ADN vectorial basado en el ARN de interferencia para estudiar la función génica en el cáncer

El objetivo general de este procedimiento es determinar la función génica mediante el uso de interferencia de ARN basada en vectores de ADN. Esto se logra primero diseñando y generando constructos de ARNhp que dirigen genes específicos. El segundo paso consiste en producir lentivirus que porten el casete de expresión de ARNhp.

Luego, se generan líneas celulares estables infectando las células con el lentivirus, y las células infectadas con el lentivirus se utilizan en diversos ensayos in vitro e in vivo para determinar los efectos del silenciamiento del gen de interés. En última instancia, dependiendo de los ensayos utilizados, los resultados pueden mostrar cambios en la genicidad tumoral de las células como resultado del silenciamiento génico mediante ensayos in vitro de proliferación, migración e invasión, así como modelos in vivo de formación de xenoinjertos. El procedimiento será demostrado por Daniel Stowell, ma Juan y Daniel, siendo este último un estudiante de posgrado en mi laboratorio; Ma Ma es técnico.

Chang es un becario posdoctoral. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, como si un gen específico tiene un papel en el desarrollo y la progresión del cáncer, y en qué aspectos de estos procesos podría ser importante. Para comenzar, diseñe y solicite los oligonucleótidos según los criterios descritos, Anil los dos oligos complementarios inversos que contienen la secuencia diana de 20 a 23 nucleótidos en el gen diana.

Formarán sitios eco R uno y Hindi tres en los dos extremos. Después de ser desnaturalizado, otro oligonucleótido contiene una secuencia complementaria inversa a la secuencia diana en su extremo tres prima. Hibrida al extremo tres prima del promotor H uno o U seis mediante un cebador ascendente.

Utilice una PCR para generar un fragmento que tenga sitios BAM H uno y Hindi tres en cada extremo. Mientras tanto, digiera el vector de lentivirus y el fragmento de PCR. Luego, lleve a cabo una reacción de ligación de tres fragmentos entre el vector, el fragmento de PCR y los oligonucleótidos Anil.

En una proporción molar de uno a 10 a 10, el vector resultante producirá el ARNh de interés con una secuencia Hindi tres en la región del bucle. Si se utiliza un vector inducible, la producción de ARNh dependerá de la presencia de una molécula inductora, como la doxiciclina para el sistema Tet encendido. Ahora transforme células competentes de E. coli DH cinco alfa altamente eficientes utilizando el producto ligado e identifique los vectores positivos mediante una prueba de PCR basada en colonias.

Amplifique un producto que abarque el sitio de ligación del vector y del promotor inducible. Prepare ADN plasmídico de las colonias positivas utilizando un kit comercial. Luego, confirme la presencia del inserto mediante digestión con BAM H uno y ECO R uno y mediante electroforesis en gel de agarosa de ADN.

Además, secuencie la región que contiene el promotor y S-H-R-N-A utilizando el nucleótido LIGA P cinco. Mediante un kit MIDI o maxi prep libre de endotoxinas, prepare el ADN del lentivirus que lleva el casete de expresión HRNA. Determine la concentración de ADN midiendo la absorción de luz a 260 nanómetros y asegúrese de la pureza del ADN verificando que la relación de absorción de luz entre 260 y 280 nanómetros esté entre 1,8 y 2,0.

Finalmente, ejecute el plásmido de lentivirus en un gel de agarosa para asegurarse de que esté en forma superenrollada. Antes de la transfección, prepárese para la transfección dejando caer lentamente 0,9 mililitros de la solución A en 0,9 mililitros de la solución B, mientras se burbujea aire a través de la solución B con una pipeta. Luego, incube la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, deje caer lentamente 0,6 mililitros de la mezcla sobre tres placas diferentes de 10 centímetros con células HEK 293T.

Luego, devuelva las células al incubador cuatro a seis horas después. Reemplace el medio con siete mililitros de medio DMEM completo. Después de 24 horas, agregue cinco mililitros más de medio, y después de otras 24 horas, recolecte el medio que contiene el lentivirus.

Centrifugar el medio recolectado a 1500 RPM a temperatura ambiente durante 10 minutos. Filtrar el sobrenadante utilizando un filtro de 0,45 micrómetros. Centrifugar el medio filtrado que contiene el lentivirus mediante ultracentrifugación.

Decante el sobrenadante a un recipiente de desecho que contenga lejía al 5%. Re_suspenda el pellet de lentivirus en medio mililitro a un mililitro de PBS 1X frío. Luego divida la solución de lentivirus en alícuotas de 50 a 100 microlitros para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius.

Finalmente, determine el título del lentivirus utilizando una técnica confiable. Típicamente, un plato de cultivo de 10 centímetros producirá entre 50 y 100 millones de unidades infecciosas antes de proceder con la infección celular. Determine la MOI del título del lentivirus utilizando un kit o R-T-P-C-R para este procedimiento.

Se recomienda una MOI inferior a cuatro. Comience sembrando las células que se van a infectar en una placa de seis pocillos hasta alcanzar una confluencia del 30 al 40 % y cultívelas durante la noche. El día siguiente.

Sustituya el medio por un mililitro de medio fresco que contenga poli-cerebro o protamina. Luego agregue entre uno y dos millones de UI de un lentivirus que contenga un marcador fluorescente o un marcador antibiótico.

Agite lentamente la placa durante 10 segundos para mezclar e incubar durante seis horas. Después de seis horas, sustituya el medio por medio completo normal y propague las células durante dos días. El medio no debe contener antibióticos ni inductores, independientemente del lentivirus utilizado, después de dos días.

Añada el antibiótico apropiado si el lentivirus contiene un marcador de resistencia a antibióticos. Asimismo, añada el inductor a la mitad de los cultivos si el lentivirus es inducible. Después de cultivar las células durante dos o tres días más con antibióticos e inductores, realice un análisis western blot para evaluar el silenciamiento del gen diana antes del trasplante de xenoinjertos con tripsina en ojos.

Las células procedentes de placas de cultivo celulares grandes y resuspéndalas en el medio original que contiene 50 % matrigel. Es esencial mantener las células cancerosas resuspendidas en 50 % matrigel y la jeringa sobre hielo. De lo contrario, existe el riesgo de que el matrigel se solidifique y la infección tenga que AB al respecto.

Prepare el sitio quirúrgico limpiándolo minuciosamente con etanol al 70 % y realice la anestesia con una ventilación excelente y un filtro capturador de isoflurano conectado a la cámara de inducción. Anestesie ratones desnudos tímicos utilizando isoflurano al 2 % mezclado con oxígeno al 1,5 % durante tres a cinco minutos antes de la inoculación celular. Luego, mantenga la anestesia mediante isoflurano al 2 % mezclado con oxígeno a través de un cono nasal.

Coloque el ratón sobre una almohadilla calefactora ajustada a 30 grados Celsius. Cargue las células en jeringas con agujas de calibre 25 y medio para inyecciones subcutáneas, o con agujas de calibre 28 a 30 para inyecciones ortotópicas. Cinco minutos después de la inducción de la anestesia en uno o dos sitios, inyecte de uno a diez millones de células en bolo de 200 microlitros.

El número de células depende de la malignidad o agresividad de las células cancerosas. Para vectores constitutivamente activos, utilice dos grupos de ratones inyectados con células que expresan ya sea el gen diana S-H-R-N-A o un S-H-R-N-A aleatorizado en vectores. Utilice los mismos dos grupos y divídalos cada uno en subgrupos que reciben o no el inductor en su agua.

Sustituya los documentos que contienen agua dos veces por semana. Monitoree el volumen de los tumores semanal o quincenalmente con una C. Asegúrese de que el volumen tumoral no exceda el límite institucional o del A CUC y eutanalice cualquier animal que presente ulceración extensa, necrosis, infección evidente, hemorragia incontrolada o enfermedad en estadio terminal. Para monitorear el crecimiento tumoral y la metástasis mediante un marcador bioluminiscente, desinfecte el área de trabajo y anestesie a los ratones en una cámara de imagen con anestesia gaseosa.

Primero, realice una exposición de dos a cinco minutos y verifique la intensidad de la señal, luego ajuste según corresponda. Si el tamaño del tumor supera los 1000 milímetros cúbicos o el límite institucional de tamaño, sacrifique al animal, documente el tamaño del tumor y conserve las muestras para análisis posteriores. Este protocolo se utilizó para estudiar los efectos del silenciamiento de Y uno en la formación de tumores xenoinjertados de células de adenocarcinoma mamario humano que expresan luciferasa, implantadas en ratones desnudos atímicos.

Se probaron la secuencia diana S-H-R-N-A del YY uno humano y un control S-H-R-N-A aleatorizado, que no presentaba similitud significativa con ningún transcrito humano conocido. Como resultado, se construyeron dos vectores lentivirales y se utilizaron para producir dos lentivirus. Ambos se usaron para infectar dos poblaciones celulares diferentes y se obtuvieron poblaciones celulares policlonales.

Después de la selección con puromicina. El análisis sanguíneo por Western confirmó el silenciamiento inducido por DS de YY1 en estas líneas celulares infectadas. A continuación, la población celular policlonal del clon tres que fue infectada con YY1 inducible S-H-R-N-A y la S-H-R-N-A de control.

Se utilizaron LENTIVIRUS para evaluar los efectos de la disminución de YY one sobre la invasión. Observamos que la reducción de YY one disminuyó la invasividad de las células. El análisis sanguíneo occidental confirmó que los documentos indujeron el silenciamiento de YY one en células con el indu YY one S-H-R-N-A, mientras que las células que contenían el control.

S-H-R-N-A no mostró este efecto. Estas células se utilizaron luego en un estudio con un modelo de ratón de xenoinjerto en comparación con los grupos control indu, YY uno. Los ratones con implantes de S-H-R-N-A tratados con agua que contenía dos mostraron una formación tumoral significativamente reducida cuando se visualizó mediante bioluminiscencia y cuando se midieron los pesos tumorales, tal como se esperaba. La silenciación de YY uno en estos tumores de xenoinjerto se confirmó fácilmente mediante inmunotransferencia (western blot).

Los estudios no deben olvidar que trabajar con lentivirus puede ser extremadamente peligroso según las consideraciones de seguridad del NIHB; para investigaciones con vectores lentivirales se requieren procedimientos de contención mejorados del nivel de seguridad biológica dos en todos los entornos de laboratorio.