Reducción de la interfaz de Bio-electrónica con Biofabrication

El objetivo general del siguiente experimento consiste en depositar eléctricamente películas de biopolímeros y funcionalizarlas con componentes biológicos como proteínas y células. El electrodepósito se logra aprovechando el cambio de pH que ocurre localmente en un electrodo polarizado en combinación con una solución de polisacárido sensible al pH. Tras elegir una estrategia de deposición catódica o anódica, se aplica un voltaje al electrodo para inducir una transición sol-gel, lo que genera una película delgada con un patrón definido por la geometría del electrodo.

Además, se pueden introducir componentes biológicos como proteínas y células durante todo el proceso de deposición del electrodo. Con el fin de funcionalizar biológicamente la película, se obtienen resultados que muestran que los componentes biológicos se localizan en las películas según imágenes de fluorescencia. Asimismo, los componentes son funcionales y capaces de interactuar con su entorno, como se demuestra mediante la detección electroquímica de la actividad enzimática y el uso de la respuesta de células indicadoras.

La biofabricación proporciona una caja de herramientas novedosa para construir la interfaz entre la biología y la electrónica. Consideramos que sus principales ventajas son su simplicidad y su capacidad para ensamblarse en condiciones cercanas a las fisiológicas. La biología es experta en la fabricación a escala nanométrica mediante autoensamblaje y procesos enzimáticos. Al aprovechar estas capacidades, evitamos métodos de síntesis complejos, peligrosos y que consumen mucho tiempo, los cuales son utilizados por otras técnicas de ensamblaje.

Nuestro equipo colaborativo tuvo la idea de construir la interfaz del dispositivo BioD utilizando materiales y mecanismos biológicos cuando observamos que sus cometas podían ser depositadas por electrodo. El kitan es un polisacárido formador de películas sensible al pH que puede reconocer las señales eléctricas impuestas por el dispositivo y depositarse como una película delgada. Una vez que vimos que el kitan podía depositarse por electrodo, comprendimos que podríamos acceder a un conjunto más amplio de herramientas de la bioquímica y la biología molecular para construir una interfaz de dispositivo BioD.

La aplicación de dicha técnica se extiende hacia entornos de laboratorio en un chip donde se requieren componentes biológicos funcionales, ya que proporcionan una forma económica y sencilla de localizar tales componentes en un electrodo donde pueden permanecer viables. La demostración visual de este método es fundamental, ya que una película biofabricada puede estar dedicada y dañarse fácilmente. Por ello, se debe tener cuidado de no ser demasiado brusco al lavar o manipular la película.

Dado que la película podría denominarse fácilmente perturbada. Sin embargo, como ventaja, los electrodos pueden reutilizarse porque la película se elimina fácilmente. Para comenzar este protocolo, conecte una fuente de alimentación a los electrodos fabricados personalizados mediante cables de conexión utilizando pinzas tipo cocodrilo.

Un portaobjetos de vidrio recubierto con óxido de indio y estaño, o ITO, actuará como ánodo o electrodo de trabajo; una lámina de platino servirá como cátodo o electrodo auxiliar. Coloque los electrodos de manera que la superficie del ITO que se va a funcionalizar quede frente al electrodo auxiliar, de forma que la superficie del ITO esté posicionada ya sea verticalmente para sumergirla en la solución o horizontalmente, de modo que la solución pueda contenerse sobre la superficie. A continuación, prepare una solución de deposición de alginato mezclando alginato al 1 % y carbonato de calcio al 0,5 % en agua destilada y autoclavando la mezcla. Luego, marque el alginato con fluorescencia utilizando esferas fluoradas mediante mezcla y vortexado.

Esto permitirá la obtención de imágenes de fluorescencia de la película resultante. Después de la autoclave, sumerja ambas electrodos en la solución de deposición preparada y aplique una densidad de corriente constante de tres amperios por metro cuadrado durante dos minutos. El voltaje variará en el rango de dos a tres voltios. Después de dos minutos, desconecte el electrodo y retire la solución con los depósitos no adheridos. Enjuague suavemente la película con cloruro de sodio para eliminar el alginato excesivo.

Incube brevemente la película en cloruro de calcio 0,1 molar para reforzar el gel. A continuación, incube la película en la solución de almacenamiento deseada. Proceda a obtener imágenes de la película mediante microscopía de fluorescencia antes de la coposición.

Cultive una cultura celular de células emisoras de señales y una cultura celular de células receptoras de señales según lo indicado en el protocolo escrito que acompaña a este video. A continuación, prepare una solución de deposición de alginato y carbonato de calcio. Mezcle la solución con cada cultura celular en una proporción uno a uno hasta una concentración final de 1% de alginato y 0,5% de carbonato de calcio, con las células diluidas a aproximadamente la mitad de la densidad de cultivo.

Utilice un portaobjetos de vidrio con un patrón de dos electrodos de ITO contenidos en un pozo de silano de poli dimetilo y un electrodo de platino como contrapunto. Conecte un electrodo de ITO y el electrodo de platino a una fuente de alimentación. Como antes, sumerja los electrodos en la solución de deposición que contiene las células receptoras.

Configure la fuente de alimentación para mantener una corriente constante con una densidad de tres amperios por metro cuadrado, donde la dimensión del área superficial está definida por el electrodo individual sobre el cual ocurrirá la deposición. Aplique la corriente durante dos minutos para permitir la codeposición de las células en la matriz de alginato. Enjuague la película con cloruro de sodio como antes, e invierta la conexión antic al electrodo adyacente de ITO.

Repita el procedimiento de deposición, pero esta vez introduzca la solución que contiene las células donadoras. Incube durante la noche a 37 grados Celsius en solución salina tamponada con fosfato el chip con dos electrodos que contiene las células codepositadas y arginato de calcio.

Suplementado con medio LB al 10 % y cloruro de calcio de un milimolar. Después de la incubación, image el chip utilizando un microscopio de fluorescencia para iniciar el depósito del electrodo de quitosano. Conecte la fuente de alimentación a los electrodos.

Coloque las pinzas cocodrilo. Un chip de silicio recubierto de oro actuará como cátodo y una lámina de platino servirá como ánodo. Coloque la superficie del electrodo de oro de manera que deposite el electrodo contrario como antes.

Prepare una solución de arena Kato mezclando escamas de arena Kato en agua y agregando lentamente ácido clorhídrico dos molar para disolver los polisacáridos. Siguiendo el procedimiento mencionado en el texto, la solución de arena Kato puede marcarse con fluorescencia para visualizar la película depositada sobre el electrodo mediante microscopía de fluorescencia. A continuación, coloque los electrodos en la solución de kaizan, sumergiendo completamente el área deseada para la deposición.

Durante dos minutos, aplique una corriente constante calculada a una densidad de cuatro amperios por metro cuadrado en función del área superficial del electrodo de trabajo. En este caso, se aplica una corriente de 16 microamperios a un electrodo de oro de cuatro milímetros cuadrados; el voltaje se desplazará dentro del rango de dos a tres voltios tras enjuagar el electrodo con agua desionizada para eliminar el quitosano en exceso. Proceda a obtener una imagen de la película mediante un microscopio de fluorescencia, copos de quitosano y glucosa oxidasa a partir de una solución a una densidad de corriente de cuatro amperios por metro cuadrado sobre un electrodo estructurado.

De acuerdo con el procedimiento de deposición del electrodo de quitosano, se generará una película de kaizan atrapada con glucosa oxidasa. Sujete el electrodo tratado a un sistema de tres electrodos como electrodo de trabajo, un alambre de platino como electrodo auxiliar y plata/cloruro de plata como electrodo de referencia, e introduzca los electrodos en una solución tampón de fosfato que contiene cloruro de sodio. Conjugue electroquímicamente la proteína a la película de Kazam aplicando un voltaje constante durante 60 segundos mediante cronopirómetría tras la conjugación.

Coloque el chip en tampón fosfato y lávelo durante 10 minutos en un agitador orbital para eliminar cualquier cloruro de sodio no reaccionado y glucosa oxidasa no conjugada. Vuelva a colocar el sistema de tres electrodos y sumerja una solución de glucosa cinco milimolar. Luego, establezca los parámetros deseados para la voltametría cíclica con el fin de barrer el potencial en dirección positiva hasta 0,7 voltios.

Retire los electrodos de la solución de glucosa y enjuague con tampón fosfato. Luego coloque los electrodos en un vaso de precipitados de 10 mililitros que contenga ocho mililitros de tampón fosfato sobre una placa agitadora magnética con inclinación. Ajuste el chip funcionalizado con GOX a 0,6 voltios para que sirva como electrodo de trabajo.

Después de ajustar los parámetros deseados, recolecte una grabación de línea base. Añada alícuotas de glucosa al tampón para aumentar la concentración de glucosa en cuatro milimolares por cada alícuota. En este experimento, se añaden alícuotas de 400 microlitros de glucosa 80 milimolar al tampón. Correlacione la señal de corriente con cada concentración de glucosa para generar una curva patrón. Para realizar la funcionalización de proteínas, utilice un portaobjetos de vidrio con un electrodo de oro y otro de ITO dispuestos adyacentemente, contenido dentro de A-P-D-M-S.

Polarice adecuadamente el electrodo de oro con un potencial catódico para depositar electrolíticamente tizen como se mostró previamente. Después de enjuagar la película, agregue una solución de sintasa del autoinductor dos marcada con fluorescencia azul, suplementada con tirosinasa. Incube durante una hora a temperatura ambiente.

Lave la película con PBS como antes, aplique un potencial anódico al electrodo de ITO sumergido en una solución de deposición de alginato que contenga células receptoras. Continúe con los mismos pasos descritos en la codeposición de poblaciones celulares en alginato para generar la señal transmitida enzimáticamente. Después de lavar las películas, agregue una solución de cinco micromolar, SAH y PBS suplementada con medio LB al 10% y un milimolar.

El cloruro de calcio cubre los electrodos para evitar la evaporación de la solución e incubar durante la noche a 37 grados Celsius. Esto permitirá una respuesta en las células receptoras mediante la generación de una proteína fluorescente roja DS red; los electrodos adyacentes pueden observarse mediante microscopía de fluorescencia ajustando los filtros para capturar la fluorescencia azul del inductor también sintetasa y la fluorescencia roja expresada por las células receptoras reclutadas. Las señales eléctricas impuestas pueden crear microentornos localizados cerca de la superficie del electrodo, y estos estímulos pueden desencadenar el autoensamblaje de polisacáridos como el alginato y el razan, que se depositan como una película de hidrogel sobre la superficie del electrodo.

Dado que esta transición sol-gel ocurre en la superficie del electrodo, la película resultante queda electrodirigida con una geometría que coincide con el patrón del electrodo. Mediante el uso de alginato, se han coprecipitado poblaciones celulares únicas en direcciones separadas. La evidencia de su direccionamiento electrodo se observa tras la interacción entre la población celular emisora y la receptora.

La molécula autoinductora dos difunde desde las células emisoras y es captada por las células receptoras, lo que resulta en la expresión de la proteína fluorescente DS roja. Aquí, se observa fluorescencia roja únicamente en el electrodo donde se dirigen las células receptoras. Por el contrario, la enzima biosensora glucosa oxidasa proporciona la capacidad de detección de glucosa mediante una reacción enzimática al producir peróxido de hidrógeno, el cual luego puede oxidarse electroquímicamente para generar una corriente de salida.

De esta manera, una señal química puede transducirse en una eléctrica. Este gráfico muestra que las películas en las que Geo X se conjugó químicamente producen una señal antagónica fuerte en presencia de glucosa, a diferencia de aquellas películas que no contienen Geo X. Estos resultados indican que Geo X puede ensamblarse sobre una película de zam depositada y además retener actividad catalítica. Asimismo, se produce un aumento escalonado en una corriente ótica en respuesta a concentraciones crecientes de glucosa.

La curva patrón también presentada muestra que los incrementos siguieron una progresión casi lineal, dependiente de la cantidad de glucosa añadida. Estos resultados indican que la enzima conserva su sensibilidad tras la conjugación con la película Razza, tal como se muestra aquí; la síntesis I dos incluye una etiqueta de penta tirosina. La tirosinasa actúa sobre la etiqueta de tirosina, oxidando los grupos fenólicos de los residuos a o-quinonas, que luego se unen covalentemente a las aminas de Kazam. Se observa evidencia de la funcionalización de la película Kazam mediante el ensamblaje de la síntesis I dos por tirosinasa en esta imagen de fluorescencia, que muestra una película de kaza sobre oro, donde la síntesis I dos funcionalizada ha sido marcada fluorescentemente en azul. Dado que la síntesis I dos genera I dos a partir del sustrato SAH de la misma manera que las células emisoras, su proximidad a células receptoras reclutadas en presencia de SAH también provoca que dichas células receptoras respondan fluorescentemente mediante la expresión de ds.

La fluorescencia roja de las células receptoras nuevamente demuestra la interacción entre direcciones debido a la difusión de ai, dos desde una hasta la otra, e indica además que las 10 enzimas inmovilizadas en tizen conservan su actividad una vez unidas covalentemente. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo electrodepositar películas de polisacáridos y cómo funcionalizarlas utilizando diversas técnicas. Hemos demostrado la versatilidad de estos pasos de funcionalización, lo que nos permite trabajar con una multitud de componentes biológicos en pruebas posteriores.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tan solo unos minutos para generar patrones de película bien definidos sobre los cuales se pueden injertar con precisión componentes biológicos. De este modo, podemos generar de manera muy sencilla superficies biológicamente estructuradas y activas sobre electrodos designados, todo ello de forma organizada y aun así capaz de lograr interacciones biológicas complejas. Tras seguir este procedimiento, se puede emplear la creatividad tanto en el diseño del arreglo electroquímico como en la selección de los componentes biológicos para lograr la interacción deseada.

Nuestra esperanza es que las herramientas de biofabricación sirvan de puente entre dos campos dispares, la biotecnología y la microelectrónica, cada uno de los cuales ha revolucionado por separado nuestras vidas. Al interconectar estos dos campos, creemos que crearemos nuevas soluciones para algunos de los problemas más urgentes de la sociedad. Por ejemplo, anticipamos que la biofabricación podría proporcionar métodos sencillos y versátiles para nuevas formas de detección, en el punto de atención, diagnóstico de enfermedades y detección de amenazas biológicas y químicas.

Un ejemplo de gran alcance podría ser que el stent arterial de la próxima generación también pudiera monitorizar su perfil metabólico, además de mantener abierta la arteria.