Una modificación de la EPA Método 1623 que utiliza el flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración y la Plaza de calor de disociación para detectar a base de agua

El objetivo general de este procedimiento es detectar y visualizar especies de Cryptosporidium y Giardia en el agua. Esto se logra primero concentrando la muestra de agua mediante filtración tangencial de flujo, con fibra hueca y ultrafiltración. El segundo paso consiste en eluir los organismos y atrapar los residuos del filtro tras un paso de centrifugación.

La separación inmunomagnética permite la separación selectiva de los parásitos a partir de los residuos concentrados. Las perlas magnéticas se separan de los parásitos mediante disociación térmica y se eliminan utilizando un imán. Luego, los quistes y los quistes O se colocan sobre un portaobjetos y la muestra se tiñe para su visualización mediante microscopía de inmunofluorescencia.

La principal ventaja de la filtración hofi frente a las técnicas existentes es que el ultrafiltro es significativamente menos costoso y captura múltiples microorganismos además de Cryptosporidium y Giardia, como virus y bacterias. Por lo general, las personas nuevas en la inmuno separación enfrentarán dificultades debido a la cantidad y tipo de residuos asociados con diferentes muestras procedentes de condiciones climáticas muy variadas. Comience por armar el aparato de ultrafiltración dentro de una cabina de seguridad biológica.

Una vez ensamblado, el aparato funciona de la siguiente manera: la muestra de agua entra en el sistema al pasar a través del conector en T negro y avanza a través de la cabeza de la bomba, el manómetro y hacia el filtro ultrafino de fibra hueca; el agua filtrada sale por el costado del filtro hacia el recipiente de desecho. El agua retenida, que contiene los organismos, es forzada hacia la botella del concentrado y recirculada a través del sistema hasta que se reduce el volumen de agua. Para comenzar el procedimiento, retire la tapa de ventilación y abra todas las pinzas excepto la pinza de compresión dos, que debe permanecer cerrada para permitir que la botella del concentrado se llene con el agua; configure la dirección de la bomba de modo que la muestra de agua fluya hacia el filtro.

Luego ajuste la velocidad de la bomba al 25 % y encienda la bomba cuando la botella de renato esté abierta y dos tercios llena. Cierre la pinza dos y selle rápidamente la botella firmemente utilizando la tapa de ventilación. Revise todas las líneas y conexiones para asegurarse de que no haya fugas.

Luego aumente lentamente la velocidad de la bomba hasta aproximadamente 1,5 litros por minuto utilizando un cilindro graduado y un cronómetro o un medidor de flujo, y verifique que la velocidad del filtrado, es decir, la velocidad del agua que sale por la línea de efluente, sea efectivamente de 1,5 litros por minuto. Supervise el proceso de filtración asegurándose de que la botella de retenido nunca se vacíe, aunque el volumen pueda aumentar o disminuir ligeramente. Si el volumen desciende por debajo de un tercio, retire la tapa de ventilación y cierre la abrazadera de compresión dos.

Nuevamente, permita que el volumen en el frasco aumente hasta dos tercios. Luego, coloque firmemente la tapa de ventilación y abra nuevamente la pinza dos. Una vez que el recipiente de la muestra esté vacío, cierre inmediatamente la pinza de compresión uno, reduzca la velocidad de la bomba al 20 %, retire la tapa de ventilación del frasco de retenido y cierre la pinza reguladora que conecta el tubo de efluente de la columna de filtro con el tanque de desecho.

Ajuste la pinza de la rampa para aumentar o disminuir el volumen en el frasco de retenido hasta aproximadamente 200 mililitros. Luego apriete la pinza de la rampa para la elución y así eluir la muestra. Primero, agregue 500 mililitros de solución de elución al recipiente de la muestra, enjuagando al mismo tiempo el interior del recipiente.

Luego, coloque la pipeta de 10 mililitros conectada a la línea de toma de muestra dentro del recipiente con la solución eluyente. Abra momentáneamente la pinza de compresión uno y cierre la pinza de compresión dos para aspirar la solución eluyente. Una vez que se haya cargado toda la solución, cierre la pinza de compresión uno, abra la pinza de compresión dos y permita que la solución circule durante cinco minutos con una velocidad de bomba del 20 %. Apriete o afloje la pinza de rampa para ajustar el volumen de muestra en el frasco de renato a aproximadamente 100 mililitros.

Luego apriete completamente la abrazadera de la rampa y permita que la muestra recircule durante un minuto. En este punto, invierta la dirección de la bomba durante 20 segundos. Esto provocará la acumulación de aproximadamente 225 mililitros de muestra en el frasco Tate.

Luego apague la bomba. Retire el tubo del cabezal de la bomba y el tubo que sale del filtro y sostenga el tubo sobre el frasco para forzar a que cualquier muestra restante entre en el frasco. A continuación, desconecte todos los tubos del frasco y sustituya la tapa de ventilación por una tapa sin ventilación.

Transfiera la muestra concentrada a un tubo cónico de centrífuga de 250 mililitros. Enjuague el frasco del renato dos veces con 10 mililitros de agua reactiva y transfiera el líquido de enjuague al tubo de centrífuga. Centrifugue la muestra a un mínimo de 1500 ×g durante 15 minutos.

No utilice una desaceleración para detener la centrifugación. Tras la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante hasta dejar cinco mililitros por encima del sedimento. Se debe tener especial cuidado en mantenerse en la parte superior del nivel líquido y evitar aspirar quistes O y quistes que se encuentren dentro del sedimento.

Vortexee el tubo para resuspender completamente el precipitado. Luego transfiera la muestra a un tubo Dyal L 10 de lados planos que contenga un mililitro de cada uno de los tampones 10 X SL A y B. Enjuague el tubo de centrífuga dos veces con 2,5 mililitros de agua de reactivos y añada la solución de enjuague al tubo Dyal L 10. Añada 100 microlitros de cada uno de los anticuerpos magnéticos conjugados anticrososporidium y antigiardia al tubo, hasta alcanzar un volumen final de 12 mililitros.

Luego, gire el tubo a 18 RPM durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. Coloque el lado plano del tubo contra el imán MP seis y mueva suavemente el tubo durante dos minutos sin retirarlo del imán. Mantenga el lado plano hacia arriba y deseche el sobrenadante.

Teniendo cuidado de no perturbar las perlas retenidas en el lado plano del tubo cerca del imán. Retire el tubo de muestra del imán y enjuague el lado plano del tubo tres veces con 500 microlitros de tampón A, evitando los residuos en el lado redondeado del tubo. Transfiera cada volumen de enjuague a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros colocado dentro de un imán MPCS.

Con el imán en posición vertical, cierre el tubo y agítelo suavemente durante un minuto. Luego, manteniendo el imán en su lugar, aspire el sobrenadante utilizando una pipeta Pasteur colocada en la parte inferior del tubo y agregue suavemente un mililitro de PBS al tubo.

Tenga cuidado de no perturbar el pellet de perlas. Colóquelo en la pared del tubo adyacente al imán. Retire la tira magnética y agite suavemente el tubo hasta que las perlas se resuspendan.

Vuelva a colocar la tira magnética en posición vertical. Agite suavemente el tubo durante un minuto y aspire el sobrenadante, eliminando la mayor cantidad posible de residuos sin perturbar las perlas. Después de este lavado, retire el imán y agregue 50 microlitros de agua reactivo directamente sobre la paleta de perlas.

Vortex la tubo a velocidad máxima durante 50 segundos para resuspender las perlas. A continuación, incube la muestra a 80 grados Celsius durante 10 minutos, permitiendo que los quistes de Giardia y los quistes de cryptosporidium o se disocien de las perlas. Tras la incubación, vortex la muestra durante 30 segundos. Luego, coloque la tira magnética en el MPCS utilizando la posición inclinada para separar las perlas de los quistes y los quistes O en suspensión.

Transfiera el sobrenadante que contiene quistes y quistes O a una placa de cultivo. Repita por segunda vez los pasos de adición de agua, vortex y disociación por calor, añadiendo el sobrenadante a la misma placa. Luego coloque la placa sobre un calentador de portaobjetos a 37 grados Celsius para secar la suspensión.

Comience aplicando 50 microlitros de metanol sobre el portaobjetos para fijar la muestra y déjelo secar a temperatura ambiente. A continuación, agregue 50 microlitros de solución DPI e incube el portaobjetos durante dos minutos a temperatura ambiente. Para teñir los núcleos, use una toallita Kim para absorber el exceso de solución del pocillo teniendo cuidado de no tocar el interior del pocillo.

Luego, agregue 50 microlitros de colorante fácil para teñir la pared celular de los quistes de Giardia y de los oquistes de Cryptosporidium. Incube la muestra a 35 grados Celsius durante 30 minutos. Retire el colorante con la toalla Kim como antes.

Luego, agregue lentamente 300 microlitros de tampón fijador fácil de teñir frío colocando cuidadosamente la punta de la pipeta fuera del pocillo y permitiendo que el líquido entre en el pocillo. Incube el portaobjetos durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el tampón utilizando una toallita kim y aplique 10 microlitros de medio de montaje; coloque suavemente una laminilla sobre la muestra, eliminando cualquier burbuja, y selle la laminilla con esmalte transparente. Utilizando un microscopio de fluorescencia, examine el portaobjetos con un aumento de 200 x a 1000 x y un filtro fse luego DPI a un aumento de 200 x; los quistes y los O quistes aparecen como estructuras ovales fluorescentes de color verde manzana brillante con bordes intensamente resaltados.

Los quistes de Cryptosporidium u oquistes son redondos y varían en tamaño entre cuatro y seis micrones. Los quistes de Giardia son más grandes, con un ancho de cinco a 15 micrones y una longitud de ocho a 18 micrones, y pueden ser redondos u ovoides a un aumento de 1000 x. Y mediante el uso del filtro DPI, puede apreciarse mejor la estructura interna de los quistes y CYS.

Típicamente, pueden observarse hasta cuatro esporozoítos, que aparecen como núcleos teñidos de color azul cielo con la tinción DPI, dentro del oocisto de Cryptosporidium y del quiste de Giardia. La microscopía DIC también puede ayudar en la identificación adecuada de los parásitos, ya que pueden apreciarse características morfológicas adicionales. Los esporozoítos de Cryptosporidium pueden ser visibles mediante DIC; los quistes de Giardia a menudo exhiben una o más estructuras internas discernibles, como núcleos visibles, orgánulos con forma de creciente denominados cuerpos medianos y estructuras flagelares internas llamadas axonemas.

Es importante tener en cuenta que el procedimiento de ultrafiltración con fibra hueca tiene la capacidad de capturar múltiples microorganismos. Además, se pueden aplicar otros ensayos de detección, como la QPCR y la tipificación genética, a las muestras concentradas, lo que hace que este método sea más flexible y adaptable a sus aplicaciones. Gracias por ver este video y háganos saber si tiene alguna pregunta.