Name: Drenaje Manual de los ventrículos del cerebro embrionario de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprende el drenaje manual de líquido cefalorraquídeo embrionario de los ventrículos cerebrales de Danio rerio para estudiar neurodesarrollo. Este método permite analizar la composición del líquido y su función en la división celular y neurogénesis.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental, y la National Science Foundation. Un agradecimiento especial a la Dra. Jen Gutzman, la Dra. Amanda Dickinson y otros miembros del laboratorio Sive para muchas discusiones útiles y críticas constructivas, y Olivier Paugois para la cría de peces experto.

1. Preparación de agujas de microinyección y tranvía Celular <ol><li> Llenar Eppendorf CellTram aceite aparato microinyector con aceite mineral de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar agujas de microinyección tirando tubos capilares utilizando Sutter extractor aguja instrumentos. </li><li> Montar la aguja en micromanipulador Eppendorf CellTram conectado a. </li><li> Corte cuidadosamente la punta de la aguja. Para el tamaño de punta uniforme, medir con un micrómetro, o comparar a una aguja de referencia. </li><li> Llene la longitud de la aguja con aceite, usando la CellTram para empujar el aceite hacia abajo de la longitud, teniendo cuidado de evitar cualquier burbuja. </li></ol> 2. Preparación de los embriones <ol><li> Hacer agujeros en un 1% de agarosa al plato cubierto con una punta de pipeta 1-200 l, y eliminar bloques de agarosa. Rellene plato con los medios de embriones (hechas de acuerdo con Westerfield 25). </li><li> Utilizando pinzas, embriones dechorionate bajo microscopio estereoscópico. </li><li> Transferencia de embriones dechorionateden la fuente de agarosa recubierta. </li><li> Para anestesiar embriones, añadir tricaína (0,1 mg / ml) a plato de agarosa hasta que dejan de moverse embriones (hecho de acuerdo con Westerfield 25). </li></ol> 3. Vaciado del ECSF <ol><li> Orientar los embriones con sus colas en los agujeros de la agarosa y sus lados posteriores más cercanos a la micromanipulador, permitiendo la visualización de la cara dorsal del cerebro. </li><li> Colocar la aguja en el rhombomere 0/1 bisagra de punto o el punto más ancho de hindbrain ventrículo (Figura 1A). </li><li> Con cuidado, perfore placa del techo del ventrículo cerebro posterior asegurándose de no pasar por la profundidad del cerebro en la yema. </li><li> Vacíe el ECSF utilizando el CellTram y recoger el líquido en la aguja de microinyección. Tenga cuidado de evitar cualquier célula. </li></ol> 4. La recolección de la ECSF para el Análisis de Composición <ol><li> Una vez que el ECSF se recoge en la aguja, cuidadosamente detener la succión de la CellTram. </li><li> MoVE el plato de debajo de la aguja y colocar la aguja cuidadosamente en un tubo que contiene el tampón deseado. </li><li> Uso de la CellTram, drenar el ECSF de la aguja en el tampón tratando de evitar la contaminación de la solución con aceite. </li><li> Con el fin de eliminar las células que se han aspirado junto con el ECSF ECSF, centrifugado a 10.000 x g. Recoger no contaminada ECSF (sobrenadante) y se almacena a -80 ° C hasta que esté listo para su posterior análisis. </li></ol> 5. La reintroducción de factores seleccionados <ol><li> Vacíe el ECSF cada 2 h durante el intervalo de tiempo deseado, ya que el líquido se repone dentro de ese período de tiempo. Entre los puntos temporales de drenaje, retire la aguja y almacenar los embriones a 28,5 ° C o temperatura deseada. </li><li> Coloque la aguja micropipeta segundo factor de la prueba. </li><li> Coloque la aguja en micromanipulador unido a microinyector. </li><li> Ajustar el volumen de inyección de 1 nl midiendo el tamaño de gota en el tiempo de inyección de aceite y regulación y presión. </li><li> Inyectar 1-2 nl en los ventrículos del cerebro como se ha descrito previamente 26. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El uso de esta técnica para drenar manualmente ECSF desde los ventrículos del cerebro del pez cebra será útil para determinar el requisito de ECSF durante el desarrollo. Además, esta técnica permitirá descripción del perfil de proteínas ECSF en el curso del desarrollo embrionario. Identificación de proteínas diferentes durante este tiempo permitirá una mayor investigación en la función del CSF y su posible papel en el desarrollo cerebral. En amniotas, algunos factores identificados en ECSF (IGF2, FGF2, ácido retinoico, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Eppendorf CellTram Petróleo </td><td> Eppendorf </td><td> 516 000.025 </td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td></tr><tr><td> Tricaína polvo </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Los tubos capilares </td><td> FHC Inc. </td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

drenaje manual de los ventrículos del cerebro embrionario de pez cebra

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un líquido rico en proteínas contenidas dentro de los ventrículos cerebrales. Está presente durante el desarrollo embrionario temprano de vertebrados y persiste durante toda la vida. Adulto CSF se piensa para amortiguar el cerebro, eliminar los desechos, y llevar a 1,2 secretada moléculas. En el embrión y adulto mayor, la mayoría de los CSF se hace por el plexo coroideo, una serie de regiones altamente vascularizados secretoras situados adyacentes al cerebro ventrículos 3-5. En el pez cebra, el plexo coroideo está completamente formado a 144 horas después de la fertilización (hpf) 6. Antes de esto, en embriones de vertebrados tanto pez cebra y otros incluyendo el ratón, una cantidad significativa de embrionario CSF ​​(ECSF) está presente. Estos datos y los estudios sugieren que el polluelo en el neuroepitelio es secretora temprana en el desarrollo y puede ser la fuente principal de ECSF antes de plexo coroideo desarrollo 7. ECSF contiene aproximadamente tres veces más proteínas tHan adulto CSF, sugiriendo que podría tener un papel importante durante el desarrollo 8,9. Los estudios en pollo y ratón demuestran que los factores secretados en el ECSF, la presión del fluido, o una combinación de éstos, son importantes para la neurogénesis, la expresión de genes de supervivencia, la proliferación celular y de la célula en el neuroepitelio 10-20. Análisis proteómico de rata humana, el ratón y el pollo ECSF han identificado muchas proteínas que pueden ser necesarios para la función LCR. Estos incluyen componentes de la matriz extracelular, apolipoproteínas, proteínas que regulan la presión osmótica, y proteínas implicadas en la muerte celular y la proliferación 21-24. Sin embargo, las funciones complejas de la ECSF son en gran medida desconocidos. Hemos desarrollado un método para eliminar ECSF desde los ventrículos del cerebro del pez cebra, permitiendo así la identificación de los componentes ECSF y para el análisis de la exigencia ECSF durante el desarrollo. Aunque más ECSF se pueden obtener de otra w sistemas de vertebradosith embriones más grandes, ECSF se pueden recoger de las primeras etapas del desarrollo del pez cebra, y bajo condiciones genéticas o ambientales que conducen a volumen anormal ventrículo cerebral o en la morfología. La eliminación y recogida de ECSF permite el análisis de espectrometría de masas investigación, de la función ECSF, y la reintroducción de los factores seleccionados en los ventrículos para ensayar su función. Por lo tanto la accesibilidad del embrión de pez cebra temprana permite el análisis detallado de la función ECSF durante el desarrollo.

Un ejemplo de un ventrículo cerebral escurrido se muestra en la figura 1B-C. Ventrículos cerebrales se derrumbó ya que carecen de ECSF (Figura 1B vs C). Como se ve en las imágenes dorsales (Figura 1B-C, y la Figura 2A-D) del neuroepitelio hindbrain retiene su morfología característica y parece estar abierto a pesar de la falta de ECSF probable debido a las robustas de bisagras puntos. Sin embargo, las vistas laterales (Figura 2A&#39;-D &#39;)</s...

Se presenta un método para recoger líquido cefalorraquídeo (LCR) y para crear un sistema que carece de CSF dentro del sistema ventricular del cerebro embrionario de pez cebra. Esto permite un examen más detenido de la composición de CSF y sus requerimientos durante el desarrollo embrionario del cerebro.

Drenaje Manual de los ventrículos del cerebro embrionario de pez cebra

El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un fluido rico en proteínas contenido dentro de los ventrículos cerebrales. Está presente durante el desarrollo embrionario temprano de los vertebrados y...

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema que carezca de líquido cefalorraquídeo o CSF dentro del sistema ventricular del cerebro embrionario. Esto se logra primero drenando manualmente el líquido cefalorraquídeo embrionario o ECSF de los ventrículos cerebrales del pez cebra. A continuación, el ECSF se recoge para un análisis posterior de su contenido.Luego, los factores potenciales se reintroducen en los ventrículos cerebrales drenados. Finalmente, se analiza la eliminación efectiva del LEC y la reintroducción de factores sobre el desarrollo cerebral. En última instancia, la función del LEC de pez cebra puede demostrarse mediante el monitoreo de aspectos del desarrollo cerebral, como la división celular, la muerte celular y la neurogénesis.Además, el contenido del LCE puede determinarse mediante espectrometría de masas. Mediante esta técnica, podemos comenzar a estudiar la función del líquido cefalorraquídeo embrionario durante el desarrollo. También puede aplicarse a otros sistemas para comprender mejor las enfermedades que alteran la composición y los volúmenes del LCE, como la hidrocefalia.Para comenzar, llene un aparato inyector de aceite con aceite mineral

manual-drainage-of-the-zebrafish-embryonic-brain-ventricles

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Después de la formación del tubo neural, el neuroepitelio se contrae y se dobla mientras que el tubo se llena de líquido cefalorraquídeo embrionarias (ECSF) para formar los ventrículos del cerebro embrionario. Hemos desarrollado esta técnica de inyección del ventrículo para visualizar mejor el espacio lleno de líquido, en contraste con la forma neuroepitelial en un embrión vivo.

Cerebro del pez cebra ventrículo inyección

Se describe una medición vivo animal entero cuantitativo para la permeabilidad del cerebro embrionario de pez cebra. La técnica analiza la capacidad de retener el líquido cefalorraquídeo y moléculas de diferentes pesos moleculares dentro del lumen del tubo neural y cuantifica su movimiento de salida de los ventrículos. Este método es útil para determinar las diferencias en la permeabilidad epitelial y maduración durante el desarrollo y la enfermedad.

Un ensayo para la permeabilidad del neuroepitelio embrionario de pez cebra

Este video describe la técnica de microdisección del cerebro de un pez cebra adulto. Este método ayuda a obtener neuorosferas derivadas de todo el cerebro que se pueden estudiar más a fondo.

Disección del cerebro del pez cebra: una técnica de neurobiología de peces

Este video demuestra la generación y diferenciación de neuroesferas primarias. Las células madre neurales del pez cebra, en presencia de factores de crecimiento, proliferan en neuroesferas que flotan libremente con capacidad de autorrenovación, que luego se diferencian en células gliales y neuronas.

Generación y diferenciación de neuroesferas primarias a partir de células madre neurales de pez cebra

Fuente: Schramm, P. et al. Obtención de imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extracción de cráneo y piel. J. Vis. Exp. (2021)Este video muestra la imagen in vivo de neuronas cerebelosas en larvas de pez cebra transgénicas, que expresan proteínas fluorescentes en neuronas de Purkinje. El proceso consiste en anestesiar las larvas, inmovilizarlas en agarosa y eliminar cuidadosamente la piel pigmentada para mejorar la...

Imágenes in vivo del cerebro de larvas de pez cebra para visualizar neuronas cerebelosas

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

Aquí se proporciona un método reproducible para examinar la neurogénesis adulta usando un ensayo de neurosphere derivado de todo el cerebro o ya sea del telencephalic, tectal o regiones del cerebelo del cerebro adulto de pez cebra. Además, se describe el procedimiento para manipular la expresión génica en neuroesferas de pez cebra.

Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivada de cerebro de adultos de pez cebra

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Aprende el drenaje manual de líquido cefalorraquídeo embrionario de los ventrículos cerebrales de Danio rerio para estudiar neurodesarrollo. Este método permite analizar la composición del líquido y su función en la división celular y neurogénesis.

Drenaje Manual de los ventrículos del cerebro embrionario de pez cebra

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