semanas de edad proporciona el mayor rendimiento de derivados de médula ósea macrófagos. Practicar la eutanasia con el ratón, que yacía sobre la espalda, y precisar sus patas, que se extiende a sus miembros en la medida de lo posible. </li><li> Trabajo en un recipiente estéril Hood, eliminar fémur y la tibia, cortando tanto músculo como sea posible. </li><li> Lavar la médula de los huesos usando IMDM con FCS al 10% carga en una jeringa de 5 ml equipado con una aguja de calibre 26. </li><li> Diluir aspirado de médula ósea a 40 ml en IMDM con 10% FCS, las células de lugar en una de 75 cm 2 frasco de cultivo de tejidos, y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 4 horas. Este paso quita adherentes células mesenquimales o macrófagos maduros de progenitores hematopoyéticos. </li><li> Transferir el sobrenadante de cultivo que contiene no adherentes progenitores a un Tubo de 50 ml cónico de Falcón y centrifugar durante 5 min a 1200 rpm. </li><li> Resuspender pellet de células en 5 ml de IMDM, 10% de FCS y contar las células nucleadas por dilución de la suspensión celular 1 en 20 en ácido acético. Este procedimiento destruye las células, incluyendo todos los glóbulos rojos y los núcleos restantes se pueden contar con un hemocitómetro. </li><li> Resuspender las células a una concentración de 0,5 x 10 6 células / ml en medio completo; IMDM, 10% FCS, 150 mM monotioglicerol (MTG), y 10 ng / ml de cualquiera de MCSF, GM-CSF o IL-3. MCSF macrófagos derivados son clásicamente macrófagos activados, mientras que los macrófagos GM-CSF o IL-3-derivados se alternativamente activado. </li><li> Sustituir medio a 4 días, girando hacia abajo las células no adherentes y devolverlos al matraz, y en el día 7, descartando las células no adherentes. </li><li> Además, IFN (10 ng / ml) o IL-4 (10 ng / ml) se puede añadir a matraces que contienen MCSF células derivadas en el día 7 a los macrófagos sesgar a una. Clásicamente activado o un fenotipo alternativamente activado, respectivamente Se incuban las células durante 3 días más. </li><li> Al día 10, se separa el medio y levante las células fuera del frasco de cultivo de tejidos utilizando la célula tampón de disociación (Gibco-BRL). Coloque 5 ml de tampón en las células durante 5 minutos a temperatura ambiente (18 ° C) y luego golpear el lado del aparato, con el talón de la palma de la mano firmemente varias veces. Asegurarse de que las células han quitado del matraz examinando el matraz bajo unmicroscopio. Pipetee resuspendieron las células en un tubo de 15 ml cónico Falcon y lavar el matraz con 10 ml adicionales de IMDM, 10% de FBS. La piscina y centrifugar las células durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Contar células viables utilizando un hemocitómetro y resuspende a una concentración de 10 7 células / ml en PBS estéril pH 7,4. Los macrófagos están listos para su inyección en ratones. </li><li> Reserva de 1,0 × 10 6 macrófagos para la evaluación del fenotipo de los macrófagos. Macrófagos activados Clásicamente estimulados con niveles altos de lipopolisacárido secretan óxido nítrico y los niveles de IL-12p70 y baja de IL-10 en comparación con los macrófagos activados alternativamente. Macrófagos activados alternativamente expresan constitutivamente YM1 y arginasa I (Argi), que puede ser detectada por inmunotransferencia. </li></ol> 3. Tranferring macrófagos en ratones <ol><li> Macrófagos Resuspender en PBS estéril a una concentración de 10 7 células / ml. Esto permite una eninyección intravenosa de 10 6 macrófagos en un volumen total de 100 l, que es un volumen que puede ser de forma segura y cómodamente inyecta en ratones por la vena de la cola. </li><li> Los ratones tibia con una almohadilla térmica o una vuelta al calor durante 5-10 minutos para dilatar la vena de la cola. Controlar el ratón en todo momento en busca de signos de la hipertermia. </li><li> Transferir el ratón a un dispositivo de retención que permite el acceso a las venas de la cola. </li><li> Gire la cola de 90 ° para que la vena se hacia arriba. Las venas correr lateralmente a ambos lados de la cola y, o bien la vena se puede utilizar. </li><li> Limpie el sitio de la inyección con un algodón empapado en alcohol y poco a poco, inyectar 100 l (10 6 macrófagos), utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 26 ó 28. Insertar la aguja con el lado cónico hacia arriba y con un ligero ángulo, casi paralela a la vena. </li><li> Si la aguja se inserta adecuadamente sin resistencia debe ser sentida y la vena debe quedar claro después de la inyección. Si la aguja no está en elorden de cosas, la cola se hinchará. Si esto sucede, retire la aguja y vuelva a intentarlo proximal a la última tentativa, o en la vena otra. Una nueva aguja debe ser utilizado para cada inyección como la cola es dura y las agujas se embotan rápidamente durante la inyección vena de la cola. </li><li> Después de la inyección, retire la aguja, aplique una leve presión sobre el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detenga, y controlar el ratón de un 5 minutos adicionales para asegurarse de que el sangrado se ha detenido. </li><li> Repetir las inyecciones macrófagos cada 4 días para asegurar un suministro continuo de los macrófagos polarizados durante el procedimiento experimental. </li><li> Al final del experimento, junto con los análisis experimentales, extraer tejidos desde el sitio de interés y fijar con paraformaldehído o formalina para confirmar la entrega efectiva de los macrófagos polarizados por tinción inmunohistoquímica. </li></ol> 4. Los resultados representativos El número y el fenotipo de macrop residentePasador valvula en cualquier tejido determinado depende del tejido que se examina y cambiará durante la infección o inflamación. De manera similar, la capacidad de los liposomas que contienen clodronato para agotar los macrófagos a partir de un tejido dependerá de la vía de administración y la entrega efectiva para el tejido diana. La inyección intraperitoneal de clodronato liposomas que contienen los resultados en una disminución en F4/80 + macrófagos en el colon de ratón durante DSS-colitis inducida evidente por tinción inmunohistoquímica para el marcador de macrófagos, F4/80 (Figura 1A). Tinción histológica también se puede utilizar para determinar las diferencias cuantitativas en número de macrófagos y fenotipo en secciones de tejido. Figura 1B muestra que un promedio de 55% de los macrófagos se agote por clodronato que contienen liposomas en comparación con ningún agotamiento detectado en dos puntos del ratón cuando los ratones son inyectados con PBS solo como un control de la inyección. Cada valor se determina contando F4/80 y Argi manchaed células positivas en cortes de tejidos de serie de 6 ratones a los 3 puntos, en 3 secciones por ratón con contar los trabajos realizados por dos individuos cegados a la condición experimental. Estos resultados demuestran que las inyecciones intraperitoneales de liposomas clodronato agotan los macrófagos de colon en ratones. Derivación de los macrófagos de médula ósea en presencia de diferentes factores de crecimiento rendimientos macrófagos que son clásicamente activados (MCSF derivado o derivados-MCSF y se trató con IFN) o alternativamente activado (GM-CSF o IL-3-derivado o derivados y MCSF tratadas con IL-4). Lavado de médula ósea de 2 fémur y la tibia 2 de un ratón 8 semanas de edad típicamente rinde 6 x 10 7 células nucleadas por ratón y de los rendimientos 8 x 10 6 MCSF derivados de macrófagos, 10 x 10 6-GM-CSF derivados macrófagos, o 12 x 10 6 IL-3-macrófagos derivados. Figura 2A muestra el nitrito y la relación IL-12p70/IL-10 en macrófagos supernatants tratados con lipopolisacárido durante 24 horas la Figura 2B muestra un análisis típico de transferencia Western de 0,5 x 10 6 macrófagos de MCSF + / -. IL-4 condiciones derivación probaron con anticuerpos para marcadores de macrófagos activados alternativamente, Argi, YM1, o con GAPDH como un control de carga. Estos datos demuestran que derivados de médula ósea macrófagos pueden estar sesgadas a un fenotipo polarizado durante la derivación. La transferencia efectiva de ex vivo derivadas macrófagos polarizados a un tejido depende de la vía de administración y el acceso al tejido. Durante DSS-colitis inducida, macrófagos inyecta por vía intravenosa viajar al sitio de la inflamación y macrófagos activados alternativamente reducir la severidad de la enfermedad. Figura 3A muestra el número total de los macrófagos y el número de macrófagos Argi + (alternativamente activado) contados en secciones histológicas de ratones inyectados con polarizado médula óseaDerivados de macrófagos. El impacto de la transferencia de los macrófagos polarizados a los dos puntos en la colitis inducida por DSS-se muestra el índice de actividad de la enfermedad, una puntuación de aditivo basada en la pérdida de peso, sangrado rectal, heces y consistencia disminuyó (Figura 3B). Estos resultados demuestran que ex vivo deriva, los macrófagos pueden adoptiva transferidos tráfico hacia el colon y la inflamación inducida por el impacto. Macrófagos M1 no afectan a la inflamación, mientras que los macrófagos M2 reducir significativamente índice de actividad de la enfermedad. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Clodronato liposomas que contienen efectivamente agotan F4/80 + y + F480 Argi + en las células de ratón en dos puntos in vivo. Una generación F2 de ratones de tipo salvaje en una mezcla de C57BL / 6 x fondo 129Sv recibieron DSS 5% durante 7 días y de propiedad intelectual inyectado con PBS (control) o liposomas que contienen clodronato (clodronato) 4 días antes de la DSS del tratamientoy en los días 0, 2, 4 y 6 durante el tratamiento DSS. (A) Los dos puntos fueron retirados, fijo, y las secciones fueron teñidas por inmunohistoquímica para macrófagos maduros (F4/80) y el marcador de macrófagos M2, Argi. (B) Cuantificación de F4/80 + y macrófagos ARGI +. Células teñidas positivamente fueron contados por dos individuos ciegos a la condición experimental de ampliación × 40 en 6 campos de 3 secciones y de ratón y de 6 ratones por grupo. * P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. MCSF derivados de macrófagos expresan un fenotipo clásicamente activado y MCSF derivados de macrófagos tratados con IL-4 expresar un fenotipo de macrófagos activados alternativamente. (A) De acuerdo con un fenotipo clásicamente activado, MCSF derivados de los macrófagos producen mayores niveles de óxido nítrico en respuesta a lipopolisacárido y se puede medir por el ensayo de Griess, que detecta su metabolito intermedio, el nitrito. Se also producir una mayor proporción IL-12p70/IL-10, que puede ser medida por ELISA. * P &lt;0,01 para n = 3. (B) De acuerdo con un fenotipo alternativamente activado, MCSF derivados de macrófagos tratados con IL-4 YM1 expresan constitutivamente y Argi, que puede ser detectada por inmunotransferencia Western. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Inyectado por vía intravenosa, ex vivo derivado de los macrófagos activados alternativamente, el tráfico en el colon y reducir la inflamación intestinal. Una generación F2 de ratones de tipo salvaje en una mezcla de C57BL / 6 x 129Sv de fondo se les dio 5% del DSS en el agua de bebida durante seis días. Macrófagos M1 y M2 fueron inyectados IV en los días 0 y 4 durante el tratamiento con DSS. (A) Los dos puntos fueron retirados, fijo, y las secciones fueron teñidas por inmunohistoquímica para macrófagos maduros (F4/80) y un marcador de macrófagos M2 (Argi).La cuantificación de los macrófagos de los ratones de control de PBS inyectado (C), los ratones inyectados con los macrófagos M1 (+ M1) y los ratones inyectados con los macrófagos M2 (M2 +) fueron realizados por el recuento de células con tinción positiva con un aumento de × 40 en 6 campos de 3 secciones / ratón y de 6 ratones / grupo. Conteo se llevó a cabo por dos individuos cegados a la condición experimental. (B) Actividad de la enfermedad se controló y anotó todos los días durante el tratamiento y es una puntuación aditivo basada en la pérdida de peso, sangrado rectal, heces y la consistencia disminuye. * P &lt;0,05 para n = 6 ratones en 2 experimentos independientes.

<ol><li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+dendritic+cells%2C+macrophages%2C+and+epithelial+cells+in+the+gut%3A+implications+for+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).</li>
<li>Heinsbroek, S. E., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in inflammatory bowel diseases.</a> Expert Rev. Mol. Med. 11, e14(2009).</li>
<li>Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+putative+role+of+inflammation+in+the+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome.</a> Gut. 49, 743-745 (2001).</li>
<li>Maeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer-derived+factors+activate+NF-kappaB+in+myeloid+cells+via+TLR2+to+link+inflammation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med.+Report%22%5BJournal%5D)">Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis.</a> Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).</li>
<li>van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes%3A+perspectives+in+research+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics.</a> J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).</li>
<li>Hunter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-derived+alternatively+activated+macrophages+reduce+colonic+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice.</a> Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).</li>
<li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP-deficient%2C+alternatively+activated+macrophages+protect+mice+during+DSS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis.</a> J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).</li>
<li>Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+colitis+by+intestinal+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).</li>
<li>Van Rooijen, N., Sanders, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+mediated+depletion+of+macrophages%3A+mechanism+of+action%2C+preparation+of+liposomes+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications.</a> J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).</li>
<li>Smith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+a+helminth+parasite+prevents+experimental+colitis+via+a+macrophage-mediated+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism.</a> J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).</li>
<li>van Rooijen, N., Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+for+specific+depletion+of+macrophages+from+organs+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).</li>
<li>Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+vitreal+macrophages+and+circulating+leukocytes+in+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).</li>
<li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages+by+IL-4+requires+SHIP+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation.</a> Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).</li>
<li>Cailhier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+demonstrates+that+resident+macrophages+initiate+acute+peritoneal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation.</a> J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los macrófagos son células fagocíticas que juegan un papel importante en el sistema inmunológico. Ellos son los responsables de iniciar la respuesta inmune innata y la dirección de la respuesta inmune adquirida. Típicamente, los macrófagos activados clásicamente son activados por IFN o LPS y son responsables de la eliminación de patógenos y montaje de una respuesta inflamatoria 1. A la inversa, los macrófagos activados alternativamente se activan por la IL-4 o IL-13 y jugar un papel en los desechos de barrido...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Que contienen clodronato-liposomas </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS que contienen liposomas </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS estéril pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monotioglicerol (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> RECOMBnante murino MCSF </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> Recombinante GM-CSF murino </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Recombinante IL-3 murina </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Recombinante murino IFN </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Recombinante de IL-4 murino </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Disociación celular buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Rata anti-F4/80 anticuerpos </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Mouse anti-anticuerpos Argi </td><td> BD Transduction Laboratories </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos utilizados en este protocolo.

el agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Los macrófagos son participantes cruciales en la respuesta inmune innata a cualquier reto infeccioso o lesión, iniciando la respuesta inmune innata y la dirección de la respuesta inmune adquirida. La disfunción de macrófagos puede conducir a la incapacidad de montar una respuesta inmune adecuada y, como tal, ha sido implicado en muchos procesos patológicos, incluyendo las enfermedades inflamatorias del intestino. Los macrófagos muestran fenotipos polarizadas que se dividen en dos categorías. Macrófagos activados Clásicamente, activada por la estimulación con LPS o IFN, desempeñan un papel esencial en la respuesta a la exposición a las bacterias, mientras que los macrófagos activados alternativamente, activada por IL-4 o IL-13, participar en los residuos de barrido y la remodelación tisular y han sido implicados en la resolución fase de la inflamación. Durante una respuesta inflamatoria in vivo, los macrófagos se encuentran en medio de una mezcla compleja de la infiltración de células inmunes y puede participar por exacerbar o resolvinag inflamación. Para definir la función de los macrófagos in situ en un modelo animal completo, es necesario examinar el efecto de agotamiento de los macrófagos del entorno complejo. Para hacer preguntas sobre el papel de fenotipo de macrófagos in situ, fenotípicamente definidos los macrófagos polarizados se pueden derivar ex vivo, a partir de aspirados de médula ósea y se añade de nuevo a los ratones, con o sin el agotamiento previo de los macrófagos. En el protocolo presentado aquí clodronato liposomas que contienen, en comparación con los controles de PBS inyectados, se utilizaron para agotar los macrófagos colon durante dextrano sulfato de sodio (DSS)-colitis inducida en ratones. Además, los macrófagos polarizados se obtuvieron ex vivo y se transfiere a los ratones por inyección intravenosa. Una advertencia de este enfoque es que los liposomas que contienen clodronato agotan todos los fagocitos profesionales, incluyendo tanto las células dendríticas y los macrófagos para asegurar el efecto observado por el agotamiento de los macrófagos es específica, la reconstitución ofenotipo f por transferencia adoptiva de los macrófagos es necesario. Agotamiento macrófagos sistémica en ratones también se puede lograr por retrocruzamiento ratones sobre un fondo CD11b-DTR, que es un enfoque complementario excelente. La ventaja de clodronato contiene mediada por liposomas agotamiento es que no requiere el tiempo y los gastos implicados en ratones retrocruzamiento y que puede ser utilizado en ratones con independencia del fondo de los ratones (C57BL / 6, BALB / c, o fondo mixto ).

Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los macrófagos<em&gt; En vivo</em&gt;, Que derivan de los macrófagos polarizados aspirados de médula ósea, y la transferencia adoptiva macrófagos en ratones. Estas técnicas permiten determinar el papel que los macrófagos polarizados desempeñan en la salud y la enfermedad.

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Los macrófagos son elementos fundamentales en la respuesta inmunitaria innata ante un desafío infeccioso o una lesión, iniciando la respuesta inmunitaria innata y dirigiendo...

El objetivo del siguiente experimento es determinar el papel de los macrófagos polarizados en un proceso biológico in vivo. Esto se logra primero agotando los macrófagos de ratones. A continuación, se generan nuevos macrófagos, que expresan características únicas y tienen funciones distintas.Luego, los macrófagos polarizados se transfieren adoptivamente a ratones para determinar su papel en el proceso biológico de interés. Finalmente, se pueden medir las diferencias en la inflamación mediada por macrófagos según la enfermedad clínica e histológica. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como cruzar ratones en un fondo CD 11 BDTR, es que este método es más rápido que criar ratones.Para experimentos. Es relativamente fácil y rentable, y puede realizarse con ratones de cualquier fondo genético. Aunque este método puede proporcionar información sobre el papel de los macrófagos en el intestino, también puede aplicarse a una variedad de otros órganos, incluyendo hígado, bazo y pulmón.Dos horas antes de la inyección, retire los tubos de liposomas y PBS del almacenamiento a cuatro grados Celsius. Cuando los liposomas hayan alcanzado la temperatura ambiente, invie

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

El artículo describe una adaptación fácil...

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Describimos aquí un protocolo sencillo para aislar macrófagos peritoneales murinos. A este procedimiento le sigue la extracción de ARN para llevar a cabo el análisis de la expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo Toll.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El protocolo utiliza la criopreservación de monocitos junto con su diferenciación masiva en macrófagos. Luego, los macrófagos cosechados se pueden sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

Se presentan métodos para evaluar la capacidad fagocitaria de primarias macrófagos derivados de médula ósea murinas utilizando la ruina del myelin fluorescencia etiquetada y tinción de gota de lípidos intracelulares.

In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

Nos ilustran un método directo para derivar macrófagos murinos primarios de células de médula ósea y conjuga un método sencillo para preparar ácidos grasos BSA. Entonces demostramos que ácidos grasos saturados puede inducir la muerte celular de macrófago, y tal muerte celular está positivamente asociada con la acumulación celular de los niveles de ceramida.

Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Este estudio demuestra el uso de citometría de flujo para detectar la producción de (ROS) las especies reactivas de oxígeno resultante de la activación de la FcγR. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios en el antimicrobiano y función de los fagocitos en respuesta a complejos inmunes, microorganismos opsonizadas o FcγR directa Cross-linking de señalización redox.

Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Los monocitos y macrófagos son células inmunitarias muy plásticas y reprogramables cruciales para la salud y la enfermedad. Perciben y responden a una amplia gama de estímulos mediante la adopción de programas de diferenciación y fenotipos específicos. Hemos estandarizado un modelo in vitro para estudiar la polarización y reprogramación de los macrófagos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación.

Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

Aprende a depletar y reconstituir macrófagos polarizados en ratones mediante transferencia adoptiva. Este protocolo permite estudiar su función en la inflamación y enfermedades de manera más rápida que los métodos tradicionales de cría.

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

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