Reducción de la interfaz de Bio-electrónica con Biofabrication

El objetivo general del siguiente experimento es depositar eléctricamente películas biopoliméricas y funcionalizarlas con componentes biológicos como proteínas y células. La electrodeposición se logra aprovechando el cambio de pH que se produce localmente en un electrodo polarizado en combinación con una solución de polisacárido sensible al pH. Al elegir una estrategia de deposición catártica o anódica, el electrodo está sesgado para desencadenar una transición de gel de alma, que genera una película delgada que tiene un patrón definido por la electrogeometría.

Además, se pueden introducir componentes biológicos como proteínas y células a lo largo del proceso de deposición de electrodos. Con el fin de funcionalizar biológicamente la película, se obtienen resultados que muestran que los componentes biológicos se localizan en las películas mediante imágenes de fluorescencia. Además, los componentes son funcionales y capaces de interactuar con su entorno, lo que se demuestra mediante la detección electroquímica de la actividad enzimática y el uso de la respuesta de la célula indicadora.

La biofabricación proporciona una nueva caja de herramientas para construir la interfaz entre la biología y la electrónica. Creemos que sus principales ventajas son su simplicidad y su capacidad para ensamblarse en condiciones casi fisiológicas. La biología es experta en la fabricación a nanoescala a través de autoensamblaje y medios enzimáticos. Al aprovechar estas capacidades, evitamos los métodos de síntesis complejos, peligrosos y lentos que utilizan otras técnicas de ensamblaje.

Nuestro equipo colaborativo tuvo la idea de construir la interfaz del dispositivo BioD utilizando materiales y mecanismos biológicos cuando observamos que sus cometas podían ser depositadas por electrodos. Kitan es un polisacárido formador de película sensible al pH que puede reconocer las señales eléctricas impuestas por el dispositivo y depositar como una película delgada. Una vez que vimos que el kitan podía ser depositado por electrodo, nos dimos cuenta de que podíamos acceder a un conjunto más amplio de herramientas de bioquímica y biología molecular para construir una interfaz de dispositivo BioD.

La aplicación de dicha técnica se extiende hacia la configuración de chips de labón donde se requieren componentes biológicos funcionales, ya que proporcionan una forma barata y fácil de localizar dichos componentes en un electrodo donde pueden permanecer viables. La demostración visual de este método es fundamental, ya que una película de fabricación biológica puede dedicarse y dañarse fácilmente. Como tal, hay que tener cuidado de no ser demasiado duro al lavar o filmar la película.

Como podría denominarse la película, fácilmente perturbable. Sin embargo, como ventaja, los electros se pueden reutilizar porque la película se retira fácilmente. Para comenzar este protocolo, conecte una fuente de alimentación a los electrodos fabricados a medida a través de cables de conexión con pinzas de cocodrilo.

Un portaobjetos de óxido de indio y estaño o vidrio recubierto de ITO actuará como ánodo o electrodo de trabajo, la lámina de platino servirá como cátodo o contraelectrodo, posicione el electrodo de modo que la superficie del IT o que se va a funcionalizar se oponga al contraelectrodo de manera que la superficie del IT O se coloque verticalmente para sumergirse en la solución u horizontalmente, de tal manera que la solución pueda ser contenida en la superficie. A continuación, prepare una solución de deposición de alginato mezclando 1% de alginato y 0,5% de carbonato de calcio en agua destilada y esterilizando la mezcla en autoclave. A continuación, marque fluorescentemente el alginato con esferas de flúor mezclándolo y vórtice.

Esto permitirá la obtención de imágenes de fluorescencia de la película resultante Después de la esterilización en autoclave, la solución sumerge ambos electrodos en la solución de deposición preparada y aplica una densidad de corriente constante de tres amperios por metro cuadrado durante dos minutos. El voltaje cambiará en el rango de dos a tres voltios Después de dos minutos, desconecte el electrodo y retire la solución sin depósitos. Enjuague suavemente la película con cloruro de sodio para eliminar el alginato superfluo.

Incubar la película brevemente en cloruro de calcio 0,1 molar para fortalecer el gel. A continuación, la película se incuba en la solución de almacenamiento deseada. Proceda a obtener imágenes de la película utilizando microscopía de fluorescencia antes de la codeposición.

Cultive un cultivo de células emisoras de señal y un cultivo de células receptoras de señal como se indica en el protocolo escrito que acompaña a este video. A continuación, prepare una solución de deposición de alginato y carbonato de calcio. Mezcle la solución con cada cultivo celular en una proporción de uno a uno hasta una concentración final de 1% de alginato y 0,5% de carbonato de calcio con las células diluidas hasta aproximadamente la mitad de la densidad de cultivo.

Utilice un portaobjetos de vidrio con dos electrodos ITO contenidos por un pocillo de polidimetilsilano y un contraelectrodo de platino. Conecte un electrodo ITO y el electrodo de platino a una fuente de alimentación. Como antes, sumerja los electrodos en la solución de deposición que contiene las celdas receptoras.

Ajuste la fuente de alimentación a una corriente constante a una densidad de tres amperios por metro cuadrado, donde la dimensión del área de superficie está definida por el electrodo único en el que se producirá la deposición. Aplique la corriente durante dos minutos para permitir la codeposición de las células en la matriz de alginato. Enjuague la película con cloruro de sodio como antes, cambie la conexión antic al electrodo ITO adyacente.

Repita el procedimiento de deposición, pero esta vez. Presentamos la solución que contiene las celdas emisoras. Incubar el chip de dos electrodos que contiene las células codepositadas y el argenato de calcio durante la noche a 37 grados centígrados en solución salina tamponada con fosfato.

Suplementado con un medio de 10% lb y un milimolar de cloruro de calcio. Después de la incubación, obtenga imágenes del chip con un microscopio de fluorescencia para comenzar la deposición del electrodo de quitosano. Conecte la fuente de alimentación a los electrodos.

Pinzas de cocodrilo de fuego. Un chip de silicona recubierto de oro actuará como cátodo y una lámina de platino servirá como ánodo. Coloque la superficie del electrodo de oro de modo que deposite el contraelectrodo como antes.

Prepare una solución de arena Kato mezclando copos de arena Kato en agua y agregando lentamente dos molares de cloruro de hidrógeno para disolver los polisacáridos. Siguiendo el procedimiento al que se hace referencia en el texto, la solución de arena Kato se puede marcar con fluorescencia para obtener imágenes de la película depositada por el electrodo mediante microscopía de fluorescencia. Los electrodos se introducen en la solución de kaizan sumergiendo completamente el área deseada para la deposición.

Durante dos minutos, aplique una corriente constante calculada a una densidad de cuatro amperios por metro cuadrado en función del área de superficie de los electrodos de trabajo. En este caso, se aplica una corriente de 16 microamperios a un electrodo de oro cuadrado de cuatro milímetros cuadrados, el voltaje cambiará dentro del rango de dos a tres voltios después de enjuagar el electrodo con agua desionizada para eliminar el quitosano superfluo. Proceda a obtener imágenes de la película utilizando un microscopio de fluorescencia, copos quitosano y glucosa oxidasa de una solución a una densidad de corriente de cuatro rampas por metro cuadrado en un electrodo patrón.

De acuerdo con el procedimiento de deposición de electrodos de quitosano, se generará una película de kaizan atrapada con glucosa oxidasa. Conecte el electrodo tratado a un sistema de tres electrodos como electrodo de trabajo, un alambre de platino como contraelectrodo y plata, cloruro de plata como electrodo de referencia, sumerja los electrodos en una solución tampón de fosfato que contenga cloruro de sodio. Conjugar electroquímicamente la proteína a la película Kazam aplicando un voltaje constante durante 60 segundos utilizando cronoproterometría después de la conjugación.

Coloque el chip en un tampón de fosfato y lávelo durante 10 minutos en un agitador orbital para eliminar el cloruro de sodio no reactivo y la glucosa oxidasa no conjugada. Vuelva a colocar el sistema de tres electrodos y sumerja una solución de glucosa de cinco milimolares. A continuación, configure los parámetros de deseo para la telemetría de volumen cíclico para barrer el potencial en una dirección positiva a 0,7 voltios.

Retire los electrodos de la solución de glucosa y enjuague con tampón de fosfato. A continuación, coloque los electrodos entre un vaso de precipitados de 10 mililitros que contiene ocho mililitros de tampón de fosfato en una placa de agitación magnética. El chip funcionalizado GOX a 0,6 voltios para que sirva como electrodo de trabajo.

Después de establecer los parámetros de deseo, recopile una grabación de referencia. Agregue alícuotas de glucosa al tampón para aumentar la concentración de glucosa en cuatro milimolares por cada alícuota En este experimento, se agregan 400 alícuotas de microlitros de 80 milimolares de glucosa al tampón. Correlacionar la salida de corriente a cada concentración de glucosa Para generar una curva estándar para realizar la funcionalización de proteínas, utilice un portaobjetos de vidrio con un patrón con un electrodo adyacente de oro e ITO contenido dentro de A-P-D-M-S.

Sesgar bien el electrodo de oro con un potencial catártico para depositar el electrodo tizen como se muestra anteriormente. Después de enjuagar la película, agregue una solución de autoinductor dos sintasa marcado con fluorescencia azul suplementado con tirosinasa. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente.

Enjuague la película con PBS como antes, aplique un potencial anódico al electrodo ITO sumergido en una solución de deposición de alginato que contenga celdas receptoras. Continúe con los mismos pasos descritos en la codeposición de poblaciones celulares en alginato para generar la señal transmitida enzimáticamente. Después de enjuagar las películas, agregue una solución de cinco micromolares, SAH y PBS suplementados con medios al 10% LB y un milimolar.

El cloruro de calcio cubre los electrodos para evitar la evaporación de la solución e incuba durante la noche a 37 grados centígrados. Esto permitirá una respuesta de la célula receptora mediante la generación de una proteína fluorescente roja, los electrodos adyacentes rojos DS se pueden obtener con microscopía de fluorescencia mediante ajuste. Los filtros para capturar la fluorescencia azul de la también inductora dos sintasa y la fluorescencia roja expresada por las señales eléctricas impuestas por las células receptoras cooptadas pueden crear microambientes localizados cerca de la superficie de un electrodo y estos estímulos pueden desencadenar el autoensamblaje de polisacáridos como el alginato y el razán para depositarse como una película de hidrogel en la superficie del electrodo.

Debido a que esta transición de gel de alma ocurre en la superficie del electrodo, la película resultante se electro direcciona con su geometría que coincide con el patrón del electrodo. Usando alginato, poblaciones celulares únicas han sido codepositadas en direcciones separadas. La evidencia de sus direcciones de electrodos se observa en la interacción entre la población de celdas emisoras y receptoras.

La molécula autoinductora dos se difunde desde las células emisoras y es absorbida por las células receptoras, lo que da lugar a la expresión de la proteína fluorescente roja DS. Aquí. La fluorescencia roja se observa solo en el electrodo donde se dirigen los receptores. Por el contrario, la enzima biosensible glucosa oxidasa proporciona la capacidad de detección de glucosa a través de una reacción enzimática mediante la producción de peróxido de hidrógeno, que luego se puede oxidar electroquímicamente para producir una corriente de salida.

De esta manera, una señal química puede ser transducida a eléctrica. Este gráfico muestra que las películas en las que Geo X se conjugó químicamente producen una fuerte señal antic en presencia de glucosa en comparación con las películas que no contienen Geo X. Estos resultados indican que Geo X puede ensamblarse en una película zam depositada y/o retener la actividad catalítica. Además, se produce un aumento escalonado de una corriente ótica en respuesta al aumento de las concentraciones de glucosa.

La curva estándar también presente muestra que los aumentos escalonados se produjeron de una manera casi lineal dependiendo de la cantidad de glucosa añadida. Estos resultados muestran que la enzima también conserva su sensibilidad en la conjugación a la película de Razza, como se muestra aquí, la I dos sintasa incluye una etiqueta Penta tirosina. La tirosinasa actúa sobre la etiqueta de tirosina oxidando los grupos fenoles de los residuos a o quinonas, que luego se unen covalentemente a la amina de Kazan La evidencia de la funcionalización de la película Kazam dentro de la a i dos sintasa por el ensamblaje de tirosinasa se observa en esta imagen de fluorescencia que muestra una película de kaza en oro donde la I dos sintasa funcionalizada se ha marcado fluorescentemente en azul porque una I dos sintasa genera una I dos a partir del sustrato SAH de la misma manera Al igual que las células emisoras, su proximidad a las células receptoras cooptadas en presencia de SAH también hace que las células receptoras respondan fluorescentemente expresando DS.

La fluorescencia roja y roja de las células receptoras demuestra una vez más la interacción entre direcciones debidas a la difusión de ai, dos de una a otra, e indica además que 10 enzimas inmovilizadas a tizen mantienen su actividad una vez unidas covalentemente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo electrodepositar películas de polisacáridos y cómo funcionalizarlas utilizando una variedad de técnicas. Hemos demostrado la versatilidad en estos pasos de funcionalización, lo que nos permite trabajar con una multitud de componentes biológicos en pruebas posteriores.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tan solo unos minutos para generar patrones de película bien definidos en los que se pueden injertar con precisión los componentes biológicos. Y así, de esta manera, somos capaces de generar muy fácilmente superficies biológicamente modeladas y activas en electrodos designados, todo ello de forma organizada y, sin embargo, capaz de lograr interacciones biológicas complejas. Siguiendo este procedimiento, la creatividad se puede emplear tanto en el diseño de la electromatriz como en la elección de los componentes biológicos para lograr la interacción del diseño.

Nuestra esperanza es que las herramientas de biofabricación unan dos campos dispares, la biotecnología y la microelectrónica, cada uno de los cuales ha revolucionado individualmente nuestras vidas. Al interconectar estos dos campos, creemos que crearemos nuevas soluciones a algunos de los problemas más apremiantes de la sociedad. Por ejemplo, imaginamos que la biofabricación podría proporcionar métodos simples y versátiles para nuevas formas de detección, para el punto de atención, el diagnóstico de enfermedades y la detección de amenazas biológicas y químicas.

Un ejemplo de gran alcance podría ser que el próximo stent arterial de próxima generación también sería capaz de controlar su perfil metabólico, así como de mantener la arteria abierta.