Toma de muestras de saliva humana Peptidome indígenas que utilizan una sonda de ultrafiltración Lollipop-térmica: Simplificar y mejorar la detección de péptidos de Espectrometría de Masas clínica

Este estudio del peptido de la saliva utiliza una sonda de ultrafiltración similar a un paleta seguida de un análisis directo por espectrometría de masas nano LC LT Q. En primer lugar, ensamble la sonda LLUF utilizando una membrana de poliéter de celulosa y un tubo de etileno propileno. A continuación, recolecte muestras de saliva de voluntarios y procéselas a través de la sonda LLUF para obtener la muestra de saliva.

Luego, proceda directamente a la espectrometría de masas nano L-C-L-T-Q y analice los datos de muestras de saliva con y sin tratamiento con la sonda de ultrafiltración LLUF. En última instancia, el peptídico salival puede obtenerse analizando los datos de L-C-M-S-S y comparando los péptidos identificados entre las dos muestras. Este enfoque, que utiliza una sonda de ultrafiltración tipo piruleta acoplada a un análisis directo por espectrometría de masas nano LC-LTQ, ofrece ventajas clave frente a otros métodos, como la digestión de las proteínas de la saliva en péptidos.

Tras el análisis por espectrometría de masas, el LUF PRO simplifica y purifica la saliva y también mejora la dictación por MS de péptidos en la saliva completa para aplicaciones clínicas. Utilice pegamento epoxi para sellar las membranas de teléfono celular de poliéter en los bordes de las paletas triangulares de polipropileno. Luego, fije un tubo de politetrafluoroetileno fluorado (FEP) a la salida cilíndrica de un triángulo.

Sterilice las sondas con un hisopo de polipropileno y alcohol al 70 % durante la noche para evaluar el sellado adecuado; sumerja las sondas LLUF en una solución de dextrano azul a 50 miligramos por mililitro durante dos horas. Confirme la ausencia de dextrano azul en las muestras recogidas.

Reclute voluntarios sanos de entre 20 y 40 años de edad. Después de un enjuague bucal con agua, pida al sujeto que escupa muestras de saliva completa en un recipiente enfriado con hielo. Combine todas las muestras y almacénelas sobre hielo.

Inmediatamente después de la recolección, proceda a una habitación a cuatro grados Celsius con 200 microlitros de saliva para la toma de muestras con sondas LLUF. Sumerja ahora la membrana de poliéter de teléfono celular en saliva humana en una placa de cultivo. Genere presión negativa retirando un émbolo para simular un proceso de ultrafiltración para la toma de muestras a partir de la saliva.

A continuación, determine las concentraciones de proteína. Prepare una microgramo por microlitro de las muestras de proteína salival para el análisis por espectrometría de masas con cromatografía líquida nano. Para el análisis de las muestras, utilizamos una cromatografía líquida nano exigente acoplada en línea a un espectrómetro de masas Finnegan LTQ. Cargue primero cinco microlitros de las muestras de saliva no digeridas en la columna de atrapamiento del sistema de cromatografía líquida nano mediante el muestreador automático.

Después de un paso de lavado, cambie la válvula y aplique un gradiente lineal de cero al 50 % del tampón B hacia el cartucho y la columna de separación C 18. Utilizando el modo dependiente de datos de Excalibur, recolecte espectros ms ms de los cuatro iones MS más intensos por encima de una intensidad de uno por 10 a la cuarta. Para cada muestra, realice corridas duplicadas de tres preparaciones separadas diferentes.

Luego importe el archivo de datos al sistema Sequester Sorcerer 2, seleccione buscar en una base de datos de proteínas humanas apropiada de NCBI utilizando especificidad no enzimática. Después de la búsqueda con Sequester, los resultados se filtran, validan y muestran automáticamente en Peptide Prophet y Protein Prophet basándose en los resultados de Sequester. Peptide Prophet estima una probabilidad integral, denominada puntuación P, de que la asignación de un péptido sea correcta frente a incorrecta, e identifica además información adicional sobre cada secuencia de péptidos.

El perfil de proteínas calcula una puntuación de probabilidad de cero a uno para cada proteína en función de los péptidos asignados a los espectros de Ms.Ms. Esta sección determina la capacidad de las sondas LLUF para eliminar bacterias orales mediante cultivo para la detección bacteriana, tomando muestras de saliva antes y después de la recolección con la sonda LLUF en placas de agar para una prueba de bacterias aeróbicas. Utilice placas de agar LB sin antibióticos a 37 grados Celsius durante un día y, para bacterias anaeróbicas, use paquete de gas para el cultivo.

La muestra en caldo bru se incuba en placas con agitador bajo condiciones anaeróbicas a 37 grados Celsius durante un día. La fabricación de dispositivos de ultrafiltración tipo piruleta facilita la toma de muestras de saliva en un entorno oral imitado. En este sistema, una membrana de celulosa cargada negativamente con un límite de peso molecular de 30 kilodalton se pega a una paleta de polipropileno y se coloca frente a la sonda LLUF para filtrar las proteínas más grandes presentes en la saliva.

Con el fin de imitar el entorno oral humano, una esponja se impregna de saliva utilizando una jeringa. La saliva se filtra y se recoge a través del tubo conectado. La comparación de los cromatogramas de CL de saliva antes y después del muestreo con LLUF permitió la identificación de péptidos salivales indígenas mediante espectrometría de masas nano LC-LTQ.

Dado que estos cromatogramas diferenciales se obtienen sin digestión química o enzimática, simplifican la preparación de muestras para fines clínicos. En esta muestra, tras la elucidación mediante LLUF de las diferentes composiciones proteicas, se identificaron 131 péptidos en saliva no digerida.

Estos péptidos son fragmentos derivados de diversas proteínas ricas en prolina. Actina, alfa amilasa, alfa globina, beta globina, his sostenido uno, queratina, una mucina siete, receptor de inmunoglobulina polimérica, serina y S 100. A 9 26 péptidos únicos identificados en la saliva tras la filtración con sondas LLUF son fragmentos principalmente derivados de diversas proteínas ricas en prolina.

Este péptido derivado de la alfa amilasa fue detectado exclusivamente en una muestra de saliva sin recogida con sondas LLUF, lo que ilustra la capacidad de las sondas LLUF para eliminar proteínas grandes. Más intrigantemente, tras la eliminación de las proteínas más grandes, varios péptidos de secuencia fueron detectables en la saliva muestreada con sondas LLUF, notablemente se identificaron péptidos con extremos C ricos en prolina en las muestras tras la filtración ultrasónica con sondas LLUF. Ahora debería tener una buena comprensión de cómo utilizar A-L-L-L-L-U-F PRO para saliva simple en masa.

Un mejor análisis es muy importante para recopilar y manejar saliva de forma sencilla bajo condiciones consistentes. Una vez dominada, creo que esta técnica puede realizarse adecuadamente en menos de tres horas. Este enfoque, que utiliza una sonda de ultrafiltración similar a un chupete acoplada a un análisis directo mediante espectrometría de masas en cadena L-C-L-T-Q-M-S en modo nano, facilita aplicaciones clínicas para biomarcadores en el diagnóstico de enfermedades humanas.