Perfiles Integral del Reglamento de la dopamina en la sustancia negra y el área tegmental ventral

El objetivo general de este procedimiento es maximizar la información de las respuestas moleculares asociadas con la regulación de la dopamina a partir de una única disección de tejido de las regiones somatodendríticas del cerebro medio. Esto se logra primero mediante una disección precisa para separar la sustancia negra del área tegmental ventral. El segundo paso consiste en procesar los tejidos para el análisis de dopamina mediante HPLC y en procesar adicionalmente la proteína endógena precipitada para su análisis.

A continuación, el procesamiento de la proteína precipitada para determinar el contenido total de proteínas permite identificar qué proteínas reguladoras de la dopamina o qué fosforilaciones proteicas pueden medirse junto con la cuantificación del contenido tisular de dopamina en la muestra. En última instancia, los análisis de la dopamina y sus proteínas reguladoras en regiones somatodendríticas discretas del mesencéfalo permiten extraer conclusiones sobre los mecanismos moleculares asociados con la regulación de la dopamina.

Las monoaminas afectan muchos resultados conductuales, y de hecho, los investigadores en el campo de la adicción, la biología y la disfunción locomotora, como notablemente en la enfermedad de Parkinson, tienen un gran interés en cómo las monoaminas, como la dopamina, que estudiamos en mi laboratorio, influyen en los resultados conductuales. Pero la importancia de estudiar las monoaminas puede ampliarse aún más si comprendemos cómo están reguladas a nivel molecular. La ventaja de nuestra técnica es que podemos obtener, a partir de una única muestra obtenida de tejido del SNC, múltiples lecturas de esa misma muestra, de modo que podemos obtener un perfil completo de cómo los eventos moleculares afectan la desregulación de las monoaminas.

Podemos tomar esos datos y luego ponerlos en contexto respecto a cómo se verá afectado el comportamiento. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la determinación de la proteína y la fosforilación requiere conocimiento sobre la cantidad de proteína total que se necesitará para obtener una lectura precisa, dependiendo de los anticuerpos elegidos por el investigador. La demostración visual de este método es fundamental.

Las técnicas de disección y la determinación de monocitos con las proteínas reguladoras representan un enfoque relativamente nuevo para analizar la regulación in vivo. Para comenzar este procedimiento, enfríe la matriz cerebral de roedor, una placa de Petri que contenga cinco cuchillas y un escalpelo número 11 sobre una cama de hielo húmedo. También preenfríe tantos tubos como sean necesarios para la disección en hielo seco.

Luego, tras sacrificar una rata, retire su cerebro y colóquelo boca abajo, con el cerebelo lateral encajando en las muescas de la matriz fría con hielo. Después de un minuto, inserte las cuchillas frías en el cerebro enfriado, comenzando aproximadamente a dos milímetros, hacia la parte rostral del quiasma óptico, para el análisis del estriado y el núcleo accumbens. A continuación, continúe insertando las cuchillas frías cada uno milímetro hasta la mitad de los puentes; luego, desplace ligeramente la posición de cada cuchilla para facilitar su extracción más fácil de la matriz.

Al extraer las cuchillas, busque el comienzo del hipocampo, ya que es la mejor guía para asegurar la presencia de la SN y la VTA en el lugar donde el hipocampo rodea completamente el mesencéfalo. Realice cortes con la hoja de bisturí número 11 para disecar primero la SN de la VTA. Retire la corteza y el hipocampo superpuestos.

Luego, realice un corte vertical que separe el área pigmentada de la SN del VTA, asegurándose de que la cuchilla mantenga contacto constante con el hielo durante la disección. A continuación, haga un corte horizontal en o cerca de la línea media, justo por encima de la parte más dorsal y lateral del sn. Por último, separe la SN del resto del tronco encefálico.

Una vez que se ha eliminado la SN, separe el VTA del resto del mesencéfalo. Coloque inmediatamente los tejidos diseccionados en tubos microfuga preenfriados. Luego, almacene los tejidos a menos 80 grados Celsius hasta que estén listos para su procesamiento.

En este procedimiento, homogenice suavemente el tejido inmediatamente después de retirarlo del hielo seco utilizando una solución fría con hielo de ácido perclórico 0,1 molar con EDTA. A continuación, vuelva a mantener la muestra en hielo seco. Luego, centrifugue las muestras a 12.000 RPM para sedimentar.

El pellet de proteína que se utilizará para las determinaciones por inmunotransferencia; posteriormente, aspire los sobrenadantes al vial de HPLC. Coloque los pellets de proteína precipitada aún congelados, derivados del tratamiento con tampón de HPLC, sobre hielo húmedo para descongelar y asegúrese de que se haya eliminado y archivado todo el tampón. Para el procesamiento bilateral de la SN, agregue 300 microlitros de SDS al 1% que contenga cinco milimolares de tris y un milimolar de EDTA al pellet y someta a sonicación; mientras que para el procesamiento bilateral de la VTA, 200 microlitros de SDS al 1% serían suficientes.

A continuación, coloque las muestras en agua hirviendo durante aproximadamente cinco minutos para completar la desnaturalización de las proteínas. Luego, déjelas enfriar a temperatura ambiente y asegúrese de que las tapas estén bien sujetas en este paso. A continuación, utilice el ensayo BCA con una curva patrón de proteína en un rango de dos a 40 microgramos de proteína.

Para determinar la concentración de proteína en las muestras de cinco microlitros, utilice el valor mediano obtenido de un análisis por triplicado para determinar la cantidad de proteína frente a la curva patrón. Divida el resultado entre el volumen de la muestra para obtener la concentración de proteína. A continuación, prepare las muestras con el tampón de muestra que contiene DIO tres etol para realizar la electroforesis SDS reductora en gel de acrilamida al 10%, si es necesario, según lo indicado por el color del tampón de muestra.

Cambie a amarillo, agregue tris base unimolar pH 8,2 en incrementos de 10 microlitros a la muestra hasta que aparezca el color azul. Para asegurar el pH adecuado, corra la cantidad apropiada de proteína total mediante SDS-PAGE en gel de acrilamida al 10%, luego transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa con tamaño de poro de 0,45 micrones. Configure el tanque electroforético a al menos 27 voltios y permita que la transferencia continúe durante la noche.

Al día siguiente, seque la transferencia durante al menos 30 minutos. Luego tiña con la solución de poncho S durante aproximadamente cinco minutos. Después, detenga la reacción vigorosamente con solución de ácido clorhídrico al 0,2 % hasta que las bandas individuales de proteínas se resuelvan claramente y se elimine la tinción de fondo.

Luego, obtenga una imagen de la tinción del poncho S utilizando ImageJ para cuantificar aún más las cargas relativas de proteína en cada carril y normalizar los resultados de la tirosina hidroxilasa, el transportador de dopamina o el transportador vesicular de monoaminas dos. Aquí se muestra el inmunotransferencia de tirosina hidroxilasa fosforilada en la serina 31 en muestras de la sustancia negra de rata. La curva patrón calibrada de tirosina hidroxilasa fosforilada en la serina 31 oscila entre 0,3 nanogramos y 2,0 nanogramos y se encuentra dentro del rango lineal de detección. Aquí se muestra el inmunotransferencia de tirosina hidroxilasa fosforilada en la serina 40 en muestras del área tegmental ventral de rata.

La curva patrón de la tirosina hidroxilasa fosforilada en el SN 40 calibrado oscila entre 0,2 nanogramos y 1,5 nanogramos y se encuentra dentro del rango lineal de detección. Es importante mantener la temperatura adecuada, así como etiquetar los tubos. También es fundamental normalizar las proteínas para reducir la varianza de los resultados.

Este protocolo, cuando se sigue minuciosamente, puede proporcionar a los investigadores en el campo de la función locomotora y el comportamiento adictivo lecturas moleculares extensas que afectan la regulación de las monoaminas y el cerebro, especialmente la dopamina, que es lo que nos interesa. Como resultado, estas lecturas pueden ofrecer un análisis muy detallado y completo de lo que significan los resultados conductuales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo maximizar las lecturas de la regulación de monoaminas en la sustancia negra y el área tegmental ventral a partir de una única disección de tejido.