Name: Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprenda a modificar superficies virales mediante química click bioortogonal utilizando adenovirus tipo 5. Este método flexible permite la unión de sondas fluorescentes para mejorar la entrega génica dirigida en aplicaciones terapéuticas.

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<ol><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+%22Clickable%22+Amino+Acids+and+Sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors%3A+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li>
<li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li>
<li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+%28Ad%29+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li>
<li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Strain-Promoted+%5B3+%2B+2%5D+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El desarrollo de las reacciones y haga clic en quimioselectiva bioorthogonal, incluidos los de azidas, es una zona de rápida evolución de la investigación, y, posteriormente, hay un creciente número de estas reacciones a elegir para aplicaciones bioconjugation. Hemos limitado el alcance de este protocolo para incluir sólo dos métodos que fueron escogidos debido a su utilidad en nuestro propio laboratorio y la disponibilidad comercial de todos los reactivos. En la ruta tales primera - cepa-pr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Adenovirus tipo 5 (Ad5), que contiene un transgén GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> De riñón embrionario humano (HEK 293) células </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle modificado (DMEM), glucosa alta </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modificado de Eagle Medium, sin metionina, sin cisteína (DMEM-Met /-Cys), glucosa alta </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Becerro de suero bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> La penicilina - estreptomicina 100 × Solución (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% de tripsina-EDTA (10 x) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> Celular 100 mm cultura plato, cultivo de tejidos de poliestireno tratada </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Cultivo de células incubadora de CO 2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Seguridad de la Biotecnología del gabinete </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estéril filtro de jeringa (0,2 micras, acetato de celulosa) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti JE centrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Tubos cónicos (50 ml, estéril) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tubo, de paredes finas, con claridad, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga equipado con un 41 SW y SW 60 rotor </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubos, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifugar 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep columnas de filtración de gel de giro </td><td> Princeton separaciones </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Aguja estéril de calibre 18 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El nitrógeno bolsa de guantes (si CuAAC desoxigenada se va a realizar) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar frasco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nitrógeno líquido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La electroforesis de células </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Escáner de gel fluorescente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Preparado gel de Tris-HCl gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biociencias </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (Hch 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Batofenantrolina disulfónico (BDA) sal disódica </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base Tris (tris (hidroximetil) aminometano) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato disódico (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> HCl 1M </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metionina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodecilsulfato de sodio) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El cloruro de cesio (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> De cobre (I) bromuro (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de calcio (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio (KCL) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De cloruro de sodio (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Acetilénicos sonda para CuAAC * </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA acetilénicos </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Tensa la sonda de alquino * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO acetilénicos </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Los vendedores destacados de reactivos de química y haga clic en kits incluyen Invitrogen, Biociencias de Jena, los asociados de Berry, Sigma-Aldrich, Investigación Glen, haga clic en Herramientas de Química, y Baseclick. Una variedad de tintes alquino y ligandos dirigidos se pueden encontrar en los catálogos de estos vendedores.

modificación de superficies quimioselectiva virales a través de química haga clic en bioorthogonal

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

La modificación de las partículas del virus ha recibido una cantidad significativa de la atención por su enorme potencial para impactar en la terapia génica, aplicaciones y desarrollo de vacunas oncolíticos. 1,2,3 Los enfoques actuales para la modificación de las superficies virales, que son en su mayoría basado en la genética, a menudo sufren de atenuación de producción de virus, la infectividad y celulares de transducción de 4,5. Uso de la química clic quimioselectiva, hemos desarrollado un método alternativo sencillo que deja de lado estos temas sin dejar de ser altamente flexible y accesible. 1,2 El objetivo de este protocolo es demostrar la efectividad del uso de la química clic bioorthogonal para modificar la superficie de adenovirus tipo 5 partículas. Este proceso de dos pasos puede ser utilizado tanto terapéuticamente 1 o analíticamente, 2,6, ya que permite la ligadura quimioselectiva de moléculas dirigidas, colorantes u otras moléculas de interés en las proteínaspre-etiquetados con etiquetas de azida. Las tres principales ventajas de este método son que (1) marcado metabólico demuestra poco o ningún impacto en la replicación viral, 1,7 (2) una amplia gama de ligandos efectores pueden ser utilizados, y (3) es muy rápido, fiable y de fácil acceso. 1,2,7 En el primer paso de este procedimiento, se producen partículas de adenovirus teniendo cualquiera azidohomoalanine (Aha, un sustituto metionina) o el azúcar no natural O-N-ligados azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos de los cuales contienen la azida (-N 3) funcional grupo. Después de la purificación de las partículas del virus azida modificados, una sonda fluorescente alquino que contiene el resto TAMRA se liga de manera quimioselectiva a las proteínas pre-etiquetados o glicoproteínas. Finalmente, un análisis de SDS-PAGE se realizó para demostrar la ligadura con éxito de la sonda sobre las proteínas de la cápside viral. Incorporación de Aha se muestra a etiquetar todos cápside viralproteínas (Hexon, Penton y fibra), mientras que O-GlcNAz resultados incorporación en el etiquetado de fibra óptica sólo. En este campo en evolución, múltiples métodos para la ligadura de azida-alquino se han desarrollado con éxito, sin embargo, sólo los dos que hemos encontrado para ser más conveniente se ha demostrado en este documento - la cepa promovido azida-alquino cicloadición (SPAAC) y el cobre-catalizada cicloadición azida-alquino (CuAAC) bajo una atmósfera desoxigenada.

Partículas de adenovirus se han diseñado para contener la natural azidohomoalanine análogo del ácido amino o el azúcar azida<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. El grupo azida de cada uno se quimioselectivamente ligó a través de reacciones químicas &quot;clic&quot; cuando un medio de modificación de la superficie vírica.

Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal

La modificación de las partículas virales ha recibido una atención considerable debido a su enorme potencial para impactar en la terapia génica, la oncolítica...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método flexible para reingenierizar las superficies virales mediante química click. En el primer paso de este procedimiento, células renales embrionarias humanas son infectadas con adenovirus de tipo cinco y cultivadas en presencia de un aminoácido no natural, homoalanina o el azúcar N-acetoacetil glucosamina. Después de dos días, las partículas de adenovirus marcadas con azida se recolectan y purifican.A continuación, se utiliza la cicloadición azid-ino específica por quimioaceleración para ligar sondas fluorescentes a la superficie de estas partículas. Como se explica en el protocolo escrito, este procedimiento se lleva a cabo mediante uno de dos posibles métodos de ligación: promovido por tensión o catalizado por cobre, la cicloadición azid-ino.En aplicaciones terapéuticas, estos enlaces pueden incluir polímeros de polipéptidos o moléculas pequeñas. En este experimento, se utiliza una sonda fluorescente para demostrar la ligación de la sonda a las proteínas de la cápside mediante electroforesis en gel SDS-PAGE. Existe un gran interés en desarrollar virus como agentes de entrega génica, particularmente en el contexto de te

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno.

Microfluidic Reacción en el chip de captura-cicloadición para inmovilizar reversiblemente pequeñas moléculas o estructuras de múltiples componentes para aplicaciones de biosensores

Este método describe el uso de la química clic para medir los cambios en la transcripción de la célula huésped después de la infección con el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) cepa MP-12. Los resultados se pueden visualizar a través de microscopía de fluorescencia cualitativamente o cuantitativamente obtenerse a través de citometría de flujo. Este método es adaptable para su uso con otros virus.

Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis

Aquí, presentamos un protocolo para introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida, y posteriormente acoplar la azida con una sonda química mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

Hemos diseñado la proteína de la cápside del virus de la hepatitis E como una nanopartícula de teranosis (HEVNP). HEVNP uno mismo-monta en una jaula icosaédrica estable en la prestación de la mucosa. Aquí, describimos la modificación de HEVNPs para el tumor por mutando residuos superficie expuesta a las cisteínas, que conjugan sintético ligandos que se unen específicamente a las células del tumor.

Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.

Lo verbal-inducida fluorescentes pegilado Virus-como partículas por disulfuro de Dibromomaleimide química

El protocolo aquí descrito permite a los investigadores modificar específicamente cápsida de adenovirus en sitios seleccionados por simple química. Blindado adenovirus vectores partículas pueden generarse vectores de transferencia génica versión y vector host interacciones pueden ser estudiadas.

Combinado de modificaciones genéticas y químicas cápside de vectores basados en Adenovirus la transferencia de genes para blindar y dirigidos a

Se presenta un protocolo para la síntesis y medición de las propiedades fotoquímicas de compuestos modulares enjaulados con mitades clicables.

Diseño, síntesis y propiedades fotoquímicas de compuestos enjaulados enjaulados clicables

El estudio de la acilación grasa tiene importantes implicaciones en las interacciones y enfermedades de las proteínas celulares. Aquí se presenta un protocolo modificado para mejorar la detección química de clics de proteínas aciladas grasas, que se puede aplicar en varios tipos de células y combinarse con otros ensayos, incluida la persecución de pulsos y la espectrometría de masas.

Incorporación optimizada de análogos de ácidos grasos alquilinos para la detección de proteínas aciladas grasas utilizando Click Chemistry

Aquí, proponemos un protocolo simple que combina ingeniería de oligosacáridos metabólicos, química de clic y microscopía de expansión que permite la obtención de imágenes de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares con resolución mejorada utilizando equipos de microscopía de rutina.

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Aprenda a modificar superficies virales mediante química click bioortogonal utilizando adenovirus tipo 5. Este método flexible permite la unión de sondas fluorescentes para mejorar la entrega génica dirigida en aplicaciones terapéuticas.

Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal

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