Name: La transfección de anticuerpos en neuronas como una herramienta para estudiar la patogénesis de enfermedades (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprende a transfectar anticuerpos fluorescentes en neuronas para estudiar la patogénesis de enfermedades neurológicas mediadas por autoanticuerpos. Este método permite visualizar los efectos celulares mediante microscopía de inmunofluorescencia y cuantificar la eficiencia de transfección.

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Este trabajo es apoyado por la Oficina de Investigación y Desarrollo, Médico del Servicio de Investigación del Departamento de Asuntos de Veteranos. Este estudio fue financiado por una concesión de mérito revisión VA (a MCL) y la Universidad de Tennessee Health Science Center Fondo Multiple Sclerosis Investigación.

1. Anticuerpo Etiquetado (Figura 1) <ol><li> Hacer NaHCO3 0,1 M buffer: <ul type="circle"><li> 8,4 g de NaHCO 3 </li><li> 29,2 g de NaCl </li><li> 1 litro de H2O </li></ul></li><li> Llevar el tampón hasta un pH de 8,4 con esta solución (10,6 g de Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litro H 2 0). </li><li> Añadir 35 Atto550 NHS mu l a 70 l anti-hnRNPA1 y 500 l NaHCO 3 tampón y girar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la rotación de una hora de duración, inyectar la mezcla en un dializador y dializar 2 litros de PBS durante la noche. </li><li> El día siguiente, se concentran los dializados Atto550 NHS anti-hnRNPA1 utilizando una columna de centrifugación (Amicon Ultra 0,5). </li><li> Después de que los Atto550 NHS marcado anti-hnRNPA1 anticuerpo se ha concentrado, nano-gota de muestra para determinar la concentración. </li></ol> 2. Anticuerpo transfección (Figura 2) <ol><li> Seed 10 5 células / pocillo en 500 l de Dulbecco Medio de Eagle Modificado (DMEM/F12 +10% FBS 1% de antibiótico) en una corredera 8 y 24 horas antes de la transfección. Confluencia celular debe ser de al menos 70%. </li><li> Veinticuatro horas después de la siembra, añadir 2 l de Ab-DeliverIN reactivo en un tubo Eppendorf. </li><li> A continuación, añadir 2 g de Atto550 NHS etiquetados anti-hnRNPA1 de anticuerpos (0,5 mg / l) para el mismo tubo de Eppendorf y se incuban 10-15 min a TA. </li><li> Durante la incubación, aspirar los medios y añadir 394 l de medio DMEM fresco a las células. </li></ol> Nota: Añadir 500 l DMEM a una cámara de células intactas para actuar como un control. <ol start="5"><li> Después de la incubación, añadir 100 ml de DMEM a la mezcla de anticuerpo, mezclar pipeteando arriba y abajo, y añadir a las células en DMEM para un volumen total de 500 l. </li><li> Cambie los medios de comunicación después de 48 horas de la entrega de anticuerpos. </li></ol> Nota: El Protocolo se repitió con FITC Rigg como control positivo. 3. Imágenes en directo y fijo para determinar la eficiencia <ol><li> Células de imagen en vivo a las 48 horas con la Cy3 filtro en un microscopio de fluorescencia a la imagen de las transfectadas Atto550 NHS anticuerpos marcados. </li><li> Después de obtención de imágenes en vivo se ha completado, la aspiración de los medios y las células fijas. </li><li> Después de los medios de aspiración, el tratamiento de células con 0,4% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Lavar las células 4 x 5 min cada uno con PBS. A continuación, montar las células con medio de montaje que contiene el reactivo y el cubreobjetos solución DAPI. Medir la eficiencia de transfección de las células fijadas con Axiovision software. Si Axiovision software no está a la mano, simplemente contar los acontecimientos de su imagen por los resultados de la mano y se conectan a calcular en 3,7. Alternativamente, el software ImageJ puede ser utilizado para estos cálculos. </li><li> En primer lugar, utilice la &quot;Eventos&quot; de medición para contar el número total de células en su imagen de elección de 20 aumentos. </li><li> A continuación, utilice el &quot;Eventos&quot; de medición para contar las células que no erantransfectadas con éxito con los anticuerpos de la imagen misma magnificación de 20x. </li><li> Para acceder a las medidas &quot;Eventos&quot; en un formato de estilo de Excel, haga clic en &quot;Propiedades&quot;, haga clic en la &quot;medición&quot; ficha y haga clic para ver &quot;Como muestra la tabla.&quot; </li><li> Por último, utilice el siguiente cálculo para determinar la eficacia de transfección mediante la comparación de los dos eventos previamente medidos: ((células totales - las células no transfectadas) / células totales) x 100 = eficiencia de transfección. </li></ol> 4. Los resultados representativos Las imágenes en vivo de no transfectadas (Figura 3A) en comparación con transfectadas (Figura 3B), las neuronas revelan que el etiquetado de los anticuerpos (rojo o verde en cada figura) se observa claramente dentro de las células (Figura 3B, C, D). Después de la aspiración y el lavado con medios para eliminar los anticuerpos entre o adherentes a la superficie de las células, anticuerpos marcados todavía están presentes dentro de las neuronas (Figura 3C, D).<html> Para calcular la eficiencia de la transfección, el uso del software Axiovision para calcular el total de células en comparación con células que no fueron transfectadas con éxito. Estos valores se introdujeron en una fórmula de la eficiencia de transfección para adquirir la eficiencia de transfección como un porcentaje del total de células (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo de los procedimientos utilizados para marcar anticuerpos con la Atto 550 NHS ester seguido los pasos necesarios para concentrar los anticuerpos marcados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> Figura 2. Diagrama de flujo de los procedimientos utilizados para transfectar anticuerpos marcados en células vivas en cultivo.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ampliar la figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> Figura 3. Las imágenes en directo de las neuronas transfectadas 48 h de transfección siguiente. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> Figura 4. Fija y se enjuagó con imágenes de eventos de contarse para determinar la eficiencia de transfección.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
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<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
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<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Con el fin de probar las hipótesis sobre moléculas específicas y de su expresión, genes y otros vectores son comúnmente transfectadas en células. El aspecto único de este procedimiento es la capacidad para transfectar fácilmente anticuerpos en las células diana. Se realizó este procedimiento en cinco experimentos separados, cada uno por duplicado. Resultados de transfección de eficiencia fue similar entre todos los experimentos. Es importante destacar que el método permite la entrada de anticuerpos en la célula, sin alt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Microscopio fluorescente AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Axiovision versión 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Lucha contra el rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> Marcado con FITC anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 éster de NHS </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10% de FBS antibióticos +1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina 8-así diapositivas Cultura </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Científico IndustriInc es </td><td> Modelo 151 </td></tr><tr><td> Medios de montaje DAPI </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dializador </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehído (4% de solución) </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

la transfección de anticuerpos en neuronas como una herramienta para estudiar la patogénesis de enfermedades

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Los anticuerpos ofrecen la posibilidad de conocer mejor novela en varios eventos que tienen lugar en los sistemas vivos. La capacidad de producir anticuerpos altamente específicos para las proteínas diana ha permitido preguntas biológicas muy precisas que deben abordarse. Es importante destacar que los anticuerpos han sido implicados en la patogénesis de un número de enfermedades humanas, incluyendo el lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide (AR), los síndromes paraneoplásicos, esclerosis múltiple (MS) y T-linfotrópico humano tipo virus 1 (HTLV-1) asociado mielopatía / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP) 1-9. Cómo anticuerpos causar enfermedad es un área de investigación en curso, y los datos sugiere que las interacciones entre los anticuerpos y los diversos resultados de moléculas intracelulares en la inflamación, alterado celular de mensajería, y la apoptosis 10. Se ha demostrado que los pacientes con MS y HAM / TSP producir anticuerpos contra la proteína de unión intracelular de ARN heterogéneo proteína A ribonucleares1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Datos recientes indican que los anticuerpos para tanto intra-neuronal y antígenos de superficie son patógenas 3, 5-9, 11. Por lo tanto, un procedimiento que permite el estudio de anticuerpo intracelular: interacciones proteína daría una gran comprensión de la patogénesis de enfermedades. Los genes están comúnmente transfectaron en células primarias y líneas celulares en cultivo, sin embargo transfección de anticuerpos en las células se ha visto obstaculizado por la alteración de la estructura del anticuerpo o la eficiencia de transfección pobre 12. Otros métodos de transfección incluyen la transfección de anticuerpo basada en liposomas catiónicos (que consiste de DOTAP / DOPE) y polietileniminas (PEI), ambos de los cuales resultó en una disminución de diez veces en la transfección de anticuerpos en comparación con los controles 12. El método realizado en nuestro estudio es similar al mediada por lípidos catiónicos métodos y utiliza un mecanismo basado en lípidos para formar complejos no covalentes con los anticuerpos a través de electrostática y hydrinteracciones ophobic 13. Hemos utilizado Ab-DeliverIN reactivo, que es una formulación lipídica capaz de capturar anticuerpos a través de interacciones no covalentes electrostáticas e hidrófobas y su entrega dentro de las células. Así química y genética acoplamientos no son necesarios para la entrega de anticuerpos funcionales en las células vivas. Este método nos ha permitido realizar anticuerpo diversos experimentos de rastreo y localización de las proteínas, así como los análisis de las consecuencias moleculares de anticuerpo intracelular interacciones proteína: 9. En este protocolo, vamos a mostrar cómo transfectar anticuerpos en neuronas rápido, reproducible y con un alto grado de eficiencia de transfección. Como ejemplo, vamos a usar anti-anticuerpos hnRNP A1 y anti-IgG. Para la cuantificación fácil de eficiencia de transfección se utilizó anti-anticuerpos hnRNP A1 marcados con Atto-550-NHS y marcado con FITC IgG. Atto550 NHS es una nueva etiqueta con alta absorción molecular y yi cuánticaeld. Fuente de excitación y filtros fluorescentes para Atto550 son similares a Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Además, Atto550 tiene alta fotoestabilidad. Marcado con FITC IgG se utilizaron como control para demostrar que este método es muy versátil y no teñir dependiente. Este enfoque y los datos que se generan ayudará en la comprensión de la función que los anticuerpos a antígenos diana intracelulares podría desempeñar en la patogénesis de las enfermedades humanas.

Un enfoque rápido para investigar las interacciones y efectos en los mecanismos moleculares relacionados con la presencia de anticuerpos en un entorno intracelular se describe. El método implica la transfección de anticuerpos en células vivas utilizando una formación de complejo no covalente basada en una formulación de lípidos. La técnica es adaptable a las líneas celulares inmortalizadas y en células primarias.

La transfección de anticuerpos en neuronas como una herramienta para estudiar la patogénesis de enfermedades

Los anticuerpos proporcionan la capacidad de obtener nuevas perspectivas sobre diversos eventos que ocurren en los sistemas vivos. La capacidad de producir anticuerpos altamente específicos...

El objetivo de este procedimiento es proporcionar un enfoque rápido y reproducible para investigar cómo los anticuerpos, los mecanismos moleculares autólogos relacionados con la función neuronal y la patogénesis de las enfermedades neurológicas. Primero, los anticuerpos se marcan con una etiqueta fluorescente ATO five 50 NHS. A continuación, los anticuerpos se mezclan con el reactivo de transfección y luego se transfectan en células neuronales.En cultivo, 48 horas después de la transfección, las neuronas se fijan y montan con medio DPI y se visualizan mediante microscopía de inmunofluorescencia. La eficiencia de transfección puede calcularse utilizando software de análisis de imágenes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia y neuroinmunología, como cómo los autoanticuerpos alteran los mecanismos moleculares relacionados con la función neuronal y la patogénesis de las enfermedades neurológicas mediadas por el sistema inmunitario.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos probar la hipótesis de que los anticuerpos contra h y RPA uno y la proteína de unión al ARN sobreexpresada en neuronas contribuían al mecanismo de neurodegeneració

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Investigación

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Neurociencia

Fuente: Tagliafierro, L., et al. Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de herramientas de edición del epigenoma en modelos de enfermedades derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la transducción lentiviral de células progenitoras neurales (NPC) para la modificación epigenética dirigida de alfa-sinucleína, una proteína clave en la enfermedad de Parkinson. El protocolo permite la metilación del ADN mediada por...

Transducción lentiviral de células progenitoras neurales para la regulación epigenética de la expresión de alfa-sinucleína

Este video muestra el proceso de transducción de células neuronales humanas con un lentivirus que codifica una proteína tau humana mutante marcada con proteína fluorescente amarilla (YFP) para estudiar la agregación de proteínas. Describe los pasos desde la entrada viral hasta la expresión mutante de tau, que culmina en la formación de agregados citoplasmáticos visibles de tau en las neuronas.

Transducción lentiviral de neuronas humanas para el análisis de agregación de proteínas Tau

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

El control de la expresión de proteínas no solo es esencial para todos los organismos vivos, sino también una estrategia importante para investigar las funciones de las proteínas en modelos celulares. El protocolo presentado muestra la aplicación de la interferencia de anticuerpos en células de mamíferos, incluidas las neuronas primarias del hipocampo, y demuestra el uso de reconstrucciones tridimensionales en el estudio de la función de las proteínas.

El estudio de la función de proteínas y el Papel de la expresión de la proteína alterada por la interferencia de anticuerpos y reconstrucciones tridimensionales

Este manuscrito describe cómo la entrega de genes locales mediada por vectores virales proporciona una forma atractiva de expresar transgenes en el sistema nervioso central.  El protocolo describe todos los pasos cruciales para realizar una inyección de vector viral en la sustancia negra de la rata para desarrollar un modelo animal basado en vectores virales para la enfermedad de Parkinson.

Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante

Inyección intraspinal del recombinase dependiente recombinante virus adeno-asociado (rAAV) puede utilizarse para manipular cualquier tipo de célula genéticamente marcadas en la médula espinal. Aquí describimos cómo transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar. Esta técnica permite interrogatorio funcional del subtipo neurona manipulada.

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón

Este protocolo detalla un procedimiento en el que las culturas neuronales humanas son transducidas con construcciones lentivirales codificando para tau humano mutante. Las culturas transducadas muestran agregados Tau y patologías asociadas.

Un modelo in vitro para estudiar la agregación de Tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales

La encefalitis autoinmune es una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos del sistema nervioso central. Las neuronas del hipocampo se pueden utilizar para descubrir y caracterizar estos anticuerpos. Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo celular primario y la inmunotinción para determinar los autoanticuerpos en el suero y el líquido cefalorraquídeo de los pacientes.

Cultivos neuronales del hipocampo para detectar y estudiar nuevos anticuerpos patógenos implicados en la encefalitis autoinmune

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Aprende a transfectar anticuerpos fluorescentes en neuronas para estudiar la patogénesis de enfermedades neurológicas mediadas por autoanticuerpos. Este método permite visualizar los efectos celulares mediante microscopía de inmunofluorescencia y cuantificar la eficiencia de transfección.

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