Name: Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Aprenda a caracterizar glicanos de la pared celular vegetal mediante CoMPP, un método de microarrays con anticuerpos monoclonales que permite analizar cientos de muestras simultáneamente. Esta técnica facilita estudios de biología vegetal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

IEM gustaría reconocer el Consejo Danés de Investigación (FTP y FNU) para su financiación. ERL reconoce el apoyo de una subvención de ARC DP. AB reconoce el apoyo del Centro ARC de Excelencia en Plant Cell Paredes subvención.

1. Colección de tejidos y preparación <ol><li> Recoger 100 mg de peso fresco de los tejidos vegetales (un mínimo de 10 mg de peso seco) al menos por triplicado para cada tejido de interés. Los pasos siguientes describen la preparación de material de la pared celular de los tejidos vegetativos. En el caso de los tejidos de almacenamiento, no deseado almidón es enzimáticamente eliminado antes de proceder con la extracción de los polímeros de la pared celular como se ha descrito previamente 13. </li><li> Homogeneizar las muestras a un polvo fino con nitrógeno líquido utilizando un Qiagen TissueLyser II, con 24 conjuntos de adaptador y el tubo 3 mm de tungsteno granos de carburo (30 Hz, 2 x 30 seg). Alternativamente, si solamente unas pocas muestras se procesan, un mortero y mano de mortero se utiliza. </li><li> Transfiera los homogeneizados en 10 ml tubos cónicos de plástico. </li><li> Preparar el material de la pared celular mediante el lavado de los homogeneizados en 10 ml de 80% v / v de etanol a temperatura ambiente y agitando vigorosamente durante 2 min. </li><li> Centrifugar las muestras a 3.500 xg y desechar el sobrenadante. Repetir el etanol al 70% se lava al menos tres veces o hasta que el sobrenadante es claro, en particular para los tejidos que contienen clorofila. </li><li> Realizar un lavado final con 100% de acetona y dejar los gránulos que contienen residuos insolubles en alcohol (AIR) para secar al aire durante la noche. </li><li> Tamiz las muestras de aire con un 0,4 mm de malla de 2 para conseguir un polvo fino y homogéneo y para eliminar más grande, mal partículas de tierra que en algún momento permanecen en el homogeneizado. </li><li> Pesar 10 mg de muestra de aire en microtubos, conteniendo cada una 3 mm de perlas de vidrio para ayudar al mezclado de las muestras. </li></ol> 2. Extracción de los glicanos de la pared celular <ol><li> Pectinas, y polímeros asociados con pectinas se extraen de las muestras mediante la adición de 500 l de CDTA mu M 50 (pH 7,5) a cada muestra. </li><li> Agitar brevemente los tubos para asegurar el disolvente está en contacto con el material de la muestra y, a continuación mezclar mediante el TissueLyser durante 3 horas a 8 Hz. </li><li> Centrifugar las muestras a 12.000 xg, cuidadosamente reMove los sobrenadantes y se almacena a 4 ° C. </li><li> Lavar gránulos en 1 ml de agua desionizada para diluir y eliminar cualquier disolvente restante vórtice, y se centrifuga a 13.000 x g. Repita este paso sin perturbar el precipitado y retirar todo el líquido de los tubos antes de proceder al siguiente paso. </li><li> De reticulación glicanos son secuencialmente extraída de la pared celular restante pellet con 500 l de NaOH 4 M con 0,1% w / v NaBH4, usando el mismo procedimiento descrito en los pasos 2,1 a 2,4 para la extracción CDTA. NaBH 4 se añade para reducir el aldehído (o ceto) en el extremo reductor de los polisacáridos a un alcohol evitando de este modo la base de polisacáridos descamación. </li><li> Después de la centrifugación, los sobrenadantes se retira de nuevo, se almacenaron a 4 ° C, y los sedimentos se lavaron dos veces en agua desionizada antes de proceder a la extracción siguiente. </li><li> Como una etapa opcional, los polímeros residuales, tales como la celulosa se extrajo con 500 cadoxen mu l (31% v / v 1,2-diaminanoethane con 0,78 M CdO) usando el mismo procedimiento como se describe en los pasos desde 2,1 hasta 2,4. Alternativamente, el contenido absoluto de celulosa en gránulos restantes se puede determinar usando ensayos acético / nítrico (véase la discusión). </li></ol> 3. Microarrays de impresión <ol><li> Sobrenadantes de centrífuga que contiene extrajo polímeros de la pared celular a 13.000 xg para eliminar cualquier materia en partículas. </li><li> Cargar 50 l de cada muestra en un polipropileno de 384 pocillos placa de microtitulación usando un diseño personalizado prediseñada en donde las muestras se disponen de acuerdo con el tipo de tejido y del tipo de extracción. </li><li> Diluir la muestra de polímero de la pared celular en una serie 0, 5 y 25 × dilución en serie con agua desionizada. </li><li> Los parámetros tales como la altura pin, recogida y tiempo de permanencia, y los pasos de lavado se encuentra en el software que controla la microarrayer. </li><li> La humedad de la cámara de impresión se controla a 60% para evitar la evaporación de la muestra. </li><li> El trabajo de impresión se inicia mediante LabNEXT software y un programa que corresponde a la disposición de microarrays. </li><li> El robot utiliza los pins de canal capilar para imprimir soluciones de la placa de muestra en 20 x 20 cm de membrana de nitrocelulosa que se une a una placa plana en la máquina. Cada punto de la matriz contiene 15 nl de solución y se imprime por triplicado. </li><li> Microarrays idénticos se imprimen uno al lado del otro en la membrana y se cortó en matrices individuales después de que el trabajo de impresión. </li><li> En cada experimento las matrices pueden ser modificados con el fin de acomodar muestras más o menos, diluciones o replicados. </li></ol> 4. Sondeo de Microarrays glicano <ol><li> Después de la impresión, bloquear los microarrays individuales en 5% w / v de leche en polvo desnatada disuelta en solución salina tamponada con fosfato (MPBS) a temperatura ambiente durante 2 horas para reducir la unión no específica. </li><li> Microarrays de sondas con anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de la pared celular glicano durante 2 horas en MPBS al. La mayoría de antib monoclonalodies contra glucanos de la pared celular están disponibles comercialmente en tres compañías; Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ), Servicios Carbosource ( <a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a> ) y PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ). </li><li> Incluir un control negativo, un microarray incubaron con MPBS al solamente y sin anticuerpo primario. </li><li> Lavar los microarrays de 3 veces en tampón fosfato salino (PBS) durante 5 minutos para eliminar la unión no específica. </li><li> Controle los microarrays con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en MPBS al durante 2 horas. Más anticuerpos monoclonales contra glucanos de la pared celular requiere anti-ratón o anti-rata anticuerpos secundarios. </li><li> Repetir las etapas de lavado 3 veces con tampón PBS durante 5 minutos para eliminar la unión no específica. </li><li> Desarrollar los microarrays utilizando cromógeno (3,3-diaminobencidina) o chemiluminecent (luminol) sustratos. </li></ol> 5. Cuantificación <ol><li> Después del revelado, escanear los microarrays individuales utilizando una alta resolución (1.200 dpi) Escáner de sobremesa y guardar las imágenes como negativas, de 16-bit TIFF (Figura 3). </li><li> Calcular la intensidad integral de cada mancha usando Xplore Software de procesamiento de imágenes (LabNEXT) equipado con una herramienta de cuadrícula automatizado. La intensidad de la mancha integral se deriva de la suma de los píxeles en el área de rejilla que rodean a cada punto. </li><li> Los datos de la cuadrícula para cada microarray se exporta como un archivo de texto y se puede importarse manualmente en una hoja de cálculo Excel para su análisis. Una herramienta en línea ( <a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/</a> ) ha sido desarrollado para traducir automáticamente y procesar los datos de cada archivo de txt. </li><li> La intensidad de la mancha integral se promedia a través de la impresión repeticiones y diluciones para obtener un lugar &quot;justo mediointensidad &quot;valor para cada muestra (Figura 2). Alternativamente, las señales de mancha correspondiente al valor de dilución sólo uno en la matriz se utilizan para cuantificar la abundancia relativa de glicano epítopo para cada muestra. </li><li> Las intensidades relativas medias al contado entre las diferentes muestras se presentan como un mapa de calor (Figura 4) utilizando el formato condicional en Excel o HeatMapper herramientas en línea ( <a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm</a> ). Los datos para cada tipo de anticuerpo se corrige a 100 y un valor de corte de 5% se impone para eliminar la señal de fondo y los falsos positivos. </li></ol>

<ol><li>Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+models+of+primary+cell+walls+in+flowering+plants%3A+consistency+of+molecular+structure+with+the+physical+properties+of+the+walls+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth.</a> Plant J. 3, 1-30 (1993).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofuels.</a> Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).</li>
<li>Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+degree+and+pattern+of+methyl-esterification+of+pectic+homogalacturonan+in+plant+cell+walls.+implications+for+pectin+methyl+esterase+action%2C+matrix+properties%2C+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion.</a> J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).</li>
<li>Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+walls%3A+the+skeleton+of+the+plant+world%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cell walls: the skeleton of the plant world.</a> Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).</li>
<li>Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+plant+cell+wall%3A+searching+for+the+genes+that+define+structure%2C+architecture+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics.</a> Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).</li>
<li>Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+family+of+Arabidopsis+genes+related+to+xyloglucan+fucosyltransferase1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1.</a> Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).</li>
<li>Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant cell walls.</a> Science. 306, 2206-2211 (2004).</li>
<li>Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillats%2C+WGT+%22The+Plant+Cell+Wall%22">The Plant Cell Wall</a>. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).</li>
<li>Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies.</a> Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).</li>
<li>Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+cell-wall+polymers+within+and+between+plants+using+novel+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays.</a> The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+characterization+of+plant+cell+walls+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).</li>
<li>Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+plant+cell-wall+polysaccharide+decomposition+in+leaf-cutting+ant+fungus+gardens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens.</a> PLoS One. 6 (3), e17506(2011).</li>
<li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+procedures+for+the+determination+of+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. , In Press (2012).</li>
<li>Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+methyl+hexagalacturonate+hapten+inhibitors+of+anti-homogalacturonan+monoclonal+antibodies+LM7%2C+JIM5+and+JIM7%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7.</a> Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).</li>
<li>Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+complexity+of+arabinan+polysaccharides+and+their+processing+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls.</a> Plant J. 59, 413-425 (2009).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNIT+12.10+Preparation+and+Analysis+of+Glycan+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2011).</li>
<li>McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+plant+cell+walls+by+microbial+xylan-specific+carbohydrate-binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules.</a> PNAS. 103, 4765-4770 (2006).</li>
<li>Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eli1+mutation+reveals+a+link+between+cell+expansion+and+secondary+cell+wall+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 127, 3395-3405 (2000).</li>
<li>Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-Function+Mutation+of+REDUCED+WALL+ACETYLATION2+in+Arabidopsis+Leads+to+Reduced+Cell+Wall+Acetylation+and+Increased+Resistance+to+Botrytis+cinerea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea.</a> Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).</li>
<li>Updegraff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).</li>
<li>21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+monoclonal+antibodies+against+plant+cell+wall+glycans+by+hierarchial+clustering+of+their+carbohydrate+microarray+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles.</a> Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+linkage+%281%E2%86%923%29%2C%281%E2%86%924%29-%CE%B2-D-glucan+is+not+unique+to+the+Poales+and+is+an+abundant+component+of+Equisetum+arvense+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls.</a> Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).</li>
<li>Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cell+wall+polymers+during+antheridium+development+and+spermatogenesis+in+the+Charophycean+green+alga%2C+Chara%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara.</a> 2104, 1045-1056 (2009).</li>
<li>Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+outer+layer+of+the+primary+cell+wall+joins+elongating+cotton+fibers+into+tissue-like+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles.</a> Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).</li>
<li>Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+Erwinia+chrysanthemi+pectin+methylesterase+variants+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays.</a> Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

CoMPP es un método rápido y sensible para perfilar la composición glicanos de cientos de plantas derivadas de las muestras en cuestión de días. Este método complementa las plataformas de glicano ya disponibles bacterianas o de mamíferos de matriz para cribado de alto rendimiento de las interacciones de hidratos de carbono con glicanos de proteínas de unión tales como lectinas, receptores, y anticuerpos 16. Con una gran diversidad de sondas disponibles para la detección de glucanos de la pared celular, es posi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> 3 mm de carburo de tungsteno bolas </td><td> Qiagen </td><td> 69997 </td><td></td></tr><tr><td> Colección de microtubos (1,2 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 19560 </td><td> 1,5 ml tubos de microcentrífuga también se puede utilizar </td></tr><tr><td> Qiagen TissueLyser II </td><td> Qiagen </td><td> 85300 </td><td></td></tr><tr><td> 3 perlas de vidrio mm </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z143928 </td><td></td></tr><tr><td> CDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 34588 </td><td></td></tr><tr><td> Óxido de cadmio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 202894 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-diaminoetano </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 03550 </td><td></td></<html> tr&gt; <tr><td> Membrana de nitrocelulosa (0,22 micras de tamaño de poro) </td><td> GE Water &amp; Process Technologies </td><td> EP2HY00010 </td><td> diferentes membranas de tamaño de poro son adecuados para diferentes tipos de anclaje </td></tr><tr><td> Xact II microarrayer robot </td><td> Labnext </td><td> 001A </td><td> la Xact II robot fue equipado con una costumbre 20 x 20 cm de placa cerámica a la que se une la membrana de nitrocelulosa </td></tr><tr><td> Xtend pins RM microarrays </td><td> Labnext </td><td> 0037-350 </td><td> pins deben ser adecuados para manchas en membranas </td></tr><tr><td> Placas de microtitulación de 384 pocillos (polipropileno) </td><td> Greiner </td><td> 781207 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-glicanos anticuerpos monoclonales </td><td> Sondas vegetales / CarboSource / Biosupplies </td><td></td><td> Sitios Web; PlantProbes ( <a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a> ), Carbosource (ww.carbosource.net &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.carbosource.net) y Biosupplies ( <a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a> ). </td></tr><tr><td> IgG anti-rata (molécula completa) - anticuerpo peroxidasa producida en cabra. </td><td> Sigma </td><td> A9037 </td><td> el tipo de anticuerpos secundarios depende del anticuerpo primario utilizado (por ejemplo, criado en rata, ratón de cabra, etc,). </td></tr><tr><td> SIGMA RÁPIDO 3,3 &#39;-diaminobenzidina tabletas </td><td> Sigma </td><td> D4293 </td><td> el tipo de desarrollo de reactivo depende de los anticuerpos secundarios utilizados y el método de detección (colourmetric, o chemiluminecent). </td></tr><tr><td> SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente </td><td> Thermoscientific </td><td> 34080 </td><td> véase anteriormente </td></tr><tr><td> Xplore Software de procesamiento de imágenes </td><td> LabNext </td><td> 008 </td><td> muchos tipos de software con herramientas automáticas de grillado disponiblespara medir el valor de píxel de manchas de microarrays. </td></tr><tr><td> Polisacáridos de plantas </td><td> Sigma / Megazyme </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

perfiles de polímeros glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Paredes celulares de las plantas son matrices complejas de los glicanos heterogéneos, que desempeñan un papel importante en la fisiología y el desarrollo de las plantas y proporcionar las materias primas para las sociedades humanas (por ejemplo, industrias de la madera, papel, textiles y de biocombustibles) 1,2. Sin embargo, la comprensión de la biosíntesis y función de estos componentes sigue siendo un reto. Glucanos de la pared celular son químicamente y conformacionalmente diversa debido a la complejidad de sus bloques de construcción, los residuos de glicosilo. Estos forman uniones en las posiciones múltiples y difieren en estructura de anillo, configuración isomérica o anomérico, y además, están sustituidos con una matriz de no azúcar residuos. Glycan composición varía en células diferentes y / o tipos de tejidos o incluso sub-dominios de una sola célula de la pared 3. Además, su composición también se modifica durante el desarrollo 1, o en respuesta a señales ambientales 4. En exproceso de 2.000 genes tienen paredes celulares de las plantas son matrices complejas de los glicanos heterogéneos ha previsto que participen en la biosíntesis de la pared celular y la modificación de glicanos en Arabidopsis 5. Sin embargo, relativamente pocos de los genes biosintéticos se han caracterizado funcionalmente 4,5. Ida y enfoques de genética son difíciles debido a que los genes son a menudo expresados ​​diferencialmente, a menudo a niveles bajos, entre los tipos de células 6. Además, los estudios mutantes son a menudo obstaculizado por la redundancia de genes o mecanismos compensatorios para asegurar el funcionamiento adecuado de la pared celular se mantiene 7. Así, nuevos enfoques son necesarios para caracterizar rápidamente la diversa gama de estructuras de glucanos y para facilitar enfoques de la genómica funcional para la biosíntesis de la pared celular y la comprensión modificación. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) 8,9 han surgido como una herramienta importante para determinar la estructura de glicano y distribución en las plantas. En ellos se reconoce distINCT presentes dentro de las principales categorías de glicanos la pared celular vegetal, incluidas las pectinas, xiloglucanos, xilanos, mananos, glucanos y arabinogalactanos epítopos. Recientemente su uso se ha extendido a los experimentos de cribado a gran escala para determinar la abundancia relativa de los glicanos en una amplia gama de plantas y tipos de tejidos simultáneamente 9,10,11. Aquí presentamos un método basado en micromatrices glicano exploración llamada integral Microarray de perfiles de polímero (CoMPP) (Figuras 1 y 2) 10,11 que permite múltiples muestras (100 segundos) para ser seleccionados utilizando una plataforma de microarrays miniaturizado con reactivo reducida y volúmenes de muestra. Las señales de punto del microarray puede ser formalmente cuantificados para dar semi-cuantitativos de los datos sobre la ocurrencia glycan epítopos. Este método es muy adecuado para el seguimiento de los cambios en glicanos complejos sistemas biológicos 12 y que proporciona una visión global de la composición de la pared celular en particular cuando el conocimiento previo of este no estará disponible.

La abundancia relativa de los glicanos en seis tipos de tejido (filamentos de anteras, polen, ovarios, pétalos, sépalos y el estigma) de Nicotiana alata flores se determinó usando CoMPP. La Figura 3A muestra un microarray representante que se ha sondeado con mAb específico para JIM5 parcialmente (bajo) methylesterified homogalacturonan (HG), un epítopo que se produce en polisacáridos pécticos 14. El epítopo JIM5 se detecta en extractos CDTA de todos los tejidos de las flores sin embargo es más alta e...

Una técnica llamada<strong&gt; C</strong&gt; Omprehensive<strong&gt; M</strong&gt; Icroarray<strong&gt; P</strongProfiling&gt; olymer (CoMPP) para la caracterización de los glicanos la pared celular vegetal se describe. Este método combina la especificidad de los anticuerpos monoclonales dirigidos a epítopos definidos glicano con una miniatura plataforma de microarrays analítico que permite detección de la ocurrencia de glicanos en una amplia gama de contextos biológicos.

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Las paredes celulares vegetales son matrices complejas de glycanos heterogéneos que desempeñan un papel importante en la fisiología y el desarrollo de las plantas y proporcionan el...

El objetivo general de este procedimiento es comparar la composición de polímeros de la pared celular en una amplia gama de plantas o tipos de tejidos mediante el uso de microarreglos de glicanos. Primero, recolecte los tejidos vegetales de interés. Después de la homogenización, prepare los residuos insolubles en alcohol.Luego extraiga secuencialmente los glicanos de la pared celular utilizando CDTA e hidróxido de sodio. A continuación, imprima los extractos de glicanos de la pared celular en un microarreglo mediante un robot. Sonda los microarreglos con anticuerpos monoclonales dirigidos a los glicanos de la pared celular y cuantifique las señales de los puntos en los microarreglos.En última instancia, los resultados pueden utilizarse para determinar la abundancia relativa de epítopos de glicanos en un conjunto de muestras de interés. Desarrollamos este método de microarreglo cuando reconocimos la necesidad de obtener una instantánea global de la presencia de glicanos de la pared celular en múltiples tipos de tejidos vegetales simultáneamente y detectar diferencias en su composición. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a métodos tradicionales, como el análisi

glycan-profiling-of-plant-cell-wall-polymers-using-microarrays

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La biomasa vegetal es uno de los principales de carbono-neutral recurso renovable que podría ser utilizado para la producción de biocombustibles. La biomasa vegetal se compone principalmente de las paredes celulares, un material compuesto estructuralmente complejos denomina lignocelulosa. Aquí se describe un protocolo para un análisis exhaustivo del contenido y la composición de los hidratos de carbono de pared derivados.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

Una manera rápida se describe para obtener información sobre la estructura de los polisacáridos en una matriz extracelular. El método tiene la ventaja de la especificidad de glycosylhydrolases y la sensibilidad de la espectrometría de masas permite pequeñas cantidades de materiales para ser analizados. Esta técnica se puede adaptar para utilizarse directamente sobre el tejido en sí.

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

La celulosa cristalina es un componente importante de la pared celular de la planta. Sin embargo, su cuantificación a una resolución celular es técnicamente desafiante.  Aquí, reportamos el uso de la tecnología de luz polarizada y secciones transversales de raíces para obtener información de la composición de la pared celular a una resolución espacio-temporal.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de las secuencias reductoras de glicosil extremo (RE) e interno de los heteroxilanos mediante el marcaje del RE con 2 aminobenzamida antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa) y luego el análisis de los oligosacáridos resultantes mediante espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

Un protocolo para el análisis estructural de polisacáridos por electroforesis del gel (PACE), usando Manano como ejemplo, se describe.

Caracterización estructural de polisacáridos de pared celular mananos en plantas con ritmo

Describimos un método simple y rápido para la preparación y análisis de N- glicanos de diferentes variedades de rábano (Raphanus sativus).

Análisis de N- glicanos de Raphanus sativus variedades usando PNGasa H+

Se presenta un protocolo para preparar 13C,15marcado con N muestras de hongos y plantas para espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional y las investigaciones de la polarización nuclear dinámica (DNP).

Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica

Este protocolo describe en detalle cómo se fija el material vegetal para la inmunolocalización de proteínas y pectinas arabinogalactanas, incrustado en una resina acrílica hidrófila, seccionado y montado en toboganes de vidrio. Mostramos que los epítopos relacionados con la pared celular se detectarán con anticuerpos específicos.

Inmunolocalización fluorescente de proteínas arabinogalactanas y pectinas en la pared celular de los tejidos vegetales

El perfil de polímeros de microarrays (MAPP) es una técnica de alto rendimiento para el análisis de la composición de glicanos en muestras biológicas.

Perfil de polímeros de microarrays (MAPP) para análisis de glicanos de alto rendimiento

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Aprenda a caracterizar glicanos de la pared celular vegetal mediante CoMPP, un método de microarrays con anticuerpos monoclonales que permite analizar cientos de muestras simultáneamente. Esta técnica facilita estudios de biología vegetal.

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Explorar más videos