El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

El objetivo general de este procedimiento es aislar núcleos de cardiomiocitos a partir de tejido post mortem. Esto se logra primero homogenizando el tejido con un homogenizador de sonda y un vaso de vidrio, seguido de varios pasos de filtración. El segundo paso consiste en aislar la fracción nuclear de las demás fracciones celulares mediante centrifugación por sedimentación de densidad.

A continuación, los núcleos de cardiomiocitos se marcan mediante inmunomarcado con un anticuerpo dirigido contra PCM1. El paso final consiste en aislar los núcleos de cardiomiocitos marcados mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Finalmente, justo antes de cualquier manipulación posterior, se confirma la pureza de los núcleos de cardiomiocitos mediante un nuevo análisis de las fracciones nucleares ordenadas.

La principal ventaja de esta técnica es que los núcleos de cardiomiocitos pueden analizarse igualmente bien a partir de tejido fresco o de tejido archivado congelado, de manera de alto rendimiento. Los estudios basados en ADN en cardiomiocitos son especialmente difíciles por varias razones. En primer lugar, los cardiomiocitos solo constituyen aproximadamente del 20 al 30 % de las células en el corazón.

Además, son en gran medida nucleados. Asimismo, los cardiomiocitos son en gran medida poliploides. Este método descrito aquí supera todos estos obstáculos.

Antes de comenzar el procedimiento, recubra los tubos de ultracentrífuga con 10 mililitros de una solución de recubrimiento de BSA al 1% más PBS. Después de rotar los tubos durante 30 minutos, retire la solución de recubrimiento y deje que sequen al aire.

Comience el procedimiento de aislamiento de núcleos cardíacos utilizando un escalpelo para diseccionar el ventrículo izquierdo de un corazón de ratón congelado rápidamente. Corte la muestra diseccionada en segmentos pequeños y luego transfiera los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 15 mililitros de tampón de lisis. A continuación, homogenice el tejido cardíaco con un homogenizador de sonda a 24.000 RPM durante 10 segundos, y luego diluya el homogenato con un volumen igual de tampón de lisis hasta completar 30 mililitros. Transfiera el homogenato a un homogenizador de vidrio tipo Dounce, utilizando ocho pasadas con un pistilo de gran holgura para liberar los núcleos.

Luego pase los núcleos crudos. Aíslelos primero a través de un filtro celular de 100 micrones y después a través de un filtro celular de 70 micrones hacia un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Ahora centrifugue el aislado de núcleos crudos durante 10 minutos a 700 ×g y 4 °C.

Invierta el tubo para retirar cuidadosamente el sobrenadante y luego limpie el interior del tubo con una toalla de papel, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento de núcleos. Pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspender los núcleos crudos.

Aisle en cinco mililitros de tampón de sacarosa y luego agregue otros 25 mililitros de tampón de sacarosa a la suspensión de núcleos. A continuación, agregue 10 mililitros de tampón de sacarosa recién preparado a uno de los tubos de ultracentrífuga recubiertos previamente preparados. Luego, superponga cuidadosamente el tampón con la solución del pellet de núcleos resuspendidos.

Después de equilibrar el tubo en un rotor de giro libre, coloque el rotor en una centrífuga de alta velocidad y centrifugue la muestra de núcleos durante 60 minutos a 13.000 ×g y 4 °C. Cuando finalice la centrifugación, retire cuidadosamente los tubos del rotor e inviértalos nuevamente. Para desechar el sobrenadante, limpie los restos residuales del interior del tubo con una toalla de papel como antes, y luego resuspenda el sedimento de núcleos en un mililitro de tampón de almacenamiento de núcleos.

Antes de comenzar el procedimiento de tinción inmunohistoquímica, transfiera una alícuota de 20 microlitros de la muestra de núcleos a un tubo fax. Añada 980 microlitros de tampón de almacenamiento de núcleos a la alícuota y etiquete el tubo como control negativo. A continuación, añada el anticuerpo anti-PCM1 a la muestra de núcleos y a los tubos de control negativo en una dilución de 1:500.

Luego, incubar ambos tubos a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, después de lavar los tubos con el tampón de almacenamiento de núcleos y descartar el sobrenadante, suspender los pellets de núcleos en otro mililitro de tampón de almacenamiento de núcleos.

Luego, agregue el anticuerpo secundario fluorescente antirrábico a las muestras celulares en una dilución de uno a 100 e incube durante una hora a cuatro grados Celsius. Después de lavar los tubos con tampón de almacenamiento de núcleos, resuspenda los pellets en un mililitro de tampón de almacenamiento de núcleos para el ordenamiento y análisis citométrico de flujo tras recubrir los núcleos y los tubos de recolección con BSA y PBS como al comienzo del video; comience filtrando la muestra y el control negativo a través de filtros celulares individuales de 30 micrones. Justo antes de cargar, agregue un colorante de ADN.

Añada una dilución de uno a 500 para la identificación de las poblaciones nucleares. Cargue el control negativo en el citómetro de flujo. Utilice los parámetros de dispersión directa y lateral para establecer la primera compuerta que defina los núcleos cardíacos, de forma similar al diagrama de puntos mostrado aquí.

Luego, utilice los parámetros de dispersión directa y ancho de pulso de dispersión directa para crear una segunda compuerta alrededor de los núcleos en singletes, similar al gráfico DOT que se muestra aquí. Ahora cargue la muestra marcada con inmunofluorescencia y coloque una tercera compuerta para diferenciar los núcleos de cardiomiocitos positivos para PCM1 de los núcleos de no cardiomiocitos negativos para PCM1. Utilice la tinción nuclear de ADN para analizar el contenido de ADN y realizar un análisis del ciclo celular, similar al análisis ilustrado por este histograma.

Después de clasificar los núcleos según su positividad para PCM1, coloque los núcleos clasificados en hielo y vuelva a analizar una alícuota de cada muestra clasificada para determinar la pureza del clasificación. Finalmente, centrifugue los núcleos clasificados en sus tubos de recolección durante 15 minutos a 1500 ×g y 4 °C. Tras desechar los sobrenadantes, re suspenda los pellet de núcleos en un tampón compatible con la aplicación posterior deseada.

En esta primera figura, un corazón de ratón adulto fue teñido con un colorante nuclear y con anticuerpos contra PCM1, el factor de transcripción cardíaco murino NKX2.5 y la cadena pesada de miosina o MHC. Aquí se muestra un acercamiento de la superposición de la figura anterior. Observe cómo los núcleos marcados con PCM1 en blanco expresan el factor de transcripción NKX2.5 en rojo y están rodeados por el citoplasma de los cardiomiocitos en verde.

Estos datos en conjunto demuestran la precisión con la que la tinción de PCM uno identifica los núcleos de los cardiomiocitos. El recuadro resalta el patrón de tinción epinuclear de PCM uno en los núcleos de los miocitos, tal como se indica además mediante las flechas en el experimento representado en las siguientes tres figuras, en las que se tiñeron aislamientos de núcleos cardíacos con el colorante de ADN DRAC cinco y con anticuerpos contra PCM uno. Aquí, la superposición de las dos figuras anteriores, las flechas resaltan nuevamente el patrón de tinción epinuclear de PCM uno en los núcleos de cardiomiocitos aislados.

Este diagrama de puntos demuestra que aproximadamente el 30 % de los núcleos aislados mediante este método son núcleos de cardiomiocitos, como lo indica su marcado con PCM uno. Por último, como ilustran estos histogramas, los núcleos de cardiomiocitos de ratón son principalmente diploides, indicado por el pico de dos N, y solo un pequeño subconjunto es tetraploide, indicado por el pico más pequeño de cuatro N. Una de las ventajas de esta técnica es que puede adaptarse fácilmente a otras especies.

Como en los seres humanos.