Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

El objetivo general de este procedimiento es medir una topología de adhesión celular sobre un sustrato con precisión nanométrica. Esto se logra primero cultivando células sobre portaobjetos de vidrio transparentes e incubándolas con un marcador fluorescente. Luego, se calibra la posición angular del espejo ajustable del microscopio y se almacena dicha posición en el programa de posicionamiento del espejo.

El siguiente paso consiste en registrar las imágenes de fluorescencia tras la irradiación desde aproximadamente 10 ángulos diferentes. El paso final es calcular las distancias entre la célula y el sustrato con una precisión de unos pocos nanómetros. En última instancia, los resultados de la topología de la adhesión celular sobre el sustrato se utilizan para mostrar las diferencias de adhesión entre distintas líneas celulares, por ejemplo, células cancerosas y células menos malignas.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía confocal es que la resolución real está en el rango de solo unos pocos nanómetros. Aunque este método puede proporcionar información sobre las membranas celulares, también puede aplicarse a otros sistemas, como vesículas pequeñas o nanomateriales.

La experimentación será demostrada por nuestra investigadora posdoctoral Petra, quien preparará las muestras celulares, y por nuestro ingeniero, Michael Wagner, quien realizará el experimento. Para preparar las células para la microscopía de reflexión interna total con ángulo variable, siembre células individuales a una densidad de 100 células por milímetro cuadrado sobre un portaobjetos en medio de cultivo suplementado con 10% de suero de ternero fetal y antibióticos. Incube las células durante 72 horas en un incubador a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

A continuación, aplique a las células el marcador fluorescente de membrana seis D, decano dos, dimetilamino naftaleno o lorano a una concentración de ocho micromolar en medio de cultivo, incube durante 60 minutos antes de la microscopía de fluorescencia. Lave las células con PBS, pipetee la solución tampón sobre la preparación para eliminar el medio, luego limpie la solución tampón del reverso de la preparación. Se utiliza un microscopio invertido, como un Zeiss Axio plan, equipado con una cámara E-M-C-C-D iluminada por detrás y/o con exon para ángulo variable.

La microscopía T-I-R-F-M sustituye su condensador por un dispositivo de iluminación personalizado con un prisma de vidrio hemi-cilíndrico acoplado ópticamente a la portaobjetos. El haz láser incide desde una fibra monomodo colimada, que tras ser enfocada por el prisma de vidrio y otros componentes ópticos adicionales, vuelve a generar un haz paralelo en la superficie de la muestra. Tenga cuidado de que el vector del campo eléctrico esté polarizado perpendicularmente al plano de incidencia.

Esta posición se marca en el acoplador de salida de la fibra. Utilice un espejo ajustable ubicado dentro del condensador, que se proyecta en el plano de la muestra e ilumina la muestra bajo un ángulo variable de incidencia o rayo del objeto. El espejo ajustable puede ser accionado por un motor paso a paso, que es controlado por software.

Cada posición corresponde a un ángulo bien definido de incidencia, determinado mediante mediciones geométricas. Para calibrar la posición angular del espejo ajustable, utilice un colorante fluorescente como el nucleótido de flavina uno milimolar, disuelto en agua. Para visualizar el ángulo crítico al variar el ángulo de incidencia, use el ángulo crítico de 61,3 grados para una transición vidrio-agua como valor fijo; la posición angular del espejo en la que el ángulo de incidencia equivale al ángulo crítico se almacena en el programa de posicionamiento del espejo.

Utilizando el software de la cámara, configure los parámetros de la cámara E-M-C-C-D, incluyendo la ganancia de temperatura, el tiempo de grabación y la velocidad de desplazamiento. Use aceite de inmersión para asegurar el contacto óptico de la muestra. Con un prisma de vidrio, seleccione un objetivo con el aumento adecuado para las células y una apertura numérica moderada.

Para visualizar el objeto en el microscopio, utilice un filtro de paso largo o de paso de banda adecuado para la detección de fluorescencia. Registre imágenes de fluorescencia de muestras idénticas variando el ángulo de iluminación. Los ángulos de incidencia deben ser iguales o mayores que el ángulo crítico.

Con el ángulo crítico correspondiente a 64,5 grados para una interfaz vidrio-célula, se recomienda un rango angular de 66 a 74 grados con incrementos de 0,5 o un grado. Para comenzar el análisis de datos, utilice el programa LabVIEW para leer las imágenes registradas a distintos ángulos, así como la configuración de la cámara, la longitud de onda de excitación y los índices de refracción. Para el vidrio, cuyo valor es 1,52, y para las células, cuyo valor es 1,37, se importan los parámetros para una evaluación adecuada de los datos.

Para cada conjunto de parámetros, la profundidad de penetración y el factor de transmisión se calculan automáticamente. Para el éxito del procedimiento, es importante que las imágenes se registren y seleccionen cuidadosamente para el análisis. Seleccione las imágenes utilizadas para la evaluación de las distancias célula-sustrato de acuerdo con la ecuación.

Para un marcador de membrana, pueden excluirse imágenes individuales dentro de una iluminación homogénea, como se muestra en este ejemplo. Calcule imágenes de la topología del sustrato celular y seleccione un código de colores adecuado para su visualización durante la evaluación. Los perfiles de píxeles individuales pueden mostrarse como se ilustra en esta figura.

Estos perfiles pueden utilizarse como un indicador de la calidad del ajuste. Finalmente, almacene el protocolo de evaluación. Esta figura muestra imágenes de reflexión interna total de células de glioblastoma U2 51 mg con un gen supresor de tumores TP 53 activado.

Tras la incubación con luan registrada a varios ángulos de incidencia, 66 grados corresponden a una profundidad de penetración del campo electromagnético evanescente de aproximadamente 140 nanómetros, 69 grados, correspondientes a una profundidad de penetración de 75 nanómetros, y 73 grados, correspondientes a una profundidad de penetración de 60 nanómetros, con una penetración decreciente. La profundidad de fluorescencia disminuye en intensidad y proviene de sitios más superficiales de las células, como los contactos focales en sus bordes. Las distancias entre la célula y el sustrato se representan en el Panel D mediante un código de colores que varía desde cero hasta 600 nanómetros, como se observa aquí.

Las distancias entre la célula y el sustrato varían considerablemente a lo largo de las células, desde solo unos pocos nanómetros representados por colores blanco a amarillo hasta 250 a 300 nanómetros representados por rojo oscuro. Esto indica que los contactos focales y las mayores distancias entre la célula y el sustrato se encuentran en proximidad cercana. Se calcula una variación similar en las distancias entre la célula y el sustrato para células de glioblastoma U2 51 mg con un gen supresor tumoral P 10 activado.

En contraste, las distancias entre células y sustrato son bastante constantes para las células control U2 51 mg representadas en amarillo y las células de tipo salvaje representadas en naranja a rojo tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la topología célula-sustrato exploraran las células tumorales y los cambios morfológicos tras la terapia con láser. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo visualizar superficies con una resolución real en el rango de nanómetros y con una exposición baja a la luz, lo cual es bien tolerado por los organismos vivos.