Name: Citometría de flujo basado Purificación de S. cerevisiae Los cigotos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: Aprende a purificar cigotos de S. cerevisiae mediante citometría de flujo con alta pureza. Este método permite aislar poblaciones de cigotos para estudios de biología celular y transición haploide-diploide.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos al Dr. R. Michael Sramkoski ayuda con la citometría de flujo, el Dr. Purnima Jaiswal y el Dr. Wu Di de entrada temprano y Aylyarov Ilya ayuda con las ilustraciones. Apoyado por el NIH Grant R01GM089872 y la Citometría y Microscopia de imágenes facilidad de la base de la sentencia de Centro Integral del Cáncer (P30 CA43703).

1. Crecimiento célula haploide <ol><li> Crecer S. células de Saccharomyces desde el fondo S288C (BY4741) bajo condiciones estándar 10. </li><li> Transformar haploides para expresar cualquiera de los dos marcadores fluorescentes visibles 10. Los marcadores de elección son GFP soluble expresada en el citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado con BglII 11) y una proteína ribosómica único, RPL25, fusionado con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Esperamos que los equivalentes de dos colores protocolos de purificación podría hacer uso de otras proteínas fluorescentes brillantes que son sintetizados por las células parentales haploides. Alternativamente, la pared de la célula podría ser etiquetado con lectinas fluorescentes. </li><li> En la purificación día cigoto anterior, inocular 5 ml de cultivos de cada tipo de células y cultivarlas con agitación durante la noche a 23 ° C para alcanzar A600 no superior a 1,0. Crecer transformantes GFP (ATY4442) en medio sintético completo incluyendo 2% de glucosa (CSM-glucosa) en unand RPL25-mCherry transformantes (ATY4552) en medio sintético selectivo carente de uracilo 10. Mantener cultivos paralelos de cada tipo celular con agitación a temperatura ambiente. </li></ol> 2. La realización de una Cruz <ol><li> Ajuste de la densidad óptica (A600) de cada muestra a 1,0 en medio fresco. [1 Unidad de Densidad Óptica ~ 3 x 10 7 células / ml] </li><li> Mezclar volúmenes iguales de los dos cultivos, vórtice brevemente 3 veces, seguido por un vórtice durante 10 segundos más. </li><li> Preparar glucosa CSM-platos. Las placas son idénticos a los utilizados para el crecimiento de rutina y se han secado 45 min después de verter y solidificación del agar 10. </li><li> Distribuir hasta veinte 40-ml gotitas de la mezcla 1 cm desde el borde de la superficie de placas de glucosa CSM-. Cuando las gotas se aplican primero a la superficie de iniciar el temporizador para medir el tiempo transcurrido. Una vez que el líquido ha sido absorbido (aproximadamente 30 min), cubrir las placas y se dejan en reposo a rootemperatura m. </li></ol> 3. Los preparativos de cosecha <ol><li> Muestras de la cosecha después de 1.75-2.5 horas a 23 ° C mediante lavados repetidos individuales gotas secas de la placa usando 150 ml frío CSM-glucosa, manteniendo las placas en hielo. Repetidamente lave el área gotita 10-20 veces con el mismo medio para maximizar la recuperación. Recoge en 15 ml tubos Falcon en hielo. </li><li> Sonda sonicar las muestras 10 veces a 60% de la amplitud con un sonicador de Fisher FB120 (120Watt, 120 voltios, Frecuencia 20 kHz) en hielo. </li><li> Compruebe en el microscopio de fase que pocos agregados o no permanecen. 15-50% de las células se espera que los cigotos se han formado en este punto. </li><li> Deje el tubo de células en una posición vertical sin perturbaciones en hielo durante 10 min, como medida de precaución adicional (para permitir que los agregados de resolver). </li><li> Recuperar la más alta 90% del volumen y filtrarla a través de una malla de nylon (BD Falcon tubo de polipropileno con tapón tamiz (Ref. 352235)). En un experimento típico, 10 7 célulasse recuperó de una placa eran en este punto se diluyó en 4 ml de CSM-glucosa. </li></ol> 4. Citometría de Flujo <ol><li> Organizar las células utilizando el modelo Sony Reflexión iCyt citómetro de flujo, (Sort paralelo altamente automatizado) HAPS1 con una punta de 100 micras. Para excitación GFP, usar el azul de ion argón, 250 milivatios láser a 488 nm. Por excitación mCherry, utilice el láser de 100 mW a 561 nm. A pesar de que no tienen experiencia con otras máquinas, esperamos que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson afluencia o Beckman Coulter MoFlo XDP estaría bien cuando está equipado con el láser correctas. </li><li> Base parámetros de clasificación en un gráfico de dispersión hacia adelante frente hacia atrás para puerta de células viables. Establecer una parcela de emisión de 615 + / - 30 nm de paso de banda del filtro (mCherry) frente a 525 + / - 25 nm de paso de banda del filtro (GFP) para dividir los eventos en cuatro cuadrantes, &quot;Red + Green-&quot;, &quot;Rojo + Verde +&quot;, &quot;Red- Green-&quot;y&quot; Red-Green + &quot;(Figura S2). Utilice las células no fluorescentes como f estándaro la determinación de la &quot;Rojo-Verde-&quot; cuadrante. </li><li> Clasificar las células con una vaina de presión de 21,5 psi, una frecuencia de gota de 43.400 gotas / seg, y una presión de la muestra de 20,5 psi. </li><li> Ordenar inicial (&quot;modo de recuperación&quot;): Recoger las muestras en tubos Eppendorf refrigerada que contienen 250 ml de frío CSM-glucosa. Sedimento 10 segundos a velocidad máxima en una microcentrífuga refrigerada (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) y aspirar la solución de flujo (citometría de flujo de la solución vaina (PBS con 1 mM EDTA) BioSure Catalog No. 1027). Resuspender en 500 ml frío CSM-glucosa. </li><li> Ordenar Segundo (&quot;Modo de Pureza&quot;): Realizar la especie en cuanto a la clasificación inicial, usando el &quot;modo de pureza&quot; opción. El sedimento. Purificada células y resuspender los gránulos en 500 ml de 1,0-ml CSM-glucosa Agitar durante 15 min en 24-y placas a 23 ° C para permitir la recuperación metabólica. </li></ol> 5. DeltaVision Microscopía <ol><li> Preparar pastillas de agarosa como sigue: Llevar una suspensión de 1,5% de agarosa (UltraPureAgarosa, Invitrogen, n º de catálogo 15510-07) en CSM-glucosa a ebullición, agitar brevemente, y después aplicar 0,3 ml de muestras de la solución de agarosa a la superficie del portaobjetos de vidrio horizontales estándar y los cubre a la vez con una segunda corredera (sin la aplicación de presión). </li><li> Después de enfriar durante 10 min, retirar suavemente la corredera superior deslizándolo horizontalmente, teniendo cuidado de dejar una superficie lisa y no perturbar la capa de agarosa. (Cuando la tapa superior se ha eliminado, la muestra de células se debe aplicar dentro de 1-2 min. Cuando se mantienen en una cámara húmeda a temperatura ambiente sin necesidad de retirar la corredera superior, las almohadillas se pueden almacenar durante hasta un día antes de su uso.) </li><li> Las muestras de sedimentos y depósitos alícuotas de 1 ml del sedimento en las almohadillas de agarosa (sin tocar la superficie). Inmediatamente cubrir la muestra con un cuadrado N º 1 cubreobjetos. Recorte el exceso de agarosa con una hoja de afeitar de un solo filo. Sellar las preparaciones con vaselina dispensados ​​desde una jeringa. </li><li> Imagen con DeltaVision (Applied Precision) con un objetivo de aceite de inmersión 100x sin hurgar en la basura (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolucionar z-pilas utilizando el SoftWorx 5.0.0 del programa ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) y procesar mínimamente. Los sucesivos z aviones fueron recogidos generalmente en intervalos de 0.2-0.4 micrones. </li></ol> 6. Los resultados representativos Los niveles de intensidad de fluorescencia en las células haploides transformadas: El nivel de fluorescencia en los haploides se ilustra en la Figura S1. Antes de la cruz, el examen epifluorescente demostrado que esencialmente todos los transformantes GFP eran verdes y que todos los transformantes mCherry, aunque a menudo débil, eran de color rojo. Para asegurarse de que todas las células utilizadas para la cruz eran de hecho fluorescente, hemos utilizado la subpoblación con la señal fluorescente brillante. Rendimiento: Unespués de la clasificación inicial, el Rojo + Verde muestra + (Figura S2) incluye típicamente 8-20% del número de entrada de células y un número excesivo de células haploides, tal vez debido a la persistente adhesión célula-célula. Desde alto enriquecimiento no se consigue con un solo género, la muestra parcialmente purificada debe ser sonda se sonicaron dos veces a 60% de la amplitud seguido por re-clasificación. (Clases de recuperación suelen durar entre 1-2 horas, mientras que el segundo tipo requiere sólo 15 min.) De las células sometidas a la segunda clase, los Rojo + Verde + muestras incluyen 23-52% de las células de entrada. Examen microscópico Fase: El examen al microscopio de contraste de fases mostró que la pureza de la preparación final de cigoto promedio de aproximadamente 90% más de 21 preparaciones (que van desde 86% a 91%). Los contaminantes eran o bien haploides verde o roja, o pares de haploides que estaban en contacto entre sí. Figura 3 tabula el porcentaje de cigotos que tienensin brote, yemas medial (MED), brotes laterales (Lat) o yemas terminales (Plazo), el número de haploides pares del mismo color (&quot;2Same&quot;) o color diferente (&quot;2Hap&quot;), así como haploides individuales ( Hap). Cuando las células se recogieron después de 1,75 horas, más de 50% fueron unbudded y las otras subcategorías (con yemas medial, lateral o terminal) son igualmente representados. Después de 2,5 horas había aproximadamente el mismo número de cigotos en cada una de las cuatro categorías (unbudded, con cogollos medial, lateral o terminal). Observaciones microscópicas (Figura 4): La estructura de los cigotos parece permanecer sin cambios durante la purificación. De acuerdo a la duración de la cruz, la población tenía diferentes proporciones de cigotos unbudded y reverdeció, como se ha explicado anteriormente. Dado que tanto los haploides verde y rojo mostró una variación considerable en la intensidad de la señal fluorescente, algunos cigotos fueron predominantemente rojo mientras que otros eran predominantemente verde, como se observa por Comparing de las imágenes de un solo color a las imágenes combinadas en la Figura 4. Tenga en cuenta también que la GFP (MW 26kDa) entra en el núcleo y se puede encontrar en el núcleo incluso cuando los núcleos no se han fusionado. Las vacuolas se destacan como negros no fluorescentes esferas. El producto final de purificación permite obtener una población diversa en varias etapas de desarrollo. Los cigotos etiquetados Una fusión no han sido sometidos. Tipo B son cigotos unbudded. Tipo C tienen un pequeño brote. Tipo D tiene un brote más grande, y cigotos tipo E están a punto de someterse a la citocinesis. Tenga en cuenta también que muchos de los cigotos anteriores todavía exhiben una línea no fluorescente división medial (*), y que la vacuolar &quot;estructura de herencia&quot; (I) 12 puede verse a menudo para extenderse desde el cigoto en la yema. En algunos casos, la señal verde se ha redistribuido en la pareja en un grado mucho mayor que la señal roja. Esto refleja el retardo de transferencia que es característico de polisomas (Tartakoff, en preparación). 6 cigotos, que es suficiente para muchos inmunotransferencias, utilizando procedimientos de detección de quimioluminiscencia. Uso de fenol-cloroformo protocolos de aislamiento que extraer aproximadamente 1,5 mg de ARN a partir de este número de células. Puesto que los cigotos purificadas han sido enfriado, antes de un análisis más detallado se recomienda la incubación a 23 ° C en medio de crecimiento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figura 1. Cronología de la formación del cigoto. Cigotos como un intermedio entre haploides y diploides. Este diagrama muestra la activación clásica (shmooing) de haploides, su fusión, y la formación del brote inicial. Brotes puede ser medial (M), lateral (L) o terminal (T). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Esquemática del protocolo de purificación cigoto. Después de la incubación en la superficie de placas de agar en medio completo con la glucosa, la mezcla de células se recuperaron por lavado y después se somete a una clasificación inicial en &quot;modo de recuperación&quot;, seguido de un segundo tipo en el modo de pureza &quot;. &quot; El color amarillo significa que tanto mCherry y señales de GFP fueron visibles en los cigotos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figura 3. Variedades de cigotos en las mezclas de apareamiento fracciones purificadas. Fueron cosechadas después de 1,75 o 2,5 horas para recuperar las fracciones enriquecidas en cigotos relativamente temprana vs relativamente más madura. Ocho experimentos independientes, designados por los distintos colores, se realizaron para cada punto de tiempo. Los gráficos indican el número relativo de cigotos que haVe espacialmente distintos patrones de formación de yemas. Dada la breve duración de la incubación (menos de 2,5 horas a temperatura ambiente) todos los brotes observados son eventos iniciales en ciernes cigóticos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figura 4. DeltaVision examen de fracciones enriquecidas. Un campo típico fue examinado por microscopía DeltaVision. Las ilustraciones muestran bien los colores rojo y verde o individual. El rojo corresponde a la etiqueta polysomal (Rpl25p-mCherry) y el verde a las buenas prácticas agrarias citosólica. Tenga en cuenta el alto enriquecimiento de cigotos, y las características designadas subcelulares: las vacuolas (v), brotes (b), el núcleo (N), vacuolar &quot;estructura de herencia&quot; (i), y la partición (*) que aparece para separar el parental dominios en cigotos relativamente temprana. Su color general variable refleja la intensidad relativa de los haploides que fusionaron. En los casos en que los dos dominios parentales retienenun color distinto, el equilibrio de los marcadores (GFP citoplasmática, mCherry etiquetados con polisomas) era incompleta. Time-lapse estudios en curso muestran que redistribuye solubles GFP antes de polisomas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . Leyendas complementarias <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Figura S1. La fluorescencia de las células haploides Extremo izquierdo:. Las células que expresan polisomas mCherry-etiquetados fueron examinados para detectar una señal verde. La ventana rectangular se creó para evitar que las células negativas. Medio gráfico: Las células que expresan GFP se analizaron citosólica, que muestra la población mayor claridad brillante de positivos. A la derecha: Las células que expresan polisomas mCherry-etiquetados fueron analizados. El rectángulo (idéntica a la que en el extremo izquierdo) incluye las células más brillantes y permite que todos losnegativos que deben evitarse. La designación &quot;R2&quot; indica el porcentaje de células recuperadas dentro del rectángulo indicado. <img alt="Figura S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figura S2. La distribución de células en la clasificación primero y segundo. Estas parcelas de dos colores indican la proporción de verde + rojo + células en el cuadrante superior derecho (R5). Esta proporción aumenta al 52% en la segunda clase. Eje horizontal: La señal verde. Eje vertical: La señal roja.

<ol><li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerskowitz%2C+I+%22Control+of+cell+type+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Mating+type+and+mating-type+interconversion%22">Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion</a>. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).</li>
<li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li>
<li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li>
<li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li>
<li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li>
<li>Dujon, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDujon%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Yeast+Saccharomyces%3A+Life+Cycle+and+Inheritance%22">Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance</a>. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).</li>
<li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+yeast+mating+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li>
<li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mating%3A+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li>
<li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+mating+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li>
<li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+D+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%2C+2005+Edition%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2005).</li>
<li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li>
<li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+on+the+move%3A+insights+from+yeast+vacuole+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La disponibilidad de los cigotos purificados debería facilitar los estudios bioquímicos incluyendo transcriptómica, proteómica y lipidómica, así como la investigación de los mecanismos por los cuales se someten a cigotos ciclo celular de re-entrada, la remodelación de la pared celular, características de florecimiento y la herencia, etc Alternativamente, los cigotos se podría generar a partir con cepas portadoras de mutaciones características en uno o ambos padres. Además, los cigotos purificados, como para células hapl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo / Equipo </td><td> Fuente </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, que codifica GFP citoplasmática 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, RPL25 codificación fusionado a mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicador </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polipropileno tubo con tapa colador </td><td> BD Falcon </td><td> Ref. 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga refrigerada </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> La citometría de flujo vaina solución </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Reflexión iCyt Modelo Citometría de Flujo </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision deconvolución microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de epifluorescencia vertical </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM formulación glucosa Notas: Para las placas de agar, simplemente incluyen 2% de agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

citometría de flujo basado purificación de<em&gt; s. cerevisiae</em&gt; los cigotos

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Los cigotos son intermediarios esenciales entre haploides y diploides estados en el ciclo de vida de muchos organismos, incluyendo la levadura (Figura 1) 1. S. cerevisiae cigotos resultado de la fusión de células haploides de tipo de apareamiento diferente (MATa, MATalpha) y dan lugar a las correspondientes diploides estables que, sucesivamente, generar tantos como 20 progenie diploide como resultado de sus divisiones mitóticas sorprendentemente asimétricos 2. Formación de cigoto está orquestada por una compleja secuencia de eventos: En este proceso, los factores solubles de acoplamiento se unen a los receptores cognados, provocando mediadas por el receptor cascadas de señalización que facilitan la interrupción del ciclo celular y culminan en la fusión célula-célula. Los cigotos se puede considerar un modelo para progenitor o función de células madre. Aunque se ha aprendido mucho acerca de la formación de cigotos y aunque cigotos se han utilizado para investigar las células moleculares preguntas de interés general sigicance, casi todos los estudios han hecho uso de mezclas de apareamiento en el que los cigotos se entremezclan con una mayoría de la población de células haploides 3-8. Muchos aspectos de la bioquímica de la formación del cigoto y la vida continua del cigoto por lo tanto permanecen sin investigar. Informes de purificación de cigotos levadura describir protocolos basados ​​en sus 9 unidades de sedimentación, sin embargo, este procedimiento sedimentación basada no cedió casi un 90% de pureza en nuestras manos. Además, tiene la desventaja de que las células se exponen a hipertónica sorbitol. Por lo tanto hemos desarrollado un procedimiento de purificación versátil. Para este propósito, pares de células haploides que expresan proteínas fluorescentes rojas o verdes se co-incubaron para permitir la formación de cigoto, se recogieron en diversos momentos, y los zigotos resultantes se purificaron utilizando una citometría de flujo basada en protocolo de clasificación. Esta técnica proporciona una evaluación conveniente visual de la pureza y la maduración. La pureza mediade la fracción es de aproximadamente 90%. De acuerdo con el momento de la cosecha, los cigotos de diferentes grados de madurez se puede recuperar. Las muestras purificadas proporcionar un punto conveniente de partida para &quot;-ómicas&quot; estudios, para la recuperación de la progenie inicial, y para la investigación sistemática de esta célula progenitora.

Para purificar de cigotos<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Las células haploides de tipo de apareamiento opuesto fueron diseñados para expresar proteínas fluorescentes rojas o verdes, co-incubadas para permitir la formación de cigoto, y se fraccionó utilizando una citometría de flujo basado en el protocolo. La fracción altamente enriquecida permite subsiguiente &quot;-ómicas&quot; los estudios, la recuperación de la progenie inicial y la investigación sistemática de la morfogénesis cigoto.

Citometría de flujo basado Purificación de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Los cigotos

Los cigotos son intermediarios esenciales entre los estados haploide y diploide en el ciclo de vida de muchos organismos, incluida la levadura (Figura 1) 1. S. cerevisiae ...

El objetivo general del siguiente experimento es generar una población purificada de zigotos de levadura. Esto se logra primero expresando zonas poli marcadas con GFP citoplasmático o M cherry. En células haploides de tipo de apareamiento opuesto, las células se cultivan hasta la fase logarítmica, luego se combinan e incuban conjuntamente para permitir la formación de zigotos.La mezcla de apareamiento se cosecha y se clasifica mediante citometría de flujo en modo de recuperación para aislar las células doble positivas para rojo y verde. Esta subpoblación incluye tanto entidades prezigóticas como zigóticas. Para purificar aún más la muestra, la población doble positiva para rojo y verde se somete a una segunda ronda de clasificación por citometría de flujo.Utilizando el modo de pureza. Este procedimiento proporciona una pureza promedio del 90 % de cigotos basada en el examen visual y la cuantificación de las células mediante microscopía fluorescente. Las ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como la purificación basada en sedimentación, son las siguientes.Primero, esta técnica proporciona una evaluación visual conveniente de la pureza y maduración del cigoto. Seg

flow-cytometry-based-purification-of-s-cerevisiae-zygotes

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método eficaz para obtener fracciones altamente purificadas meiótica viables de ratón testículos se describe, que combina un refinado protocolo de disociación celular, con la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS). Este método aprovecha las diferencias en el contenido de ADN nuclear y la densidad de las fracciones discretas meióticas.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

Se presenta un dispositivo y un nuevo método para estudiar las células y embriones. Las células individuales se ordenan precisamente en matrices microcavidad. Su confinamiento en 3D es un paso hacia entornos 3D se encuentran en condiciones fisiológicas y permite la orientación orgánulo. Mediante el control de la forma celular, esta configuración reduce al mínimo la variabilidad reportado en ensayos estándar.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Describimos una estrategia de clasificación para espermátidas de ratón utilizando citometría de flujo. Las espermátidas se clasifican en cuatro poblaciones de alta pureza, que incluyen espermatidas redondas (pasos 1-9 de espermiogénesis), de elongación temprana (pasos 10-12 de espermiogénesis), de elongación tardía (pasos 13-14 de espermiogénesis) y elongadas (pasos 15-16 de espermiogénesis). La tinción, el tamaño y la granulosidad del ADN se utilizan como parámetros de selección.

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Mientras que los macrófagos infiltrados son continuamente reclutados en tejidos adultos a partir de precursores circulantes, los macrófagos residentes sembran su tejido durante el desarrollo, donde se mantienen sin más aportación de los progenitores. Recientemente se identificaron los progenitores de macrófagos residentes. Aquí, presentamos métodos para el mapeo de destino genético de los progenitores de macrófagos residentes.

Identificación de progenitores eritromioideos y su progenie en el embrión de ratón por citometría de flujo

Este trabajo describe la estandarización de un método para obtener poblaciones de células germinales purificadas de tejido testicular de diferentes especies de mamíferos. Es un protocolo directo que combina la disociación mecánica de los testículos, la tinción con Hoechst-33342 y el yoduro de propidio, y la clasificación FACS, con amplias aplicaciones en estudios comparativos de la biología reproductiva masculina.

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Este artículo describe un protocolo de citometría de flujo basado en FRET para cuantificar el autoensamblaje de proteínas en células De. cerevisiae y HEK293T.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

Este ensayo es un método simple para cuantificar las células hematopoyéticas en el desarrollo de peces cebra embrionarios. Los glóbulos del pez cebra disociado se someten a análisis de citometría de flujo. Esto permite la detección de defectos sanguíneos en animales mutantes y después de la modificación genética.

Uso de la citometría de flujo para detectar y cuantificar la formación de sangre alterada en el pez cebra en desarrollo

Este artículo presenta un protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala para la caracterización de la proteína Cdr1 cdr1 de Candida albicans ABC (casete de unión a ATP), sobreexpresada en Saccharomyces cerevisiae. Se diseñó una doble etiqueta mGFPHis C-terminal escindible con una etiqueta doble de 16 residuos entre Cdr1 y la etiqueta para facilitar la purificación y la detección de detergente de Cdr1.

Preparación de membrana plasmática a pequeña escala para el análisis de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

Aprende a purificar cigotos de S. cerevisiae mediante citometría de flujo con alta pureza. Este método permite aislar poblaciones de cigotos para estudios de biología celular y transición haploide-diploide.

Citometría de flujo basado Purificación de

Explorar más videos