Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

El objetivo general de este procedimiento es comparar la composición de polímeros de la pared celular en una amplia gama de plantas o tipos de tejidos mediante el uso de microarreglos de glicanos. Primero, recolecte los tejidos vegetales de interés. Después de la homogenización, prepare los residuos insolubles en alcohol.

Luego extraiga secuencialmente los glicanos de la pared celular utilizando CDTA e hidróxido de sodio. A continuación, imprima los extractos de glicanos de la pared celular en un microarreglo mediante un robot. Sonda los microarreglos con anticuerpos monoclonales dirigidos a los glicanos de la pared celular y cuantifique las señales de los puntos en los microarreglos.

En última instancia, los resultados pueden utilizarse para determinar la abundancia relativa de epítopos de glicanos en un conjunto de muestras de interés. Desarrollamos este método de microarreglo cuando reconocimos la necesidad de obtener una instantánea global de la presencia de glicanos de la pared celular en múltiples tipos de tejidos vegetales simultáneamente y detectar diferencias en su composición. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a métodos tradicionales, como el análisis de monosacáridos, es que se trata de una plataforma basada en microarreglos en la que se pueden analizar cientos de muestras simultáneamente. Este es un método rápido y exhaustivo para perfilar la composición de la pared celular. Para cada tejido de interés, comience con muestras por triplicado de 100 miligramos de peso fresco de tejidos vegetales utilizando nitrógeno líquido.

Homogenice las muestras hasta obtener un polvo fino, luego transfiera el homogeneizado a tubos cónicos de plástico de 10 mililitros para preparar el material de la pared celular. Re_suspenda el homogeneizado en 10 mililitros de etanol al 80 % a temperatura ambiente y vortexee vigorosamente durante dos minutos. Centrifugue las muestras a 3 500 ×g y deseche el sobrenadante.

Repita los lavados con etanol al 70 % al menos tres veces o hasta que el sobrenadante esté claro. Luego realice un lavado final con acetona al 100 %. Recupere los residuos insolubles en alcohol y seque al aire durante la noche para obtener un polvo fino y homogéneo. Tamice las muestras de residuo insoluble en alcohol con una malla de 0,4 milímetros cuadrados.

A continuación, pese 10 miligramos de las muestras de residuo insoluble en alcohol en tubos micro que contengan una perla de vidrio de tres milímetros para la mezcla. Para la extracción de pectinas y polímeros asociados con pectinas, agregue 500 microlitros de CDTA 50 milimolar a cada muestra, vortexe brevemente los tubos y luego mezcle utilizando el tissue izer durante tres horas a ocho hercios. Centrifugue las muestras a 12.000 veces.

G. Retire cuidadosamente los sobrenadantes y almacénelos a cuatro grados Celsius. Lave los precipitados dos veces con un mililitro de agua desionizada. Retire todo el líquido de los tubos del precipitado restante de la pared celular.

Proceda a extraer los glicanos de entrecruzamiento con 500 microlitros de hidróxido de sodio cuatro molar con 0,1% de hidruro de sodio. Mediante el proceso de extracción descrito anteriormente, almacene los sobrenadantes que contienen los glicanos de entrecruzamiento a cuatro grados Celsius. Lave los precipitados dos veces con agua desionizada.

Luego, utilizando 500 microlitros de Cain, extraiga los polímeros residuales como la celulosa mediante centrifugación, y recupere los sobrenadantes que contienen los polímeros de la pared celular extraídos para eliminar cualquier materia particulada. A continuación, cargue 50 microlitros de cada muestra en una placa microtituladora de polipropileno de 384 pocillos, utilizando un diseño personalizado predeterminado en el que las muestras se organizan según el tipo de tejido y el tipo de extracción.

A continuación, diluya las muestras de polímeros de la pared celular con agua desionizada para preparar diluciones seriadas de cinco y 25 veces. Establezca parámetros como la altura de la punta, recolección, tiempo de permanencia y pasos de lavado para el microarreglo. Controle la humedad de la cámara de impresión al 60 % para prevenir la evaporación de la muestra.

Ahora inicie la impresión. El robot utiliza puntas con canal capilar para imprimir soluciones desde la placa de muestra sobre una membrana de nitrocelulosa que está unida a una placa plana dentro de la máquina. Cada punto en la matriz contiene 15 nanolitros de solución e impresos por triplicado.

Imprima microarreglos idénticos uno al lado del otro sobre la membrana y córtelos en arreglos individuales. Para reducir la unión no específica, bloquee cada microarreglo en una solución al 5% de leche descremada en polvo durante dos horas a temperatura ambiente.

Añada los anticuerpos monoclonales específicos para los epítopos de glicanos de la pared celular e incube durante dos horas. A continuación, para eliminar la unión no específica, lave las micromatrices tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez. Después, detecte las micromatrices con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante durante dos horas, tras tres lavados de cinco minutos con PBS.

Desarrolle las micromatrices utilizando sustratos cromogénicos o quimioluminiscentes. Escanee las micromatrices individuales usando un escáner de escritorio de alta resolución. Guarde las imágenes como archivos TIFF negativos de 16 bits.

Calcule la intensidad integral de cada punto utilizando un software de procesamiento de imágenes equipado con una herramienta de cuadrícula automatizada. Luego exporte los datos de la cuadrícula de cada microarreglo como un archivo de texto. Importe manualmente el archivo de datos a una hoja de cálculo de Excel para su análisis.

Calcule la intensidad promedio del punto promediando los valores de los replicados de impresión y las diluciones, para obtener un valor medio de intensidad de punto para cada muestra. Represente gráficamente las intensidades medias relativas entre diferentes muestras como un mapa de calor utilizando formato condicional en Excel o un generador de mapas de calor en línea. Utilice herramientas para eliminar la señal de fondo y los falsos positivos para cada tipo de anticuerpo, corrija los datos a 100 e imponga un valor de corte del 5%.

Se utilizó un perfilado por microarreglo de polímeros exhaustivo para medir la abundancia relativa de glicanos en seis tipos de tejidos: filamentos de anteras, polen, ovarios, pétalos, estambres y estigmas de nicotiana. En una gran cantidad de flores, el microarreglo se hibridó con el anticuerpo monoclonal JIM cinco, que es específico para un epítopo en polisacáridos pécticos. Obsérvese que el epítopo JIM cinco se detecta en extractos de CDTA de todos los tejidos florales.

Sin embargo, es más alto en el polen y más bajo en el tejido del estigma. Curiosamente, el epítopo JIM cinco también se detecta en los extractos de hidróxido de sodio del polen, pero no en los de otros tejidos. Se obtiene información cuantitativa mediante la generación de curvas estándar de los diferentes polisacáridos purificados que se procesaron como estándares internos en la micromatriz en el tejido del ovario.

Aproximadamente 157 microgramos de hoog que contiene el epítopo JIM cinco estaban presentes en cada muestra, lo que representa aproximadamente el 1,5 % de los residuos totales de la pared celular, mientras que 625 microgramos de hoog Ronin que contiene el epítopo JIM cinco estaban presentes en el tejido de polen, lo que representa aproximadamente el 6,25 % del residuo total de la pared celular. La abundancia relativa de 15 epítopos de glicanos en todos los tipos de tejidos se resume en un mapa de calor. La intensidad de las barras de color es proporcional a la intensidad media ajustada del punto para cada muestra.

Una representación pictórica de estos datos permite una interpretación rápida de las diferencias en la ocurrencia de epítopos de glicanos entre los distintos tejidos florales. Estos resultados indican que los epítopos de glicanos individuales se distribuyen de manera única entre muchos tipos de flores. Por ejemplo, el epítopo LM13 es más abundante en los filamentos anterogénicos y en los tejidos SE L en comparación con otros tejidos.

Este patrón contrasta notablemente con el de epítopos de cadena más corta detectados preferentemente por el MAB LM seis. Los glicanos entrecruzados también presentan patrones distintos de ocurrencia en muchas flores. Por ejemplo, el epítopo LM 10 es abundante en el tejido del estigma en comparación con otros tejidos, pero está ausente en el tejido del ovario.

Los epítopos de glicanos LM 15 xog son más abundantes en el pétalo y el filamento del antera en comparación con otros tejidos, mientras que los heteromannanos son más abundantes en los filamentos del antera. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo extraer y determinar la abundancia relativa de glicanos de la pared celular en una amplia gama de plantas y tipos de tejidos. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en tres días utilizando microarreglos.

Es importante recordar tratar las muestras y réplicas de manera consistente en cada paso posterior a este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos con ácido acético-nítrico, para abordar preguntas adicionales. Por ejemplo, ¿cuál es el contenido absoluto de celulosa que permanece después de la extracción secuencial de pectinas y hemicelulosas utilizando CDTA e hidróxido de sodio?

Esta técnica tiene una amplia aplicabilidad en el campo de la biología celular vegetal para comparar rápidamente la presencia de glicanos en plantas modelo como Arabidopsis y Fisca, Nutella, así como en otras como algodón, trigo, eucalipto y tabaco.