Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método flexible para reingenierizar las superficies virales mediante química click. En el primer paso de este procedimiento, células renales embrionarias humanas son infectadas con adenovirus de tipo cinco y cultivadas en presencia de un aminoácido no natural, homoalanina o el azúcar N-acetoacetil glucosamina. Después de dos días, las partículas de adenovirus marcadas con azida se recolectan y purifican.

A continuación, se utiliza la cicloadición azid-ino específica por quimioaceleración para ligar sondas fluorescentes a la superficie de estas partículas. Como se explica en el protocolo escrito, este procedimiento se lleva a cabo mediante uno de dos posibles métodos de ligación: promovido por tensión o catalizado por cobre, la cicloadición azid-ino.

En aplicaciones terapéuticas, estos enlaces pueden incluir polímeros de polipéptidos o moléculas pequeñas. En este experimento, se utiliza una sonda fluorescente para demostrar la ligación de la sonda a las proteínas de la cápside mediante electroforesis en gel SDS-PAGE. Existe un gran interés en desarrollar virus como agentes de entrega génica, particularmente en el contexto de terapias, entrega génica, terapia oncolítica y tecnología de vacunas.

En ese contexto, ajustar la interfaz virus-huésped es particularmente importante en cuanto a obtener las propiedades adecuadas para la estimulación inmune dirigida al tejido terapéutico. Una serie de otros factores son importantes en cuanto al ajuste de la interfaz huésped-virus. En ese contexto, hemos desarrollado un protocolo de etiquetado en dos pasos.

El primer paso es la introducción metabólica de un aminoácido no natural o un azúcar no natural. Esto instala un punto de anclaje que luego podemos ampliar con químicas extremadamente selectivas, mediante las cuales podemos agregar a esos virus prácticamente cualquier funcionalidad deseada sin perturbar significativamente al virus, su infectividad o su aptitud general, lo cual representa una gran barrera, un obstáculo importante que superar. Después de esterilizar la cabina y el equipo de laboratorio, prepare 11 placas de cultivo de 100 milímetros con células HEK 293 mantenidas en medio de crecimiento HEK a 37 grados Celsius.

Una vez que el cultivo celular alcance una confluencia del 80 al 90 %, retire el medio de crecimiento de uno de los recipientes y lave una vez con tampón TD. Suelte las células con un mililitro de tripsina-EDTA e incube durante un minuto. Añada nueve mililitros de medio de crecimiento y cuente el número de células recolectadas en este recipiente.

Utilizando un citómetro de hemocitos, calcule el número de partículas de adenovirus necesarias para la infección en cada uno de los 10 platos de cultivo restantes. Retire lentamente el medio de crecimiento y luego lave con cinco mililitros de tampón TD. Añada un mililitro de tampón de infección e incube durante una hora en este período.

Agite suavemente las placas de un lado a otro cada 15 minutos tras la infección. Añada cuidadosamente nueve mililitros de medio de crecimiento para HEK a cada placa e incube durante otras 18 horas. A partir de soluciones stock concentradas de una HA en Sistine.

Prepare un medio de etiquetado de HA según el protocolo escrito. Asegúrese de filtrar primero estas soluciones stock con un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros. Esterilice la solución stock de metionina para el control de la misma manera y retire cuidadosamente el medio de crecimiento, lavando cada placa de cultivo con cinco mililitros de tampón TD.

Sustituya esto por 10 mililitros de un medio de etiquetado HA e incube las células infectadas durante otras seis horas. Las proteínas de la cápside viral se traducirán ahora en presencia de azo homo alanina y ausencia de metionina. Sustituya cuidadosamente el medio de etiquetado por 10 mililitros de medio de crecimiento fresco e incube durante otras 18 horas.

Después de completar este paso, continúe con el procedimiento de purificación en el paso tres del video. Alternativamente, las etiquetas azi pueden introducirse mediante azúcares que contienen azi en lugar del aminoácido no natural a HA. En este protocolo, se utiliza un precursor metabólico de parásito, n-acetoacetil galactosamina, relacionado con el UDPN-acetoacetil glucosamina, que se cultiva en presencia de este azúcar aceto.

El adenovirus tipo cinco presentará grupos azi solo en la fibra para realizar la marcación con azúcares. Primero siga el paso uno del video hasta que aparezca la indicación en pantalla. Esto corresponde al paso 1.5 del protocolo escrito.

Prepare la solución de marcado con azúcar pipeteando primero 100 microlitros de la solución stock de azúcar ATO en tubos Falcon y dejando evaporar el metanol. A continuación, agregue 100 mililitros de medio de crecimiento HEK. Cubra las células en cada placa con 10 mililitros de este medio de marcado con azúcar e incube a 37 grados Celsius durante 44 horas.

Continúe con el paso tres para la purificación. Transfiera el medio junto con las células infectadas desde la placa de cultivo a dos tubos cónicos y centrifugue a 2000 G durante 10 minutos. A cuatro grados.

Elimine el sobrenadante y resuspenda cada pellet en cuatro mililitros de tampón TD utilizando nitrógeno líquido en un baño de 37 grados. Realice tres ciclos de congelación-descongelación para lisar las células infectadas. Mezcle la suspensión mediante vortex entre cada ciclo.

Centrifugue la suspensión descongelada a 2000 G durante 10 minutos para precipitar los restos celulares, ya que el adenovirus utilizado para la infección en el paso uno contenía un transgén GFP; la actividad fluorescente en este paso confirma la transducción y la expresión del ADN viral. Prepare cuidadosamente un gradiente de densidad de cloruro de cesio desde 1,25 gramos por mililitro hasta 1,4 gramos por mililitro. Aplique el sobrenadante celular lisado sobre el gradiente de densidad y centrifugue a 126.000 G durante una hora a 15 grados Celsius.

Después de la centrifugación, debería observarse una banda gruesa y ancha en el tubo del centrifugador. Este es el virus modificado con azi. Utilizando una aguja en estrella, punzar la parte inferior del tubo para que el contenido salga gota a gota y recoger cuidadosamente este virus.

La banda de los dos métodos de ligación demostró la deformación. La ruta promovida implica condiciones de reacción más simples, pero tiene la desventaja de una selección más limitada de sondas disponibles comercialmente para realizar la ligación promovida por deformación. Mezcle 50 microlitros de virus modificado con azi en tampón de almacenamiento de virus con 0,25 microlitros de solución de etiquetado Tamara BCN, mezclando mediante golpes suaves en la base del tubo cubierto con papel de aluminio, y rote durante la noche a temperatura ambiente.

Purifique el virus click mediante filtración en gel con centrisub. Gire las columnas equilibradas con tampón de almacenamiento del virus. La cicloadición catalizada por cobre desoxigenado presenta una mayor disponibilidad de sondas, pero tiene el inconveniente de requerir equipos especializados para mantener una atmósfera desoxigenada.

Para realizar la ligación catalizada por cobre, primero desoxigene todos los materiales y soluciones de reacción en una campana de nitrógeno durante seis horas. Tras este periodo, prepare en la campana la solución stock del catalizador de cobre (I) para iniciar la reacción. Añada un microlitro de esta solución stock de cobre a una solución de 50 microlitros que contenga la sonda vírica y el agente quelante.

Deje que la reacción de etiquetado transcurra durante la noche en la cabina de guantes. Purifique mediante filtración según el paso cuatro. Después de hervir, agregue virus purificado, ya clicado, y tampón de muestra lisis durante 10 minutos.

Cargue los pocillos con el virus seleccionado y los controles y realice la electroforesis. Mantenga el tanque cubierto con papel de aluminio para proteger la sonda fluorescente de la luz. Después de una hora, utilice un escáner de geles fluorescentes para escanear el gel.

Téngase en cuenta que los virus intactos o no marcados con I no deben desplazar una marcación fluorescente significativa para una HA, ya que los virus producidos en mayor concentración de una HA muestran una marcación fluorescente más intensa debido a un mayor grado de incorporación de HA. Asimismo, obsérvese que el virus marcado con azúcar expresa etiquetas azi únicamente en la proteína capsídica de fibra. A partir de células con un 80 % de confluencia, se requieren dos días para la infección en la marcación azi, cinco horas para la recolección y purificación del virus marcado, una noche para la reacción "click" y dos horas para el análisis por electroforesis SDS-PAGE, lo que suma un total de tres días y medio. En resumen, se han demostrado dos tipos de métodos de marcación azi y dos reacciones de química "click" azido-alquino.

Su aplicación y recursos deben determinar qué método o métodos son más adecuados para su propósito. Aunque todos los materiales de este protocolo están disponibles comercialmente, hemos encontrado que sintetizar azúcares de HA aceto y sondas INE es significativamente más rentable y ofrece mayor flexibilidad en las modificaciones de la superficie del virus.