Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la expresión génica utilizando maquinarias nucleares funcionales extraídas de las células. Esto se logra primero cosechando en la hinchazón de las células hela. A continuación, las células se unen mediante el derribo y luego se centrifugan para granular los núcleos en el tercer paso.

Los núcleos se extraen, concentran y dializan con sal para obtener maquinarias de expresión génica solubles y funcionales. En última instancia, la funcionalidad de los extractos nucleares puede evaluarse en función de sus actividades de transcripción y empalme evaluadas con un sistema de ARN polimerasa acoplado a la transcripción y el empalme. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la preparación de extractos de núcleos a granel, es que con esta técnica, se puede utilizar una pequeña cantidad de células para preparar el extracto de núcleos.

Comience por sembrar las células hela en tres placas de 150 milímetros con medios DMEM suplementados con FBS y antibióticos, haga crecer los cultivos en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 90% de fluidez Co en este punto, aspire los medios de los cultivos celulares HELOC y lávelos una vez con 13 mililitros de temperatura ambiente. PBS por placa y luego aspirado. El PBS coloca cada placa de lado durante unos segundos y aspira el resto del PBS.

A continuación, utilice un elevador de células para raspar las células hasta el borde inferior de cada placa y, a continuación, tire de las células en un tubo de einor de 1,5 mililitros. Finalmente, granule las células en una micro fuga durante cinco minutos a cien veces G y a cuatro grados centígrados. Ahora aspire el PBS de la célula y estime el volumen de la célula empaquetada o PCV observando la gradación en el tubo.

A continuación, añada el doble del volumen de tampón hipotónico que el PCV al pellet de la célula. Agite el tubo suavemente para volver a suspenderlo. Las células pipetean suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1000 microlitros para desalojar los grupos de células según sea necesario.

A continuación, granule las células en las mismas condiciones de centrífuga que antes. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente la capa tampón hipotónica. Las células habrán comenzado a hincharse y el volumen de células habrá aumentado a unos 750 a 1000 microlitros.

Agregue un nuevo tampón hipotónico a un volumen final de 1,5 mililitros y vuelva a suspender las células en el tampón. Otra vez. Finalmente, incube las células hinchadas resuspendidas en hielo durante 10 minutos mientras las células se enfrían. Enjuague un homogeneizador de plumón con tampón hipotónico y luego colóquelo sobre hielo junto con las células.

Luego, con un limpiador de tareas delicado como una toallita Kim, seque el mortero. Utilice una punta de micropipeta extendida de 1000 microlitros para eliminar el tampón de los plumones. Ahora use la pipeta para transferir las células hinchadas enfriadas a las aguas abajo.

Es la parte más complicada de este procedimiento para el éxito de la comprobación. Después de cada bajada al microscopio, mueva lentamente el mortero apretado de las plumas hacia arriba y hacia abajo cinco veces para piojos de las células, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, transfiera un Eloqua de cinco microlitros de la suspensión de células de lisa a un tubo de einor y agregue 10 microlitros de azul trian y 15 microlitros de un XPBS.

Agregue la solución celular a un portaobjetos y examine las células bajo un microscopio óptico para la lisis, los núcleos de las células lisis aparecerán azules después de tres onzas. No hay suficiente lisis ya que se ven numerosas células vivas. Después de cinco onzas, hay suficiente lisis.

Finalmente, transfiera las células de lisis al tubo de einor preenfriado y gire la suspensión celular durante cinco minutos en una micro fuga a 1500 veces G y cuatro grados Celsius. A continuación, transfiera con cuidado la super natina a un tubo nuevo sin alterar el pellet. Ahora, estime el volumen nuclear del parche o PNV observando la gradación en el tubo.

Llene la punta de una micropipeta con tampón bajo en sal a la mitad del PNV. A continuación, inserte la punta de la micropipeta en los núcleos de la parte inferior del tubo de einor. Rociar lentamente el tampón en los núcleos mientras se mezcla suavemente.

Agite suavemente el tubo para asegurarse de que el pellet se vuelva a suspender por completo. A continuación, agregue tampón con alto contenido de sal a la mitad del PNV y mezcle rápidamente una vez invirtiendo el tubo. Gire el tubo durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Por último, haz girar los núcleos en el micro fuge durante 15 minutos a 18.000 veces G y cuatro grados Celsius. Comience transfiriendo 500 microlitros del sobrenadante a micro cons refrigerados. Gire el extracto nuclear con alto contenido de sal durante 15 minutos a 14.000 veces G y cuatro grados centígrados después de la centrifugación, invierta el mini rcon y colóquelo en un nuevo tubo EOR individual.

Después de girar durante dos minutos a 1000 veces G y cuatro grados Celsius, el extracto nuclear con alto contenido de sal se concentrará en aproximadamente 115 microlitros. Ahora transfiera 45 alícuotas de microlitros del extracto nuclear con alto contenido de sal a mini SLI de diálisis. Asegúrese de que la parte inferior del portaobjetos esté con la parte inferior del flotador.

A continuación, coloque los SLI en 500 mililitros de tampón de diálisis refrigerado. Finalmente, revuelva las alícuotas durante una o dos horas a cuatro grados centígrados, el extracto nuclear aparecerá turbio después de la diálisis. Esta figura muestra datos representativos que comparan una reacción de transcripción y corte de ARN polimerasa acoplada dos en un extracto nuclear a pequeña escala frente a un extracto nuclear a granel.

Cuando se incubó la construcción A-C-M-V-D-N-A en extractos a granel o a pequeña escala, se sintetizaron niveles similares del pre ARNm naciente en el punto de tiempo de cinco minutos después de la adición de alfa y manina para bloquear una transcripción adicional, los intermedios de empalme y los productos de empalme se acumularon con el tiempo con una cinética similar en ambos tipos de extractos. Estos resultados representativos confirman que las eficiencias del sistema de transcripción y empalme de la ARN polimerasa acoplada dos son similares en los extractos nucleares a granel y a pequeña escala. Para demostrar la utilidad del extracto a pequeña escala, se prepararon extractos del método a partir de células hela tratadas con el inhibidor de empalme E 7 1 0 7 o el compuesto de control negativo Platy analy F y luego se llevó a cabo un ensayo de transcripción y empalme de ARN polimerasa acoplada dos como se muestra en esta figura, la transcripción por ARN polimerasa dos ocurrió de manera eficiente en extractos preparados a partir de la tela escocesa F y E 7 1 0 7 células.

Por el contrario, el empalme se produjo normalmente en el extracto preparado a partir de las células tratadas con Analy F, pero fue abolido en las células tratadas con E 7 1 0 7. Estos datos proporcionan una prueba de concepto para el uso de los extractos nucleares a pequeña escala para el tratamiento especial de células a pequeña escala. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en menos de cinco horas.