Name: Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a medir la nanotopología de adhesión celular mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de ángulo variable (VA-TIRFM). Este método permite comparar líneas celulares cancerosas y no cancerosas con precisión nanométrica.

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Los autores agradecen el Estado federado de Baden-Württemberg y la Europäische Union Europäischer-Fonds für die Entwicklung regionale - para la financiación ZAFH-PHOTON n, el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) para la financiación de la investigación subvención no. 1792C08, así como la GmbH Baden-Württemberg-Stiftung para la financiación del proyecto &quot;Aurami&quot;.

1. Siembra y la incubación de células <ol><li> Se siembran las células individuales, por ejemplo U373-MG o U-251-MG células de glioblastoma a una densidad típica de 100 células / mm 2 sobre un portaobjetos de vidrio y crecer para 4872 hr en medio de cultivo (por ejemplo, RPMI 1640 suplementado con 10% suero de ternera fetal y antibióticos), utilizando una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> Se incuban las células con un marcador de membrana, por ejemplo, 6-dodecanoil-2-dimetilamino naftaleno (laurdan) aplicada durante 60 min a una concentración de 8 M (en medio de cultivo) 4, o un marcador de citoplasma, por ejemplo calceína acetomethlyester aplicado durante 40 min a una concentración de 5 mM 3, o un fotosensibilizador asociado a la membrana, por ejemplo, la protoporfirina IX inducida tras la incubación de 4 horas con su precursor ácido 5-aminolevulínico (5-ALA; 1 mM) 4,5. </li><li> Lavar las células con medio de cultivo o tampón fosfato salino (PBS) antes de la microscopía de fluorescencia. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Usar un microscopio vertical, por ejemplo, Zeiss Axioplan, y sustituir su condensador por un dispositivo de iluminación, como se describe en la ref. 3 con un semiesférica o un prisma de vidrio hemi-cilíndrica acoplada ópticamente a la corredera objeto (véase la Figura 1). </li><li> Utilice un haz colimado láser paralelo que después de la impresión por el prisma de vidrio y otros componentes ópticos (por ejemplo espejo cóncavo) vuelve a producirse en un haz paralelo en la superficie de la muestra (rayo telecéntrico alumno). Tener cuidado de que el vector de campo eléctrico es polarizada perpendicular con el plano de incidencia. </li><li> Use un espejo ajustable situado en el interior del condensador que se forma la imagen en el plano de muestra y se ilumina la muestra bajo un ángulo variable de incidencia (rayos objeto). El espejo ajustable puede ser accionado por un motor paso a paso, donde cada posición corresponde a un ángulo bien definido de incidencia, tal como se determina por medidas goniométricas 3 </sup&gt;. </li><li> Calibrar la posición angular del espejo ajustable mediante el ángulo crítico Θ = 61,3 ° C para una transición vidrio-agua como un valor fijo. Θ c puede ser visualizado en la variación de Θ cuando un colorante fluorescente (por ejemplo, 1 mM mononucleótido de flavina, FMN) se disuelve en agua. La posición del espejo a Θ = Θ C se almacena en el programa de posicionamiento espejo. </li><li> Establezca los parámetros de la cámara (de nuevo iluminado Andor Ixon EMCCD, DV887DC, Andor Technology, Belfast, Reino Unido 6), incluyendo la temperatura, el aumento de tiempo de grabación y la velocidad de desplazamiento. </li><li> Utilice una lente de objetivo de ampliación adecuada y apertura numérica preferentemente moderada (por ejemplo 40 × / 0,75 o 63 × / 0,90 inmersión en agua) y localizar el portaobjetos en el microscopio. Usar aceite de inmersión para asegurar un contacto óptica de la muestra con el prisma de vidrio. Grabar imágenes de fluorescencia de muestras idénticas en la variación de laángulo de iluminación (Θ ≥ Θ Θ c con c correspondiente a 64,5 ° para una interfaz de celda de vidrio). Un intervalo angular de 66 ° -74 ° con pasos de 0,5 º o 1 se recomienda. Utilice un pase largo adecuado o filtro de paso de banda para la detección de fluorescencia. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Leer las imágenes (por ejemplo, en formato ASCII) registrados en varios ángulos Θ, así como los ajustes de la cámara (para la discriminación de fondo), la longitud de onda de excitación y los índices de refracción de vidrio (n 1 = 1,52) y células (n = 2 1,37) en el programa de evaluación (LabView; nanocélula). Para cada conjunto de parámetros de la profundidad de penetración d (Θ) y el factor de transmisión T (Θ) se calculan automáticamente. </li><li> Seleccione las imágenes utilizadas para la evaluación de las distancias de sustrato de células Δ acuerdo con la ecuación 5 (marcador de membrana) o la ecuación 4 (marcador citoplasma), las imágenes individuales con inhomogéneailuminación (e reveladora, rayas g.) pueden ser excluidos. </li><li> Cálculo de las imágenes de topología célula-sustrato y seleccione un código de color apropiado para la exhibición. Durante la evaluación de los perfiles de los píxeles individuales se puede mostrar, tal como se representa en la Figura 2. Estos perfiles pueden ser utilizados como un indicador de la calidad del ajuste. </li><li> Guarde el protocolo de evaluación. </li></ol> 4. Los resultados representativos Experimentos representativos se llevó a cabo con ingeniería genética células de glioblastoma U251-MG amablemente proporcionados por el Prof. Jan Mollenhauer, Departamento de Oncología Molecular de la Universidad del Sur de Dinamarca, Odense. En dos de estos subclones células U251 los genes supresores de tumores TP53 o PTEN están sobre-expresa con un Tet-On sistema de expresión inducible, de tal manera que estas células presentan un potencial oncogénico reducido y puede ser considerado como menos maligno. Altamente maligno U251-MG células sin gen supresor se usan como controles, y-U251MG células de tipo salvaje servir para una comparación más. Un diodo láser que emite una serie casi continua de impulsos de picosegundos (LDH400 con controlador PDL 800-B, Picoquant, Berlín, Alemania; longitud de onda: 391 nm; energía de pulso: 12 pJ; tasa de repetición: 40 MHz) se utiliza como una fuente de excitación. En la figura 3 imágenes TIRFM de U251-MG células de glioblastoma con un gen supresor de tumor activado TP53 y se incubaron con laurdan (8 micras; 60 min) se representan para ángulos de incidencia de 66,0 °, 69,0 ° y 73,0 ° correspondientes a profundidades de penetración de la campo electromagnético evanescente de alrededor de 140 nm, 75 nm y 60 nm, respectivamente. Con la disminución de la fluorescencia de profundidad de penetración disminuye en intensidad (véase escalas) y se origina en más sitios superficiales de las células (por ejemplo, contactos focales sobre sus bordes). Sustrato celular distancias (visualizado en la figura 3d por un código de color que va desde 0 hasta 600 nm) varían fuertemente en las células entre elly unos pocos nanómetros (blanco-amarillo) y 250-300 nm (rojo oscuro), es decir, los contactos focales y las grandes distancias sustrato de células se encuentran en las cercanías. Lo mismo vale para U251-MG células de glioblastoma con un gen supresor PTEN activado (Figura 4d), ​​mientras que el sustrato de células distancias son bastante constante para U251-MG de control y las células de tipo salvaje con los valores típicos de 80-100 nm (amarillo; Figura 4b ) y 150-200 nm (color naranja-rojo; Figura 4a). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Figura 1. Dispositivo de iluminación para VA-TIRFM en un microscopio vertical. Un espejo ajustable accionado por un motor paso a paso permite una resolución angular de ± 0,25 °. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Figura 2. Evaluación perfil para un pixel (esquemática). Cuando ln [I F / T (Θ)] se representa gráficamente como una función de 1 / d (Θ), la pendiente representa la distancia Δ célula-sustrato. Esta pendiente se determina comúnmente con una precisión de aproximadamente ± 10%. Uno de los valores - como resultado de la iluminación no homogénea - ha estado marcada y excluidos de la evaluación. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Figura 3 imágenes TIRFM de U251-MG células de glioblastoma con activado gen supresor TP53 tras la incubación con laurdan (8 micras; 60 min). Grabado en varios ángulos de iluminación (CA); sustrato celular distancias en el intervalo de 0-600 nm mostrado por un código de color (d); longitud de onda de excitación: 391 nm, la detección: ≥ 420 nm, el tamaño de la imagen: 210 m. × 210 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . Figura 4-sustrato celular distancias de U251-MG células glioblatoma en el intervalo de 0-600 nm mostradas por un código de color;. (A) de tipo salvaje (b) los controles; (c) las células con el gen supresor TP53 activado; (d) células con PTEN activado gen supresor de longitud de onda; excitación: 391 nm, la detección: ≥ 420 nm, el tamaño de la imagen: 210 m. × 210 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se describe un método para la medición de distancias en el sustrato de células con una precisión nanométrica. En la actualidad, los métodos de microscopia de super-resolución, por ejemplo, sobre la base de iluminación estructurada 7 o en un solo 8-10 moléculas de detección, así como el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía 11 son de considerable interés. Ninguna de estas técnicas, sin embargo, permite una resolución axial por debajo de 50 nm. Además, la irradia...

Cuando un haz de luz que se propaga a través de un medio de índice de refracción n 1 cumple una interfaz a un segundo medio de índice de refracción n 2 &lt;n 1, la reflexión interna total se produce en todos los ángulos de incidencia Θ, que son mayores que el ángulo crítico c = Θ arcsen (n 2 / n 1). A pesar de estar totalmente reflejada del haz de luz incidente evoca un campo electromagnético evanescente que penetra en el segundo medio y decae exponencialmente con la distancia perpendicular z desde la interfaz de acuerdo a I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) corresponde a la intensidad del campo electromagnético y d (Θ) a la profundidad de penetración en la longitud de onda λ, como se da d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sen 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Como se informó en la literatura 1,2, I 0 </sub&gt; corresponde a la intensidad de luz incidente I e multiplica por el factor de transmisión T (Θ) y la relación n 2 / n 1. Si el vector de campo eléctrico de este haz de luz es polarizada perpendicular al plano de incidencia (es decir, el plano generado por el incidente y el rayo reflejado), este factor de transmisión está dada por T (Θ) = 4 cos Θ 2 / [1 - (2 n / nL 1) 2] Por la intensidad de fluorescencia detectada en mediciones TIRFM, absorción de la luz tiene que ser integrado en todas las capas de la muestra y multiplicado con el rendimiento cuántico de fluorescencia del colorante η pertinente, así como con el ángulo sólido de detección Ω. Como se informó previamente 3, esta intensidad puede ser descrito por I F (Θ) = AT (Θ) OC (z) e-z / d (Θ) dz si todos los factores que son independientes f<html> rom el ángulo de incidencia Θ y la coordenada z se incluyen dentro de la ecuación experimental A. constante 3 se pueden resolver analíticamente, si la concentración de c (z) de los fluoróforos se considera que es casi constante - Bien en todas las coordenadas z ≥ Δ, por ejemplo, en el citoplasma de las células que tienen una distancia Δ de la interfaz. En este caso, la integral tiene que ser calculado de z = Δ para z = ∞ resulta en I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / d (Θ) - O entre z = Δ - t / 2 y z = Δ + t / 2, es decir, dentro de una capa fina de espesor t, por ejemplo, una membrana de célula que se encuentran a una distancia Δ de la interfaz. En este caso, la intensidad de fluorescencia puede ser calculada como I F = A c T (Θ) te-Δ / d (Θ), si t es pequeño en comparación con Δ. ent &quot;&gt; De las ecuaciones (4) y (5) las distancias sustrato de células-Δ se puede calcular, si las imágenes de la intensidad de fluorescencia I F se registran para ángulos variables Θ, y si ln (I F / T d) (Ec. 4) o ln (I F / T) (Ec. 5) se evalúa como una función de 1 / d para estos ángulos. Para la membrana marcador laurdan utiliza en este documento (s. a continuación) la evaluación se realizó de acuerdo a la ecuación. 5. Como se informó anteriormente 3, adquisición de imágenes y requiere una evaluación - Distribución homogénea de la luz de excitación sobre la muestra, - Validez de un modelo 2-capa (con los índices de refracción N 1 y N 2 para el sustrato y el citoplasma, respectivamente). Esto es, si la membrana plasmática es muy delgada, y si la capa del medio extracelular (entre la célula y el sustrato) es pequeño comparado con la longitud de onda de la luz incidente. Además, una apertura numérica moderada(Típicamente un 0,90 ≤) de la lente objetivo del microscopio es ventajoso para evitar desviaciones de brillo debido a la anisotropía de la radiación en el campo cerca de la interfaz dieléctrico.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Tipo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> Flujo laminar </td><td> Holten Safe </td><td> S2010 1.2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% de penicilina / estreptomicina </td><td> Biochrom </td><td></td><td> Cultivo medio </td></tr><tr><td> Diapositivas de vidrio objeto </td><td> Marienfeld </td><td> Vidrio blanco puro </td><td> Procedimiento de limpieza especial utilizado </td></tr><tr><td> 6-dodecanoil-2-dimetilamino naftaleno (laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Marcador fluorescente (solución madre: 2 mM en etanol) </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Láser diodo </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 con controlador PDL 800-B </td><td> Longitud de onda: 391 nm </td></tr><tr><td> Modo simple sistema de fibra </td><td> Punto de Origen </td><td> kineFlex </td><td> Se utiliza con la óptica de colimación </td></tr><tr><td> EMCCD cámara </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Cámara trasera iluminada </td></tr></tbody></table>

nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (va-tirfm)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Topología de la superficie, por ejemplo de células que crecen sobre un sustrato, se determina con una precisión nanométrica de ángulo variable total Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna (VA-TIRFM). Las células se cultivan en portaobjetos transparentes y se incubaron con un marcador fluorescente distribuido homogéneamente en su membrana plasmática. Iluminación se produce mediante un rayo láser paralelo bajo ángulos variables de reflexión interna total (TIR) ​​con diferentes profundidades de penetración del campo electromagnético evanescente. Grabación de imágenes de fluorescencia tras la irradiación en alrededor de 10 diferentes ángulos permite calcular distancias sustrato celular con una precisión de unos pocos nanómetros. Las diferencias de adhesión entre las distintas líneas celulares, por ejemplo células cancerosas y las células malignas, son menos así determinada. Además, los posibles cambios de la adhesión celular a un tratamiento químico o fotodinámica puede ser examinado. En comparación con otros métodos de super-resolución exposición microscopía de luz se mantienedaño muy pequeño, y no de las células vivas se espera que ocurra.

Topología de la adhesión celular sobre un sustrato se mide con una precisión nanométrica de ángulo variable total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM).

Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

La topología superficial, por ejemplo, de células que crecen sobre un sustrato, se determina con precisión nanométrica mediante la fluorescencia de reflexión interna total de ángulo variable...

El objetivo general de este procedimiento es medir una topología de adhesión celular sobre un sustrato con precisión nanométrica. Esto se logra primero cultivando células sobre portaobjetos de vidrio transparentes e incubándolas con un marcador fluorescente. Luego, se calibra la posición angular del espejo ajustable del microscopio y se almacena dicha posición en el programa de posicionamiento del espejo.El siguiente paso consiste en registrar las imágenes de fluorescencia tras la irradiación desde aproximadamente 10 ángulos diferentes. El paso final es calcular las distancias entre la célula y el sustrato con una precisión de unos pocos nanómetros. En última instancia, los resultados de la topología de la adhesión celular sobre el sustrato se utilizan para mostrar las diferencias de adhesión entre distintas líneas celulares, por ejemplo, células cancerosas y células menos malignas.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía confocal es que la resolución real está en el rango de solo unos pocos nanómetros. Aunque este método puede proporcionar información sobre las membranas celulares, también puede aplicarse a otros sistemas, como vesículas pequeñas o nanomateriales.La experimentación será demostrada por nuestra investigadora posdoctoral Petra, quien preparará las muestras celulares, y por nuestro ingeniero, Michael Wagner, quien realizará el experimento. Para preparar las células para la microscopía de reflexión interna total con ángulo variable, siembre células individuales a una densidad de 100 células por milímetro cuadrado sobre un portaobjetos en medio de cultivo suplementado con 10% de suero de ternero fetal y antibióticos. Incube las células durante 72 horas en un incubador a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.A continuación, aplique a las células el marcador fluorescente de membrana seis D, decano dos, dimetilamino naftaleno o lorano a una concentración de ocho micromolar en medio de cultivo, incube durante 60 minutos antes de la microscopía de fluorescencia. Lave las células con PBS, pipetee la solución tampón sobre la preparación para eliminar el medio, luego limpie la solución tampón del reverso de la preparación. Se utiliza un microscopio invertido, como un Zeiss Axio plan, equipado con una cámara E-M-C-C-D iluminada por detrás y/o con exon para ángulo variable.La microscopía T-I-R-F-M sustituye su condensador por un dispositivo de iluminación personalizado con un prisma de vidrio hemi-cilíndrico acoplado ópticamente a la portaobjetos. El haz láser incide desde una fibra monomodo colimada, que tras ser enfocada por el prisma de vidrio y otros componentes ópticos adicionales, vuelve a generar un haz paralelo en la superficie de la muestra. Tenga cuidado de que el vector del campo eléctrico esté polarizado perpendicularmente al plano de incidencia.Esta posición se marca en el acoplador de salida de la fibra. Utilice un espejo ajustable ubicado dentro del condensador, que se proyecta en el plano de la muestra e ilumina la muestra bajo un ángulo variable de incidencia o rayo del objeto. El espejo ajustable puede ser accionado por un motor paso a paso, que es controlado por software.Cada posición corresponde a un ángulo bien definido de incidencia, determinado mediante mediciones geométricas. Para calibrar la posición angular del espejo ajustable, utilice un colorante fluorescente como el nucleótido de flavina uno milimolar, disuelto en agua. Para visualizar el ángulo crítico al variar el ángulo de incidencia, use el ángulo crítico de 61,3 grados para una transición vidrio-agua como valor fijo; la posición angular del espejo en la que el ángulo de incidencia equivale al ángulo crítico se almacena en el programa de posicionamiento del espejo.Utilizando el software de la cámara, configure los parámetros de la cámara E-M-C-C-D, incluyendo la ganancia de temperatura, el tiempo de grabación y la velocidad de desplazamiento. Use aceite de inmersión para asegurar el contacto óptico de la muestra. Con un prisma de vidrio, seleccione un objetivo con el aumento adecuado para las células y una apertura numérica moderada.Para visualizar el objeto en el microscopio, utilice un filtro de paso largo o de paso de banda adecuado para la detección de fluorescencia. Registre imágenes de fluorescencia de muestras idénticas variando el ángulo de iluminación. Los ángulos de incidencia deben ser iguales o mayores que el ángulo crítico.Con el ángulo crítico correspondiente a 64,5 grados para una interfaz vidrio-célula, se recomienda un rango angular de 66 a 74 grados con incrementos de 0,5 o un grado. Para comenzar el análisis de datos, utilice el programa LabVIEW para leer las imágenes registradas a distintos ángulos, así como la configuración de la cámara, la longitud de onda de excitación y los índices de refracción. Para el vidrio, cuyo valor es 1,52, y para las células, cuyo valor es 1,37, se importan los parámetros para una evaluación adecuada de los datos.Para cada conjunto de parámetros, la profundidad de penetración y el factor de transmisión se calculan automáticamente. Para el éxito del procedimiento, es importante que las imágenes se registren y seleccionen cuidadosamente para el análisis. Seleccione las imágenes utilizadas para la evaluación de las distancias célula-sustrato de acuerdo con la ecuación.Para un marcador de membrana, pueden excluirse imágenes individuales dentro de una iluminación homogénea, como se muestra en este ejemplo. Calcule imágenes de la topología del sustrato celular y seleccione un código de colores adecuado para su visualización durante la evaluación. Los perfiles de píxeles individuales pueden mostrarse como se ilustra en esta figura.Estos perfiles pueden utilizarse como un indicador de la calidad del ajuste. Finalmente, almacene el protocolo de evaluación. Esta figura muestra imágenes de reflexión interna total de células de glioblastoma U2 51 mg con un gen supresor de tumores TP 53 activado.Tras la incubación con luan registrada a varios ángulos de incidencia, 66 grados corresponden a una profundidad de penetración del campo electromagnético evanescente de aproximadamente 140 nanómetros, 69 grados, correspondientes a una profundidad de penetración de 75 nanómetros, y 73 grados, correspondientes a una profundidad de penetración de 60 nanómetros, con una penetración decreciente. La profundidad de fluorescencia disminuye en intensidad y proviene de sitios más superficiales de las células, como los contactos focales en sus bordes. Las distancias entre la célula y el sustrato se representan en el Panel D mediante un código de colores que varía desde cero hasta 600 nanómetros, como se observa aquí.Las distancias entre la célula y el sustrato varían considerablemente a lo largo de las células, desde solo unos pocos nanómetros representados por colores blanco a amarillo hasta 250 a 300 nanómetros representados por rojo oscuro. Esto indica que los contactos focales y las mayores distancias entre la célula y el sustrato se encuentran en proximidad cercana. Se calcula una variación similar en las distancias entre la célula y el sustrato para células de glioblastoma U2 51 mg con un gen supresor tumoral P 10 activado.En contraste, las distancias entre células y sustrato son bastante constantes para las células control U2 51 mg representadas en amarillo y las células de tipo salvaje representadas en naranja a rojo tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la topología célula-sustrato exploraran las células tumorales y los cambios morfológicos tras la terapia con láser. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo visualizar superficies con una resolución real en el rango de nanómetros y con una exposición baja a la luz, lo cual es bien tolerado por los organismos vivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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