La purificación y la agregación de la proteína precursora amiloide del dominio intracelular

El objetivo de este procedimiento es purificar el dominio intracelular de la proteína precursora amiloide, también conocida como A ICD, y presentar un protocolo para la agregación térmica y la caracterización de la A ICD mediante microscopía de fuerza atómica. Esto se logra expresando primero la fusión A GST de A ICD en bacterias. A continuación, la proteína G-S-T-A-I-C-D se purifica escindida con trombina para separar el GST del A ICD y se elimina el GST.

A continuación, se induce la agregación térmica de un DCI. Por último, se obtienen imágenes de los agregados de A ICD mediante microscopía de fuerza atómica. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que el ICD A se puede purificar hasta obtener una homogeneidad en cantidad suficiente para el análisis bioquímico y biofísico.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, que requieren pasos complejos de cromatografía, es que es altamente pura y soluble. Un desfibrilador cardioversor implantable se puede aislar en la mesa de trabajo utilizando reactivos y equipos estándar. Un desfibrilador cardioversor implantable producido por este protocolo es adecuado para una mayor caracterización bioquímica y biofísica.

La demostración del procedimiento será Amina ti. Un antiguo postdoc de mi laboratorio, el Dr. Andres Oberer, demostrará cómo realizar la obtención de imágenes de microscopía de fuerza atómica de un DCI para expresar el dominio intracelular recombinante A PP o un DCI. Comience con las células BL 21 transformadas con el vector pgx 41, albergando el ICD A humano fusionado con el extremo C de GST con una sola colonia, inocule 10 mililitros de caldo LB con ampicilina e incube durante la noche a 37 grados Celsius con un fuerte batido a la mañana siguiente.

Incubar 400 mililitros de ampicilina LB en un matraz de un litro con cinco mililitros de cultivo durante la noche. Incubar a 37 grados centígrados con agitación vigorosa hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros haya alcanzado 0,4 a 0,6. Esto normalmente tomará de dos a 2,5 horas para inducir la expresión de G-S-T-A-I-C-D.

Añadimos 0,4 milimolar de IPTG e incubamos a 37 grados centígrados con una agitación vigorosa durante cinco horas. Centrifugar las células a 6.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y almacenar el pellet a menos 80 grados centígrados. Después de preparar la lisis, el tampón y arrojar las bacterias en el hielo, agregue 20 mililitros de tampón al pellet y use una combinación de vórtice y tación en hielo con una pipeta a fondo.

Reese suspende el pellet bacteriano pasa el lisado bacteriano suspendido Reese a través de un emulsionante preenfriado o prensa francesa. A 30.000 PSI, pase el lisado a través del emulsionante por segunda vez y recoja el lisado en un tubo preenfriado de 50 mililitros. Centrifugar el lisado a 15.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 30 minutos.

Separe y transfiera el supinato a un tubo preenfriado de 50 mililitros. Agregue 500 microlitros de una suspensión al 50% de glutatión rosa. Gire durante 30 minutos a cuatro grados centígrados mientras la muestra gira.

Prepare un tampón de elución fresco después de la incubación. Vierta el lisado y la suspensión en una columna de cromatografía de poliestireno desechable de cinco pulgadas con filtros gruesos. Lave la columna cinco veces con tres mililitros de PBS.

Tape la parte inferior de la columna y agregue 500 microlitros de tampón de elución a temperatura ambiente. Tape la parte superior de la columna y gírela durante cinco minutos a temperatura ambiente. Recoja el peso inicial en un tubo de microrresiduos refrigerado de 1,5 mililitros.

Repita la elución dos veces más. Diálisis del eluido en una membrana de diálisis de corte de 10.000 pesos moleculares en cuatro litros de PBS durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Diálisis con cuatro litros adicionales de PBS a cuatro grados centígrados durante una hora.

Extraiga la proteína del casete de diálisis y realice un ensayo de cuantificación de proteínas para determinar el rendimiento de G-S-T-A-I-C-D. Una purificación típica de 400 mililitros de cultivo dará como resultado rendimientos de más de 20 miligramos de proteína purificada en concentraciones de 10 a 20 miligramos por mililitro. Alicuota la proteína en 200 microlitros, alícuotas y congelación de menos 80 grados centígrados.

Para liberar el ICD A del deshielo del GST, se incuban 200 microlitros de G-S-T-A-I-C-D purificado y se añaden 20 microliberaciones de una unidad por microlitro de trombina durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente, se aclara cualquier material agregado por centrifugación a 20.000 veces G durante 30 minutos de cuatro grados centígrados. Transfiera el SUPINATE a un microtubo preenfriado para eliminar el GST y la trombina. Añadir 50 microlitros de purín al 50% de glutatión aro y 50 microlitros de purín 50% de glutatión aro respectivamente.

Incubar con rotación durante cinco minutos a temperatura ambiente. Centrifugar brevemente para sedimentar las perlas agrícolas y retirar el supinato en un tubo nuevo. Extraiga el GST cuatro veces más con glutatión.

Aros realiza un ensayo de cuantificación de proteínas en cinco microlitros del A ICD purificado. Los rendimientos típicos de un cultivo de 400 mililitros son de 50 a 100 microgramos a una concentración de 0,2 a 0,5 miligramos por mililitro. Después de diluir el DCI A recién preparado en PBS a una concentración de 0,1 miligramos por mililitro, indujo la agregación térmica incubando las muestras a 43 grados Celsius a 800 RPM en un agitador calentado durante 48 horas.

Diluir la muestra 20 veces con agua desionizada y colocar dos microlitros sobre la recién cortada. La mica seca la muestra en un desecado durante la noche para visualizar el ICD A agregado Utilice microscopía de fuerza atómica en modo de golpeteo con perilla de oro. Voladizos de nitruro micro afilados con un radio de punta nominal de dos nanómetros.

Amplitudes típicas de golpeteo durante la toma de imágenes, de 10 a 20 nanómetros a la frecuencia de resonancia de los voladizos. Aquí se muestra la expresión y el enriquecimiento relativo de G-S-T-A-I-C-D. Después de la lisis, la mayor parte de la proteína de fusión está presente en la fracción soluble y, por lo tanto, no se requiere la extracción de los cuerpos de inclusión.

El material aludido de la columna de glutatión surgida tiene una pureza superior al 95%. En la preparación que se muestra aquí, la concentración de proteína aludida de la columna fue de 14,5 miligramos por mililitro y el rendimiento fue de 22 miligramos. La escisión de 200 microlitros de esta preparación durante la noche con 20 unidades de trombina dio como resultado una escisión de casi el 100% de la proteína de fusión.

La cantidad de trombina utilizada es lo suficientemente baja como para no ser detectable por kumasi. La tinción azul, la eliminación de la trombina y el GST dieron lugar a cierta pérdida de material. Sin embargo, tenía una pureza superior al 90% con un rendimiento en esta preparación de 70 microgramos de A ICD a una concentración de 0,35 miligramos por mililitro.

Los agregados de un ICD, fotografiados por un FM, suelen ser esteroides amorfos y varían en tamaño de 50 a 100 nanómetros. El material agregado no es detectable cuando se agrega una cantidad equimolar de la chaperona UBI Quillin one a la reacción de agregación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo purificar EICD inducir su agregación y agregar imágenes a la bahía A-F-M-E-I-C-D.

La purificación por esta técnica se puede aplicar a otros métodos, como la dispersión de luz y los ensayos de trampa de filtro, para responder preguntas sobre el efecto de las chaperonas moleculares en la agregación de EACD.