Name: Reducción de la interfaz de Bio-electrónica con Biofabrication (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 38 s
Description: Aprende a depositar películas de polisacáridos mediante electrodepósito y funcionalizarlas con proteínas y células para aplicaciones en dispositivos lab-on-a-chip. Este método biofabricación crea interfaces biológicas interactivas de forma simple.

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Reconocemos la financiación de la DTRA para el apoyo de este manuscrito y de la ONR, DTRA, y la NSF para el apoyo parcial de la investigación subyacente.

<ol><li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding%2C+semi-permeable+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li>
<li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li>
<li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+capture+on+patterned+surfaces+coated+with+amphiphilic+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers.</a> Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+to+build+the+biology-device+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Biofabrication to build the biology-device interface.</a> Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).</li>
<li>Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Enzymatic+Reactions+for+the+Assembly+of+Proteins+at+Electrode+Addresses%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses.</a> Langmuir. 25, 338-344 (2008).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+quantitative+visualization+and+characterization+of+chitosan+electrodeposition+with+paired+sidewall+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes.</a> Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+anodic+electrodeposition+of+calcium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate.</a> Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).</li>
<li>Wu, L. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Selective+Deposition+of+a+Reactive+Polysaccharide+Layer+onto+a+Patterned+Template%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template.</a> Langmuir. 19, 519-524 (2003).</li>
<li>Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+of+antibodies+and+antigens+via+IgG-binding+domain+engineered+with+activatable+pentatyrosine+pro-tag.+Biotechnol%5BTitle%5D)+AND+%22bioeng%22%5BJournal%5D)">Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol.</a> bioeng. , 103-231 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagentless+Protein+Assembly+Triggered+by+Localized+Electrical+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals.</a> Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+of+Cell+Populations+by+Co-Deposition+with+Calcium+Alginate+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).</li>
<li>de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+microcapsules+for+immunoisolation+of+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells.</a> Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+and+their+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications.</a> Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+Functionalized+Polysaccharides+as+Model+Biofilms+for+Interrogating+Cell+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling.</a> Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).</li>
<li>Meyer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-coated+wires%3A+conferring+electrical+properties+to+chitosan+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers.</a> Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).</li>
<li>Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+biological+nanofactories+trigger+quorum+sensing+response+in+targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+with+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biofabrication with chitosan.</a> Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).</li>
<li>Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiba+Benjamin%2C+D+%22Renewable+and+Sustainable+Polymers%22">Renewable and Sustainable Polymers</a>. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).</li>
<li>Koev, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%3A+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li>
<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+assembly+of+a+metabolic+pathway+enzyme+in+a+pre-packaged+reusable+bioMEMS+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device.</a> Lab Chip. 8, 420-430 (2008).</li>
<li>Spinks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%22dual+mode%22+actuation+in+chitosan%2Fpolyaniline%2Fcarbon+nanotube+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat+B-Chem%22%5BJournal%5D)">A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers.</a> Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+assembly+of+genetically+modified+viral+nanotemplates+via+nucleic+acid+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization.</a> Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).</li>
<li>Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-cycling+and+H2O2+generation+by+fabricated+catecholic+films+in+the+absence+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes.</a> Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).</li>
<li>Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+transdermal+delivery+of+model+drug+compounds+by+MEMS+microneedle+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array.</a> Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).</li>
<li>Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+biosensor+based+on+bacterial+cells+immobilized+on+chitosan+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix.</a> Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).</li>
<li>Selimoglu, S. M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li>
<li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li>
<li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li>
<li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+A%22%5BJournal%5D)">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li>
<li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li>
</ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por la Agencia de los Estados Unidos de Defensa de Reducción de Amenazas.

Nuestros procedimientos de demostrar la electrodeposición y funcionalización de películas de biopolímeros, un proceso que llamamos biofabrication. A través de funcionalización con las células y biomoléculas que crear superficies biológicas capaces de interactuar entre sí y la dirección de electrodos están montados sobre. El primer paso, electrodeposición, se lleva a cabo a través de la activa auto-ensamblaje de biopolímeros, alginato y quitosano en nuestros estudios, en respuesta a una señal eléctrica. Como se indicó anteriormente un gradiente de pH se genera que puede ser controlado por la densidad de corriente y el tiempo de deposición, proporcionando un control adicional sobre las dimensiones y propiedades de película 6,17. Hemos encontrado que una variedad de densidad de corriente y combinaciones de deposición de tiempo puede ser utilizado para los electrodos indicados en la Tabla 1. Mientras que el uso de otros electrodos es factible, ajustes en el procedimiento sería necesario. En comparación con otras técnicas de formación de la película el proceso de electrodeposición es simple, rápida y reactivos,. No hay necesidad de un extenso repertorio de equipos costosos y laboriosos preparativos. Es importante destacar que el proceso puede soportar pequeñas desviaciones experimentales y se pueden iniciar fácilmente por si ocurre algún problema. El quitosano es capaz de responder a un gradiente de pH alto catódica debido a importantes propiedades funcionales que le confiere un alto contenido de aminas primarias. A pH elevado (mayor que su pKa de ~ 6,3) las aminas se desprotona y quitosano se vuelve insoluble, lo que permite la formación de película. Tras la deposición, las películas permanecerá unida al electrodo. Sin embargo, existe la capacidad para deslaminar si se desea. Las películas se mantiene estable siempre y cuando el pH de la solución no caiga por debajo del pKa. Las soluciones ácidas protonar las aminas y las repulsiones electrostáticas posteriores engrosar el gel hasta que se disuelva 18. Es decir, el proceso de montaje / desmontaje es reversible en la demanda y alloeb para la eliminación de películas depositadas y la reutilización de los electrodos. Convenientemente, el rango de pH en el que la transición sol-gel tiene lugar está cerca de aquel en el que los componentes más biológicos funcionar de manera óptima. Esto hace que el ideal procedimiento para la retención de la funcionalidad durante el montaje 6. Formación alginato película se ve facilitada por la electrólisis anódica de agua, así como la presencia de carbonato de calcio 7. El pH bajo localizada en el ánodo solubiliza el carbonato de calcio que conduce a los cationes de liberación de calcio. Estos iones están quelado por alginato, formando una red reticulada sobre la superficie del electrodo. Películas de alginato son notablemente reversible por la competencia por los iones de calcio procedentes de otros compuestos quelantes tales como citrato o EDTA, que pueden ser utilizados para disolver las películas, lo que permite la reutilización de los electrodos subyacentes. Así, las películas de alginato son relativamente frágiles cuando se somete a condiciones fisiológicas debido a los iones de calcio son fácilmente scavenged de la matriz de gel, lo que debilita su estructura y la promoción de delaminación o redisolución. Para superar esta limitación, se ha incluido una etapa de incubación para la película en 1 M CaCl 2 para reforzar el gel. Además, se recomienda que la solución de la película de incubación (medios celulares, etc) se suplementado con CaCl 2 a una concentración de 500 mM-3 mM. El procedimiento mayor segunda es la funcionalización de la película depositada con los correspondientes componentes biológicos. Esto se puede conseguir de dos maneras, siendo la primera conjugación electroquímica, una estrategia que permite un montaje rápido, reactivos, de las proteínas con un control excepcional espacial 10. Sin embargo, la funcionalización de esta manera está limitada por la difusión de los iones Cl - a través de la película al electrodo, así como la difusión de HOCl, la generada intermedio reactivo, de vuelta a cabo en solución. La capacidad de las moléculas electroquímicamente activas para pasara través de la película permite la transducción de señales químicas y biológicas en fácil de leer las señales eléctricas 15. Hemos demostrado la tirosinasa mediada por acoplamiento como una segunda estrategia para funcionalización enzima a quitosano, demostrado por unión covalente de AI-2 sintasa. Esta estrategia permite que el proceso de funcionalización a ser controlada y selectiva - depende de un reactivo específico, la tirosinasa, que actúa en forma discriminatoria las proteínas que contienen una etiqueta de la tirosina 9. Se demuestra la utilidad y la biocompatibilidad de los sistemas multi-dirección mediante la replicación de las vías naturales en un chip. En primer lugar se organizaron dos poblaciones de células (es decir &quot;remitentes&quot; y &quot;receptores&quot;) en direcciones distintas, y demostró que se relacionaban a través de electrodos adyacentes para entregar el AI-2 y generar una respuesta de fluorescencia. Este concepto también se ha demostrado por Cheng et al. en un 14 chip de microfluidos. También imitó la interacción, pero en lugaruna enzima para sintetizar el AI-2 para la entrega. De este modo, una vía de síntesis intracelular, AI-2 síntesis, se replica a través biofabrication y funcionaban tanto como lo haría en solución. En ambos casos, el montaje de varias direcciones presenta el desafío de evitar no específicos de unión entre las direcciones porque cada solución de deposición deben ser introducidos a la matriz de electrodos todo, aunque electrodeposición sólo está destinado a una dirección. Lavado suave pero completa puede eliminar la mayor parte de la solución residual de electrodos e imparciales, el uso del flujo en canales de microfluidos puede además reducir al mínimo la no especificidad. En particular, para la biofabrication adyacente de quitosano y direcciones de alginato, se recomienda depositar la película de quitosano primero, después de esto con pasos biofuncionalización, y después de esto, electrodepositing alginato. A pesar de que no lo han hecho aquí, hemos encontrado que el bloqueo de la película de quitosano con proteínas inertes (tales como milésimask, BSA, etc) disminuye en gran medida no específicos de unión de las moléculas no deseadas a la superficie del quitosano aminado. Hemos encontrado utilidad en el establecimiento de electrodos con dibujos, a menudo se encuentran en dispositivos bioMEMS, como los &quot;planos&quot; de un arreglo complejo de células y biomoléculas. Los usos de electrodepositado quitosano en dispositivos bioMEMS puede ir mucho más allá de los ejemplos aquí mencionados 19. El quitosano se puede depositar sobre diversos geometrías microescala, como en microcanales y sobre superficies no planas de 20,15. Las películas también se pueden modificar con otros polímeros y una variedad de proteínas, ADN, nanopartículas y moléculas activas redox para 21,22,23 propiedades novedosas. En los dispositivos bioMEMS, las películas de quitosano se han utilizado para la administración de fármacos, la detección de moléculas redox y pequeño, biocatálisis, y los estudios de células 20,23,24,25. De manera similar, el alginato se utiliza ampliamente como una matriz de células-atrapamiento y ha sido explorado para la contención de fluidos reversiblelas poblaciones de células y en la película inmunoanálisis 26,27,28. Películas compuestas para aplicaciones de ingeniería de tejidos han sido fabricados utilizando electrodeposición alginato, con componentes tales como con hidroxiapatita para implantes ortopédicos 29. En nuestras manifestaciones de biofabrication, hemos demostrado tanto las interacciones entre los componentes biológicos ya través de la interfaz de bio-electrónico para ser igualmente aplicables; esto trae en llegar a la perspectiva de la integración de todas las variedades de interacciones para un rendimiento sofisticado en la transmisión de señales en el chip. En consecuencia, biofabrication puede facilitar la fabricación de dispositivos con la reducción de tamaños de la característica &quot;mínimo&quot;, como una consecuencia directa de la rápida evolución de la microfabricación, como a menudo motivados por la electrónica de consumo. Es decir, próximos dispositivos de próxima generación podría, de hecho, son lábiles componentes biológicos que ofrecen conjunto exquisito de la naturaleza y las capacidades de reconocimiento en detalle aún más pequeño scales de los sistemas artificiales. Tenemos la visión de corto plazo en aplicaciones de instrumentación analítica, sensores ambientales, y los dispositivos implantables, incluso biocompatibles.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del componente </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Fuente de alimentación </td><td> Keithley </td><td> Fuente-2400 </td></tr><tr><td> Tres electrodos potenciostato </td><td> CH Instruments </td><td> Potenciostato / Galvanostato 600D </td></tr><tr><td> RE-5B de Ag / AgCl Electrodo de referencia con un conector flexible </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td> Oro oblea de silicio recubierto, 500um de Si, 12nm de Cr, 120 nM Au, SiO 2 para aislamiento </td><td> fabricado a </td><td></td></tr><tr><td> El óxido de estaño e indio corredera de vidrio revestido, rectangular, 8-12 ohmios resistir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 578274 </td></tr><tr><td> Platinum hoja / hoja (0,002 pulgadas) </td><td> Surepure Chemetals </td><td> 1897 </td></tr><tr><td> Línea delgada &quot;2 pinzas de cocodrilo </td><td> RadioShack </td><td> 270-346 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Multi-Stacking Cable Plug banana parche </td><td> TSElectronic </td><td> B-36-02 B-24-02 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 kit de silicona de elastómero </td><td> Dow Corning </td><td> NC9020938 Desde Fischer </td></tr><tr><td> Fluorescecence microscopio estereoscópico </td><td> Olimpo </td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens estándar </td><td> Olimpo </td><td> la versión 1.3 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Electrodeposición y el equipo de visualización de fluorescencia. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El quitosano, peso molecular medio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448877 </td></tr><tr><td> Ácido clorhídrico, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grado </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio, solución. 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td> El ácido algínico, sal de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MM precipitado Carbonato de calcio, las partículas de 70 nm </td><td> Especialidad Minerals Inc. </td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Quitosano y reactivos de alginato de solución. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El cloruro de calcio, dihidratado </td><td> JT Baker </td><td> 0504 </td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio, certificado Cristalina ACS </td><td> Fischer Científico </td><td> S271 </td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico, anhidro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> Fosfato de potasio dibásico, anhidro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3786 </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td> Sigma- Aldrich </td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Otros componentes de la solución y los reactivos de amortiguamiento. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa / Fuente </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> La glucosa oxidasa de Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2133 </td></tr><tr><td> La tirosinasa de hongos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3824 </td></tr><tr><td> LB caldo, Miller (granulado) </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-sintasa&quot; (HGLPT) </td><td> LAB 16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110 células de tipo salvaje </td><td> Laboratorio de acción 30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-LSRR - amplificador de I + pET- <em&gt; DsRed - Kan ® células </td><td> Laboratorio de acción 30 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoroesferas: diámetro 1um, Ex / Em: 505/515 </td><td> Invitrogen </td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - (y-6)-6G carboxyrhodamine succinimidil éster, Ex / Em: 525/560 </td><td> Invitrogen </td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight anticuerpos kit de etiquetado, 405 </td><td> Thermo Scientific </td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Las enzimas, células, y otros reactivos de funcionalización.

reducción de la interfaz de bio-electrónica con biofabrication

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Los avances en la promesa de la tecnología de laboratorio-en-un-chip para revolucionar la investigación y la medicina a través de menores costos, una mejor sensibilidad, portabilidad, y un mayor rendimiento. La incorporación de componentes biológicos biológicos Desciende en sistemas microelectromecánicos (bioMEMS) ha mostrado un gran potencial para el logro de estos objetivos. Microfabricated chips electrónicos para permitir características escala micrómetro-así como una conexión eléctrica para la detección y accionamiento. Funcionales componentes biológicos dar al sistema la capacidad para la detección específica de analitos, funciones enzimáticas y las capacidades de células enteras. Los procesos estándar de microfabricación y técnicas de bio-analíticos se han utilizado con éxito durante décadas en las industrias de la informática y biológica, respectivamente. Su combinación y la interconexión en un entorno de laboratorio-en-un-chip, sin embargo, da a luz a nuevos desafíos. Hay una convocatoria de técnicas que puede crear una interfaz entre el electrodo y COMPON biológicaENT que es suave y es fácil de fabricar y el patrón. Biofabrication, que se describe aquí, es un enfoque de tal manera que se ha demostrado una gran promesa para su fácil montaje incorporación de los componentes biológicos con una versatilidad en las funciones en el chip que están habilitadas. Biofabrication utiliza materiales biológicos y los mecanismos biológicos (auto-ensamblaje, ensamblaje enzimática) de abajo hacia arriba asamblea jerárquica. Mientras que nuestros laboratorios han demostrado que estos conceptos en muchos formatos 1,2,3, aquí se demuestra el proceso de montaje sobre la base de electrodeposición seguido de múltiples aplicaciones de base de la señal de las interacciones. El proceso de montaje consiste en la electrodeposición de películas de polímeros biocompatibles estímulos-respuesta en los electrodos y su funcionalización posterior con componentes biológicos tales como ADN, enzimas, o células vivas 4,5. La electrodeposición se aprovecha de la gradiente de pH creado en la superficie de un electrodo sesgado de la electrólisisde agua 6,7,. El quitosano y alginato son sensibles a estímulos polímeros biológicos que se pueden activar a la auto-ensamblan para formar películas de hidrogel en respuesta a señales eléctricas impuestas por el 8. El espesor de estos hidrogeles se determina por el grado en que el gradiente de pH se extiende desde el electrodo. Esto se puede modificar mediante diferentes densidades de corriente y los tiempos de deposición 6,7. Este protocolo se describe cómo las películas de quitosano se depositan y funcionalizado por unión covalente de los componentes biológicos de los grupos amina primarios abundantes presentes en la película a través de cualquiera de los métodos enzimáticos o electroquímica 9,10. Películas de alginato y su atrapamiento de células vivas también se abordarán 11. Finalmente, la utilidad de biofabrication se demuestra mediante ejemplos de la señal basada en la interacción química, incluyendo-a-eléctrica, de célula a célula, y también enzima-a-célula de transmisión de la señal. Tanto la electrodeposicióny funcionalización puede llevarse a cabo en condiciones próximas a las condiciones fisiológicas sin la necesidad de reactivos y, por tanto sobra lábiles componentes biológicos de las duras condiciones. Además, tanto el quitosano y alginato han sido utilizados para los propósitos biológicamente relevantes 12,13. En general, biofabrication, una técnica rápida que puede ser simplemente realiza en una mesa de trabajo, se puede utilizar para crear patrones micras escala de funcionales componentes biológicos en los electrodos y se puede utilizar para una variedad de laboratorio en un chip aplicaciones.

Este artículo describe un enfoque biofabrication: deposición de estímulos-respuesta polisacáridos en la presencia de electrodos sesgadas para crear películas biocompatibles que pueden ser funcionalizados con células o proteínas. Se demuestra una estrategia de sobremesa para la generación de las películas, así como sus usos básicos para crear superficies interactivas biofuncionalizadas de laboratorio-en-un-chip de aplicaciones.

Reducción de la interfaz de Bio-electrónica con Biofabrication

Los avances en la tecnología de laboratorio en un chip prometen revolucionar tanto la investigación como la medicina mediante la reducción de los costes, una mayor sensibilidad, la portabilidad y...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en depositar eléctricamente películas de biopolímeros y funcionalizarlas con componentes biológicos como proteínas y células. El electrodepósito se logra aprovechando el cambio de pH que ocurre localmente en un electrodo polarizado en combinación con una solución de polisacárido sensible al pH. Tras elegir una estrategia de deposición catódica o anódica, se aplica un voltaje al electrodo para inducir una transición sol-gel, lo que genera una película delgada con un patrón definido por la geometría del electrodo.Además, se pueden introducir componentes biológicos como proteínas y células durante todo el proceso de deposición del electrodo. Con el fin de funcionalizar biológicamente la película, se obtienen resultados que muestran que los componentes biológicos se localizan en las películas según imágenes de fluorescencia. Asimismo, los componentes son funcionales y capaces de interactuar con su entorno, como se demuestra mediante la detección electroquímica de la actividad enzimática y el uso de la respuesta de células indicadoras.La biofabricación proporciona una caja de herramientas novedosa para construir la interfaz entre la biología y la electrónica. Consideramos que sus principales ventajas son su simplicidad y su capacidad para ensamblarse en condiciones cercanas a las fisiológicas. La biología es experta en la fabricación a escala nanométrica mediante autoensamblaje y procesos enzimáticos. Al aprovechar estas capacidades, evitamos métodos de síntesis complejos, peligrosos y que consumen mucho tiempo, los cuales son utilizados por otras técnicas de ensamblaje.Nuestro equipo colaborativo tuvo la idea de construir la interfaz del dispositivo BioD utilizando materiales y mecanismos biológicos cuando observamos que sus cometas podían ser depositadas por electrodo. El kitan es un polisacárido formador de películas sensible al pH que puede reconocer las señales eléctricas impuestas por el dispositivo y depositarse como una película delgada. Una vez que vimos que el kitan podía depositarse por electrodo, comprendimos que podríamos acceder a un conjunto más amplio de herramientas de la bioquímica y la biología molecular para construir una interfaz de dispositivo BioD.La aplicación de dicha técnica se extiende hacia entornos de laboratorio en un chip donde se requieren componentes biológicos funcionales, ya que proporcionan una forma económica y sencilla de localizar tales componentes en un electrodo donde pueden permanecer viables. La demostración visual de este método es fundamental, ya que una película biofabricada puede estar dedicada y dañarse fácilmente. Por ello, se debe tener cuidado de no ser demasiado brusco al lavar o manipular la película.Dado que la película podría denominarse fácilmente perturbada. Sin embargo, como ventaja, los electrodos pueden reutilizarse porque la película se elimina fácilmente. Para comenzar este protocolo, conecte una fuente de alimentación a los electrodos fabricados personalizados mediante cables de conexión utilizando pinzas tipo cocodrilo.Un portaobjetos de vidrio recubierto con óxido de indio y estaño, o ITO, actuará como ánodo o electrodo de trabajo; una lámina de platino servirá como cátodo o electrodo auxiliar. Coloque los electrodos de manera que la superficie del ITO que se va a funcionalizar quede frente al electrodo auxiliar, de forma que la superficie del ITO esté posicionada ya sea verticalmente para sumergirla en la solución o horizontalmente, de modo que la solución pueda contenerse sobre la superficie. A continuación, prepare una solución de deposición de alginato mezclando alginato al 1 % y carbonato de calcio al 0,5 % en agua destilada y autoclavando la mezcla. Luego, marque el alginato con fluorescencia utilizando esferas fluoradas mediante mezcla y vortexado.Esto permitirá la obtención de imágenes de fluorescencia de la película resultante. Después de la autoclave, sumerja ambas electrodos en la solución de deposición preparada y aplique una densidad de corriente constante de tres amperios por metro cuadrado durante dos minutos. El voltaje variará en el rango de dos a tres voltios. Después de dos minutos, desconecte el electrodo y retire la solución con los depósitos no adheridos. Enjuague suavemente la película con cloruro de sodio para eliminar el alginato excesivo.Incube brevemente la película en cloruro de calcio 0,1 molar para reforzar el gel. A continuación, incube la película en la solución de almacenamiento deseada. Proceda a obtener imágenes de la película mediante microscopía de fluorescencia antes de la coposición.Cultive una cultura celular de células emisoras de señales y una cultura celular de células receptoras de señales según lo indicado en el protocolo escrito que acompaña a este video. A continuación, prepare una solución de deposición de alginato y carbonato de calcio. Mezcle la solución con cada cultura celular en una proporción uno a uno hasta una concentración final de 1% de alginato y 0,5% de carbonato de calcio, con las células diluidas a aproximadamente la mitad de la densidad de cultivo.Utilice un portaobjetos de vidrio con un patrón de dos electrodos de ITO contenidos en un pozo de silano de poli dimetilo y un electrodo de platino como contrapunto. Conecte un electrodo de ITO y el electrodo de platino a una fuente de alimentación. Como antes, sumerja los electrodos en la solución de deposición que contiene las células receptoras.Configure la fuente de alimentación para mantener una corriente constante con una densidad de tres amperios por metro cuadrado, donde la dimensión del área superficial está definida por el electrodo individual sobre el cual ocurrirá la deposición. Aplique la corriente durante dos minutos para permitir la codeposición de las células en la matriz de alginato. Enjuague la película con cloruro de sodio como antes, e invierta la conexión antic al electrodo adyacente de ITO.Repita el procedimiento de deposición, pero esta vez introduzca la solución que contiene las células donadoras. Incube durante la noche a 37 grados Celsius en solución salina tamponada con fosfato el chip con dos electrodos que contiene las células codepositadas y arginato de calcio.Suplementado con medio LB al 10 % y cloruro de calcio de un milimolar. Después de la incubación, image el chip utilizando un microscopio de fluorescencia para iniciar el depósito del electrodo de quitosano. Conecte la fuente de alimentación a los electrodos.Coloque las pinzas cocodrilo. Un chip de silicio recubierto de oro actuará como cátodo y una lámina de platino servirá como ánodo. Coloque la superficie del electrodo de oro de manera que deposite el electrodo contrario como antes.Prepare una solución de arena Kato mezclando escamas de arena Kato en agua y agregando lentamente ácido clorhídrico dos molar para disolver los polisacáridos. Siguiendo el procedimiento mencionado en el texto, la solución de arena Kato puede marcarse con fluorescencia para visualizar la película depositada sobre el electrodo mediante microscopía de fluorescencia. A continuación, coloque los electrodos en la solución de kaizan, sumergiendo completamente el área deseada para la deposición.Durante dos minutos, aplique una corriente constante calculada a una densidad de cuatro amperios por metro cuadrado en función del área superficial del electrodo de trabajo. En este caso, se aplica una corriente de 16 microamperios a un electrodo de oro de cuatro milímetros cuadrados; el voltaje se desplazará dentro del rango de dos a tres voltios tras enjuagar el electrodo con agua desionizada para eliminar el quitosano en exceso. Proceda a obtener una imagen de la película mediante un microscopio de fluorescencia, copos de quitosano y glucosa oxidasa a partir de una solución a una densidad de corriente de cuatro amperios por metro cuadrado sobre un electrodo estructurado.De acuerdo con el procedimiento de deposición del electrodo de quitosano, se generará una película de kaizan atrapada con glucosa oxidasa. Sujete el electrodo tratado a un sistema de tres electrodos como electrodo de trabajo, un alambre de platino como electrodo auxiliar y plata/cloruro de plata como electrodo de referencia, e introduzca los electrodos en una solución tampón de fosfato que contiene cloruro de sodio. Conjugue electroquímicamente la proteína a la película de Kazam aplicando un voltaje constante durante 60 segundos mediante cronopirómetría tras la conjugación.Coloque el chip en tampón fosfato y lávelo durante 10 minutos en un agitador orbital para eliminar cualquier cloruro de sodio no reaccionado y glucosa oxidasa no conjugada. Vuelva a colocar el sistema de tres electrodos y sumerja una solución de glucosa cinco milimolar. Luego, establezca los parámetros deseados para la voltametría cíclica con el fin de barrer el potencial en dirección positiva hasta 0,7 voltios.Retire los electrodos de la solución de glucosa y enjuague con tampón fosfato. Luego coloque los electrodos en un vaso de precipitados de 10 mililitros que contenga ocho mililitros de tampón fosfato sobre una placa agitadora magnética con inclinación. Ajuste el chip funcionalizado con GOX a 0,6 voltios para que sirva como electrodo de trabajo.Después de ajustar los parámetros deseados, recolecte una grabación de línea base. Añada alícuotas de glucosa al tampón para aumentar la concentración de glucosa en cuatro milimolares por cada alícuota. En este experimento, se añaden alícuotas de 400 microlitros de glucosa 80 milimolar al tampón. Correlacione la señal de corriente con cada concentración de glucosa para generar una curva patrón. Para realizar la funcionalización de proteínas, utilice un portaobjetos de vidrio con un electrodo de oro y otro de ITO dispuestos adyacentemente, contenido dentro de A-P-D-M-S.Polarice adecuadamente el electrodo de oro con un potencial catódico para depositar electrolíticamente tizen como se mostró previamente. Después de enjuagar la película, agregue una solución de sintasa del autoinductor dos marcada con fluorescencia azul, suplementada con tirosinasa. Incube durante una hora a temperatura ambiente.Lave la película con PBS como antes, aplique un potencial anódico al electrodo de ITO sumergido en una solución de deposición de alginato que contenga células receptoras. Continúe con los mismos pasos descritos en la codeposición de poblaciones celulares en alginato para generar la señal transmitida enzimáticamente. Después de lavar las películas, agregue una solución de cinco micromolar, SAH y PBS suplementada con medio LB al 10% y un milimolar.El cloruro de calcio cubre los electrodos para evitar la evaporación de la solución e incubar durante la noche a 37 grados Celsius. Esto permitirá una respuesta en las células receptoras mediante la generación de una proteína fluorescente roja DS red; los electrodos adyacentes pueden observarse mediante microscopía de fluorescencia ajustando los filtros para capturar la fluorescencia azul del inductor también sintetasa y la fluorescencia roja expresada por las células receptoras reclutadas. Las señales eléctricas impuestas pueden crear microentornos localizados cerca de la superficie del electrodo, y estos estímulos pueden desencadenar el autoensamblaje de polisacáridos como el alginato y el razan, que se depositan como una película de hidrogel sobre la superficie del electrodo.Dado que esta transición sol-gel ocurre en la superficie del electrodo, la película resultante queda electrodirigida con una geometría que coincide con el patrón del electrodo. Mediante el uso de alginato, se han coprecipitado poblaciones celulares únicas en direcciones separadas. La evidencia de su direccionamiento electrodo se observa tras la interacción entre la población celular emisora y la receptora.La molécula autoinductora dos difunde desde las células emisoras y es captada por las células receptoras, lo que resulta en la expresión de la proteína fluorescente DS roja. Aquí, se observa fluorescencia roja únicamente en el electrodo donde se dirigen las células receptoras. Por el contrario, la enzima biosensora glucosa oxidasa proporciona la capacidad de detección de glucosa mediante una reacción enzimática al producir peróxido de hidrógeno, el cual luego puede oxidarse electroquímicamente para generar una corriente de salida.De esta manera, una señal química puede transducirse en una eléctrica. Este gráfico muestra que las películas en las que Geo X se conjugó químicamente producen una señal antagónica fuerte en presencia de glucosa, a diferencia de aquellas películas que no contienen Geo X. Estos resultados indican que Geo X puede ensamblarse sobre una película de zam depositada y además retener actividad catalítica. Asimismo, se produce un aumento escalonado en una corriente ótica en respuesta a concentraciones crecientes de glucosa.La curva patr&oacute;n tambi&eacute;n presentada muestra que los incrementos siguieron una progresi&oacute;n casi lineal, dependiente de la cantidad de glucosa a&ntilde;adida. Estos resultados indican que la enzima conserva su sensibilidad tras la conjugaci&oacute;n con la pel&iacute;cula Razza, tal como se muestra aqu&iacute;; la s&iacute;ntesis I dos incluye una etiqueta de penta tirosina. La tirosinasa act&uacute;a sobre la etiqueta de tirosina, oxidando los grupos fen&oacute;licos de los residuos a o-quinonas, que luego se unen covalentemente a las aminas de Kazam. Se observa evidencia de la funcionalizaci&oacute;n de la pel&iacute;cula Kazam mediante el ensamblaje de la s&iacute;ntesis I dos por tirosinasa en esta imagen de fluorescencia, que muestra una pel&iacute;cula de kaza sobre oro, donde la s&iacute;ntesis I dos funcionalizada ha sido marcada fluorescentemente en azul. Dado que la s&iacute;ntesis I dos genera I dos a partir del sustrato SAH de la misma manera que las c&eacute;lulas emisoras, su proximidad a c&eacute;lulas receptoras reclutadas en presencia de SAH tambi&eacute;n provoca que dichas c&eacute;lulas receptoras respondan fluorescentemente mediante la expresi&oacute;n de ds.La fluorescencia roja de las células receptoras nuevamente demuestra la interacción entre direcciones debido a la difusión de ai, dos desde una hasta la otra, e indica además que las 10 enzimas inmovilizadas en tizen conservan su actividad una vez unidas covalentemente. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo electrodepositar películas de polisacáridos y cómo funcionalizarlas utilizando diversas técnicas. Hemos demostrado la versatilidad de estos pasos de funcionalización, lo que nos permite trabajar con una multitud de componentes biológicos en pruebas posteriores.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tan solo unos minutos para generar patrones de película bien definidos sobre los cuales se pueden injertar con precisión componentes biológicos. De este modo, podemos generar de manera muy sencilla superficies biológicamente estructuradas y activas sobre electrodos designados, todo ello de forma organizada y aun así capaz de lograr interacciones biológicas complejas. Tras seguir este procedimiento, se puede emplear la creatividad tanto en el diseño del arreglo electroquímico como en la selección de los componentes biológicos para lograr la interacción deseada.Nuestra esperanza es que las herramientas de biofabricación sirvan de puente entre dos campos dispares, la biotecnología y la microelectrónica, cada uno de los cuales ha revolucionado por separado nuestras vidas. Al interconectar estos dos campos, creemos que crearemos nuevas soluciones para algunos de los problemas más urgentes de la sociedad. Por ejemplo, anticipamos que la biofabricación podría proporcionar métodos sencillos y versátiles para nuevas formas de detección, en el punto de atención, diagnóstico de enfermedades y detección de amenazas biológicas y químicas.Un ejemplo de gran alcance podría ser que el stent arterial de la próxima generación también pudiera monitorizar su perfil metabólico, además de mantener abierta la arteria.

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