Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

El objetivo general de este procedimiento es medir una topología de adhesión celular sobre un sustrato con precisión nanométrica. Esto se logra cultivando primero células en portaobjetos de vidrio transparente e incubándolas con un marcador fluorescente. A continuación, se calibra la posición angular del espejo ajustable del microscopio y la posición se almacena en el programa de posicionamiento del espejo.

El siguiente paso es registrar las imágenes de fluorescencia tras la irradiación en unos 10 ángulos diferentes. El paso final es calcular las distancias del sustrato celular con una precisión de unos pocos nanómetros. En última instancia, los resultados de la topología de la adhesión celular en el sustrato se utilizan para mostrar las diferencias de adhesión entre varias líneas celulares, por ejemplo, células cancerosas y células menos malignas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía confocal, es que la resolución real está en el rango de solo unos pocos nanómetros. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre las membranas celulares. También se puede aplicar a otros sistemas como pequeñas vesículas o nanomateriales.

La demostración del experimento estará a cargo de nuestra postdoc Petra, que preparará las muestras de células y nuestro ingeniero, Michael Wagner, que dirigirá el experimento Para preparar las células para ángulo variable, reflexión interna total. La microscopía de fluorescencia sembra células individuales a una densidad de 100 células por milímetro cuadrado en un portaobjetos de vidrio en medio de cultivo suplementado con un 10% de ternero fetal, suero y antibióticos. Cultive células durante 72 horas en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

A continuación, aplique a las células la membrana fluorescente, marcador seis D, decano dos, dimetilamino naftaleno o lorano a una concentración de ocho micromolares en cultivo, medio de incubación durante 60 minutos antes de la microscopía de fluorescencia. Lave las celdas con PBS, pipetee la solución tampón sobre el portaobjetos para eliminar el medio, luego limpie la solución tampón de la parte posterior del portaobjetos. Para el ángulo variable se utiliza un microscopio vertical, como un Zeiss Axio plan, equipado con una cámara E-M-C-C-D retroiluminada y/o exónica.

T-I-R-F-M reemplaza su condensador por un dispositivo de iluminación hecho a medida con un prisma de vidrio hemílico cilíndrico acoplado ópticamente a la corredera del objeto. El rayo láser incide desde una fibra monomodo intercalada, que después de obtener imágenes por el prisma de vidrio y otros componentes ópticos, nuevamente da como resultado un haz paralelo en la superficie de la muestra. Tenga cuidado de que el vector del campo eléctrico esté polarizado, perpendicular al plano de los incidentes.

Esta posición está marcada en el acoplador de salida de la fibra. Utilice un espejo ajustable ubicado dentro del condensador, que se visualiza en el plano de la muestra e ilumina la muestra bajo un ángulo variable de incidentes o rayos de objeto. El espejo ajustable puede ser accionado por un motor paso a paso, que se controla mediante software.

Cada posición corresponde a un ángulo bien definido de incidentes según lo determinado por las mediciones procedientes del sistema métrico avanzado. Para calibrar la posición angular del espejo ajustable, utilice un colorante fluorescente como un nucleótido de flavina milimolar, disuelto en agua. Para visualizar el ángulo crítico tras la variación del ángulo de incidentes, utilice el ángulo crítico de 61,3 grados para una transición de agua de vidrio como un valor fijo, la posición angular del espejo en la que el ángulo de incidentes es igual al ángulo crítico se almacena en el programa de posicionamiento del espejo.

Con el software de la cámara, configure los parámetros de la cámara E-M-C-C-D, incluida la ganancia de temperatura, el tiempo de grabación y la velocidad de cambio. Utilice aceite de inmersión para asegurar el contacto óptico de la muestra. Con un prisma de vidrio, seleccione una lente objetivo de aumento adecuado para las celdas y apertura numérica moderada.

Para visualizar el objeto en el microscopio, utilice un filtro de paso largo o de banda adecuado para la detección de fluorescencia. Registre imágenes de fluorescencia de muestras idénticas al variar el ángulo de iluminación. Los ángulos de los incidentes deben ser iguales o mayores que el ángulo crítico.

Con el ángulo crítico correspondiente a 64,5 grados para una interfaz de vidrio de celda, se recomienda un rango angular de 66 grados a 74 grados con pasos de 0,5 grados o un grado. Para comenzar el análisis de datos, utilice el programa de vista de laboratorio para leer las imágenes grabadas en varios ángulos, así como la configuración de la cámara, la longitud de onda de excitación y los índices de refracción. En el caso del vidrio, que es 1,52, y las celdas, que es 1,37, la configuración se importa para una evaluación adecuada de los datos.

Para cada conjunto de parámetros, la profundidad de penetración y el factor de transmisión se calculan automáticamente para el éxito del procedimiento. Es importante que las imágenes se registren cuidadosamente y se seleccionen para su análisis. Seleccione las imágenes utilizadas para la evaluación de las distancias del sustrato celular de acuerdo con la ecuación.

Para un marcador de membrana, se pueden excluir imágenes individuales dentro de una iluminación homogénea, como se muestra en este ejemplo. Calcule las imágenes de la topología del sustrato celular y seleccione un código de color apropiado para mostrarlo durante la evaluación. Los perfiles de píxeles individuales se pueden mostrar como se muestra en esta figura.

Estos perfiles pueden utilizarse como indicador de la calidad del ajuste. Por último, guarde el protocolo de evaluación. Esta figura muestra el total de imágenes de reflexión interna de células de glioblastoma U2 de 51 mg con un gen supresor de tumores TP 53 activado.

En la incubación con luan se registraron en varios ángulos de incidentes, 66 grados correspondientes a una profundidad de penetración del campo electromagnético evanescente de aproximadamente 140 nanómetros, 69 grados, correspondientes a una profundidad de penetración de 75 nanómetros y 73 grados correspondientes a una profundidad de penetración de 60 nanómetros con penetración decreciente. La fluorescencia de profundidad disminuye en intensidad y se origina en sitios más superficiales de las células, como los contactos focales en sus bordes. Las distancias del sustrato celular se representan en el Panel D mediante un código de color que va de cero a 600 nanómetros, como se ve aquí.

Las distancias del sustrato celular varían mucho a lo largo de las células, entre unos pocos nanómetros representados por blanco a amarillo y 250 a 300 nanómetros representados por rojo oscuro. Esto indica que hay contactos focales y distancias de sustrato celular más grandes en las proximidades. Se calcula una variación similar en las distancias del sustrato celular para las células de glioblastoma U2 de 51 mg con un gen supresor de tumores activado P 10.

Por el contrario, las distancias del sustrato celular son bastante constantes para las células de control U2 51 mg representadas por amarillo y las células de tipo salvaje representadas por naranja a rojo después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la topología del sustrato celular exploraran las células tumorales y los cambios morfológicos tras la terapia con láser. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar superficies con una resolución real en el rango nanométrico a baja exposición a la luz, lo cual es tolerable para los organismos vivos.