La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Esta técnica estándar produce cubreobjetos recubiertos con gelatina marcada con fluorescencia que son adecuados para ensayos cuantitativos de degradación de la matriz por invadopodios. Después de recubrir los cubreobjetos con gelatina marcada fluorescentemente, siembre las células y cultívelas para evaluar la degradación de la matriz. A continuación, fije las células y tiña fluorescentemente las proteínas marcadoras de invadopodios, adquiera las imágenes y cuantifique la degradación de la matriz.

Los resultados típicos pueden cuantificar las diferencias en la degradación de la matriz mediada por invadopodios entre células con manipulación diferencial de genes seleccionados o tratamiento con agentes farmacológicos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación de cubreobjetos recubiertos con gelatina y fluorescencia homogénea es difícil de lograr debido a un recubrimiento desigual de gelatina fluorescente o un manejo inadecuado de los cubreobjetos recubiertos con gelatina. El procedimiento será demostrado por la profesora asistente de investigación Karen Martin, el asociado posdoctoral Mandy Ammer y los estudiantes de posgrado Elise Walk, Karen Hayes y Steve Markwell.

Para preparar la solución stock de sacarosa y gelatina al 5 % no marcada, mezcle la gelatina y el sacarosa en PBS y disuélvalos completamente a 37 grados Celsius. Luego, almacénela a cuatro grados Celsius. A continuación, proceda a limpiar las laminillas de vidrio.

Distribuya un portaobjetos individual en cada pocillo de una placa de cultivo celular de plástico de 24 pocillos, agregando 500 microlitros de ácido nítrico al 20% en cada pocillo e incube durante 30 minutos. Después de retirar la solución de ácido nítrico, lave los portaobjetos tres veces con agua desionizada. A continuación, recubra.

Cada cubreobjetos con 500 microlitros de 50 microgramos por mililitro de poliol, lisina, e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución de polilisina y lave tres veces con PBS. El recubrimiento de polilisina facilita un recubrimiento uniforme y la unión del gelatina marcada sobrepuesta. Coloque las placas de 24 pocillos sobre hielo y añada 500 microlitros de glutaraldehído al 0,5% recién preparado a cada uno.

Incubar bien las placas en hielo durante 15 minutos. Realizar tres lavados con PBS frío y luego aspirar todos los restos de PBS antes del recubrimiento con gelatina. Mientras tanto, durante la incubación con glutaraldehído, reconstituir la gelatina conjugada con Oregon Green 488.

Según el protocolo del fabricante, caliente la solución stock de gelatina al 5 % en sacarosa y la solución etiquetada a 37 grados Celsius. Luego, diluya 500 microlitros de gelatina marcada en cuatro mililitros de gelatina no marcada. Aplique por pipeta 100 microlitros de la mezcla diluida de gelatina 488 sobre cada cubreobjetos.

Utilice suficiente gelatina para recubrir la laminilla sin necesidad de extenderla manualmente. Es importante mantener la mezcla diluida de gelatina 488 a 37 grados durante el procedimiento de recubrimiento para evitar la solidificación prematura. Además, a partir de este paso, mantenga las laminillas en la oscuridad tanto como sea posible para evitar el potencial blanqueo por luz.

Una vez que todas las laminillas estén recubiertas en una sola placa, incline la placa y elimine el exceso de gelatina de cada pocillo mediante aspiración al vacío. A continuación, incube las laminillas recubiertas a oscuras durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las laminillas tres veces con PBS, agregue 500 microlitros de borohidruro de sodio, hidruro de sodio, borohidruro de sodio.

El hidruro es efervescente y se observarán pequeñas burbujas sobre y alrededor de cada cubreobjetos; incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente para reducir e inactivar el glutaraldehído residual. Retire la solución de borohidruro de sodio mediante aspiración al vacío con un movimiento rápido y envolvente alrededor del exterior de cada pozo, teniendo cuidado de no recoger ningún cubreobjetos flotante que se haya desprendido del fondo de la placa de cultivo celular durante el tratamiento con borohidruro de sodio. Después de tres lavados con PBS, incube los cubreobjetos en etanol al 70 % durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Utilizando técnica estéril, transfiera la laminilla que contiene placas a una cabina de flujo laminar para cultivo de células B tipo dos y enjuague las laminillas tres veces con PBS estéril mediante una aguja estéril y pinzas. Transfiera cuidadosamente las laminillas a un pocillo vacío de una nueva placa de 24 pocillos para equilibrar. Las laminillas con el medio de cultivo para el tipo celular específico que se está utilizando.

Ahora siembre las células directamente sobre los cubreobjetos tras un tiempo de incubación adecuado. Procese las muestras para imágenes de inmunofluorescencia para montarlas. Coloque una gota de prolongado oro anti-desvanecimiento o un reactivo similar sobre un portaobjetos y posicione cuidadosamente el cubreobjetos invertido; luego adquiera las imágenes para su análisis.

Este análisis proporciona el área normalizada de degradación de la matriz en relación con el área de las células o el número de células. Es útil para analizar campos microscópicos completos donde hay múltiples células que han sido tratadas colectivamente con factores de crecimiento irna o agentes terapéuticos. Para este análisis, se recopilan imágenes a menor aumento, suficiente para recopilar eficientemente información sobre poblaciones de células.

Abra la imagen en ImageJ. Verifique la información de escala y seleccione las mediciones. Elija el área y limite a las opciones de umbral. Calcule el área de degradación utilizando la imagen de gelatina fluorescente; corrija la iluminación desigual a través de la gelatina restando el umbral de fondo, y ajuste la imagen para establecer los valores de intensidad de píxeles superior e inferior.

En las imágenes posteriores, utilice el botón de configuración en la ventana de umbral para establecer el mismo umbral en todas las imágenes como un medio objetivo para seleccionar el área de degradación. Utilice la función de análisis de partículas para medir el umbral en las áreas de degradación de la matriz.

Seleccione un tamaño de partícula mayor que cero para eliminar el ruido de la selección. Muestre los contornos para identificar las regiones de interés. Luego, active mostrar resultados y resumir para visualizar las mediciones si el dibujo ha delimitado específicamente todas las áreas de degradación.

Copie la medición del área total en una hoja de cálculo; si se seleccionaron otros objetos, como detritos, registre únicamente las áreas de las regiones de interés relevantes. A continuación, para calcular el área celular, abra el umbral de la imagen foid y la imagen teñida, y ajuste los valores de intensidad de píxeles superior e inferior de modo que los bordes de las células queden seleccionados en las imágenes posteriores. Utilice el botón «establecer» en la ventana de umbral para fijar el mismo umbral en todas las imágenes.

Como un medio objetivo para seleccionar el área celular. Utilice la función de análisis de partículas para medir el umbral del área de las células. Elija un tamaño de partícula mayor que cero para eliminar el ruido de la selección.

Mostrar contornos para identificar regiones de análisis, verificar los resultados de visualización y resumir para mostrar mediciones de área. No marque esta opción. Incluya huecos si hay espacios entre las células y un cúmulo.

Ahora elija. Copie los resultados del área para las regiones de interés relevantes en una hoja de cálculo y calcule el área de degradación de gelatina por área total de células. Un enfoque alternativo consiste en normalizar el área de degradación al número de células, determinado mediante el conteo de núcleos teñidos con DAP e.

Esto es importante si las manipulaciones alteran el área celular promedio. Para este enfoque, utilice el complemento contador de núcleos para contar automáticamente los núcleos. Ajuste las opciones para optimizar según sus imágenes. Si los núcleos se superponen ampliamente, el conteo automático puede no proporcionar una enumeración precisa en este caso.

El recuento manual puede facilitarse mediante el uso del complemento contador de células cuando se realiza adecuadamente. Las laminillas se recubren uniformemente con gelatina conjugada con Oregon Green 488. Pueden presentarse varios artefactos durante el recubrimiento y el procesamiento de las laminillas recubiertas con gelatina.

Por ejemplo, un recubrimiento irregular resulta de una cobertura inadecuada del cubreobjetos durante el proceso de recubrimiento debido a una mezcla deficiente, una distribución manual o una solidificación parcial de la mezcla de gelatina. Las rayaduras indican la eliminación de la matriz recubierta mediante rayado con agujas o pinzas durante el manejo. La desecación de la superficie del cubreobjetos durante períodos prolongados de almacenamiento puede dar lugar a una apariencia tipo adoquín. Esta área refleja el blanqueo fotográfico de la superficie fluorescente de gelatina durante la adquisición de imágenes debido a una exposición prolongada o intensa a la luz.

Observe cómo un portaobjetos bien preparado muestra una fluorescencia homogénea cuando se visualiza mediante microscopía. Las matrices delgadas resultantes producidas durante este procedimiento proporcionan un método sensible para evaluar la capacidad de las células de degradar la MEC. Por ejemplo.

Estas imágenes capturan la actividad de degradación de la matriz del podio invadido por una célula de cáncer de cabeza y cuello OSC 19. Aquí, las células se sembraron sobre un cubreobjetos de gelatina conjugada con Oregon Green 488 e imagenes mediante microscopía de fluorescencia, mostradas como imágenes 2D y 3D. Estas células OSC 19 sembradas sobre cubreobjetos de gelatina conjugada con Oregon Green 488 se marcaron con anticuerpos contra la fesina conjugada con R domina y contra la actina cortical, visualizados con el anticuerpo secundario ANOR 647 y coloreados artificialmente de verde para indicar la invasión.

Los podios son evidentes dentro de la imagen fusionada como concentraciones citoplasmáticas focales de actina F y cortactina que se superponen con áreas de volumen de clarificación de gelatina. La visualización muestra cómo los podios invadidos penetran en el subvolumen de ECMA, que fue creado para mostrar un borde en el interior de la célula donde están presentes los podios invadidos. La vista del borde dorsal demuestra los podios invadidos insertados en la gelatina subyacente.

La vista desde el borde ventral muestra protrusiones en los podios de Veda y áreas de degradación de gelatina debajo de la cubreobjetivo como regiones rojas presentes en la matriz verde. Estas imágenes muestran algunos de los pasos importantes para la cuantificación de la degradación de la matriz de gelatina normalizada en células dentro de una imagen microscópica completa. Todas las imágenes fluorescentes se han convertido a escala de grises para mostrar mejor el umbral rojo y las marcas de la región de interés.

Esta imagen de gelatina conjugada con Oregon Green 488 muestra las zonas oscuras donde ha ocurrido la degradación. Mediante umbralización, la imagen de gelatina resalta las áreas de degradación a partir de las cuales se seleccionan regiones de interés para medir la extensión de la degradación. Esta imagen muestra la ruminación, el fóide y la tinción de f actina según lo esperado.

El umbral en la imagen de actina resalta el área total de la célula a partir de la cual se seleccionan las áreas celulares que se van a medir. De manera similar, la técnica puede aplicarse para estudiar imágenes de núcleos celulares teñidos con DAPI. Este panel demuestra algunos pasos seleccionados involucrados en la cuantificación de la degradación fluorescente de gelatina por células individuales dentro de una población celular mixta.

Esta cuantificación sencilla corresponde a una única célula OSC 19 transfectada que sobreexpresa cortactina recombinante fusionada a la etiqueta del epítopo flag. Observe cómo la degradación de la matriz por células transfectadas también puede analizarse dentro de una población mixta de células transfectadas y no transfectadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar varias cosas.

Primero, asegúrese de que los marcadores fluorescentes de las células no se superpongan con el color de la gelatina fluorescente. Al recopilar imágenes, es importante elegir campos en función de la presencia de células. No busque preferentemente áreas de degradación, ya que esto podría sesgar los datos debido a la variabilidad entre líneas celulares y sus respuestas a diversos agentes terapéuticos.

Factores como el tiempo de degradación del recubrimiento de gelatina y la selección de proteínas para la marcación inmunofluorescente deben optimizarse según el experimento específico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar cubreobjetos recubiertos de manera uniforme con gelatina fluorescente para ensayos de degradación mediada por podios beta, así como de los métodos para la cuantificación de la degradación de la matriz.