Name: Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprende a trazar circuitos neuronales mediante un virus trans-sináptico que utiliza la especificidad del receptor TVA. Este método de alto rendimiento permite analizar microcircuitos en el sistema nervioso central de manera eficiente.

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Nos gustaría reconocer Sean Whelan para obtener ayuda con el rescate de las variantes recombinantes VSV y Didem Goz y Chrenek Ryan de asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el HHMI (CLC), y # NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Uso de virus para estudiar circuitos neuronales es un método de rendimiento relativamente alto de analizar neuronas conectadas. Sin embargo, generar tanto VSV y viriones RABV no es trivial. Aunque el protocolo enumerados anteriormente para el virus de rescate a partir de ADNc se proporciona, todavía es un evento de baja probabilidad. Los niveles de cada uno de los N, P, L y plásmidos necesitan ser ajustado con precisión, ya que muchos ensayos y replica necesita hacer para asegurar rescate viral. La formación de la partí...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cultivo de tejidos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Células de riñón de hámster fetal (BSRT7)</td><td>disponibles bajo solicitud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vacuna (vTF7-3)</td><td>disponibles bajo solicitud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plásmidos pN, pP, pl</td><td>disponibles bajo solicitud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Células HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 60 mm tratada para cultivo celular (TC)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Matraz rectangular de cuello inclinado de 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; con tapón ventilado</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Medio: DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M, pH 7,4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>SFB: Suero bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Lipofectamina 2,000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa: jeringa Luer-Lock de 5 ml</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Filtros para jeringa</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: PEI lineal de alta potencia</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Centrifugación viral&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema de filtro de vacío con tubo superior de 150 ml de Corning, poro de 0,45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>Tubos ultracentrífugos delgados, ultraclaros, de 38,5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga SW28</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Inyección en ratón&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Micropipetas capilares</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>inyector Ump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Microcontrolador de cuatro canales</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>M.TXB Motor de banco con control de dial C.EMX-1, 115 voltios</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>Mano H.10, cambio rápido</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Broca escalonada, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de micr&amp;#8211;electrodo</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Quetamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de inyección de calibre 30</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica protectora</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Etileno</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Yodo</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Herramientas de cirugía y disección&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de bisturí</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Disección y tinción con anticuerpos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Suero de asno</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Anticuerpos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Anticuerpos</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Montaje de tejidos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Portaobjetos microscópicos Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 22 x 22, grosor 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Elastómero de silicona</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas transparente</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antifade Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

trazado de circuitos viral genéticamente definidos neural

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Los métodos clásicos para el estudio de los circuitos neuronales están rendimiento bastante bajo. Transsynaptic virus, particularmente la pseudorrabia (PRV) y virus de la rabia (RABV), y más recientemente virus de la estomatitis vesicular (VSV), para el estudio de circuitos, es cada vez más popular. Estos métodos de rendimiento más altos utilizan virus que transmiten entre las neuronas, ya sea en la dirección anterógrada o retrógrada. Recientemente, un RABV modificado para monosináptico retrógrada rastreo fue desarrollado. (Figura 1A). En este método, la glicoproteína (G) de genes se elimina del genoma viral, y reabastecidos sólo en las neuronas específicas. Especificidad infección se logra mediante la sustitución de una G quimérico, formado por el dominio extracelular de la glicoproteína ASLV-A y el dominio citoplásmico de la RABV-G (A / RG), para el normal RABV-G 1. Este G quimérica específicamente infecta las células que expresan el receptor TVA 1. El gen que codifica TVA puede sido delivered por diversos métodos 2-8. Tras RABV-G infección de una neurona TVA-expresando, el RABV puede transmitir a otras neuronas, conectadas sinápticamente en una dirección retrógrada por la naturaleza de su propio G que fue cosuministrado con el receptor de TVA. Esta técnica etiqueta un número relativamente grande de entradas (5-10%) 2 en un tipo celular definido, proporcionando un muestreo de todas las entradas en un tipo de célula de arranque definido. Recientemente hemos modificado esta técnica a utilizar VSV como un trazador transsynaptic 9. VSV tiene varias ventajas, incluyendo la rapidez de la expresión génica. A continuación detallamos un nuevo sistema de rastreo viral utilizando útiles para sondear microcircuitos con mayor resolución VSV. Mientras que las estrategias original publicado por Wickersham et al. 4 y Beier et al. 9 permiso de etiquetado de cualquier neuronas que se proyectan hacia inicialmente infectado-TVA-expresando células, aquí VSV fue diseñado para transmitir sólo a TVCélulas que expresan A-(Figura 1B). El virus es primero pseudotyped con RABV-G para permitir la infección de aguas abajo de las neuronas que expresan TVA neuronas. Después de infectar esta primera población de células, el virus liberado sólo pueden infectar células que expresan TVA. Debido a la propagación viral transsynaptic se limita a las células que expresan TVA, la presencia de ausencia de la conectividad de los tipos de células definidos pueden ser explorados con alta resolución. Un diagrama de flujo experimental de estos experimentos se muestra en la Figura 2. Aquí se muestra un circuito de modelo, el de la dirección de selectividad en la retina del ratón. Se examina la conectividad de las células amacrinas starburst (ZEC) a las células ganglionares de la retina (CGR).

Un método de rastreo de neuronas conectadas sinápticamente se describe. Usamos especificidad TVA de una célula de aguas arriba para probar si una población celular de interés recibe la entrada sináptica de tipos de células genéticamente definidos.

Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural

Los métodos clásicos para estudiar los circuitos neuronales tienen un rendimiento bastante bajo. Los virus transsinápticos, particularmente el virus de la pseudorabia (PRV) y el virus de la rabia...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en desarrollar una nueva técnica para analizar la microcircuitría en el sistema nervioso central. Esto se logra primero definiendo una población de neuronas para la infección mediante la expresión del receptor TVA. Como segundo paso, se inyecta el virus transsináptico en el SNC, lo que infecta a las neuronas primarias de interés.A continuación, el virus solo se propagará de forma transsináptica a las neuronas conectadas que expresan el receptor TVA. Con el fin de examinar si estas neuronas están conectadas, se obtienen resultados que demuestran que esta técnica puede utilizarse para analizar la microcircuitría mediante la validación del marcado de microcircuitos conocidos y conectados. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la electrofisiología y la microscopía es que constituye un método de alto rendimiento para analizar la circuitría neuronal.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando leímos el primer estudio sobre el rastreo viral restringido monosinápticamente realizado por Wickersham y colegas. Consideramos que los virus podrían modificarse aún más para estudiar las neuronas conectadas de formas novedosas. Consulte el protocolo escrito para obtener detalles sobre la recuperación del VSV a partir del ADNc utilizando el sistema de Vaccinia T7 para generar células destinadas al pase.Primero, aspirar el medio de cuatro placas de 10 centímetros con células TV800 al 80% de confluencia sembradas el día anterior y reemplazarlo con cinco mililitros de DMEM sin suero. Transfectar cada placa con cinco microgramos del plásmido que codifica la glicoproteína de elección, según procedimientos estándar. Aproximadamente seis horas después de la transfección, reemplazar el medio con DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal y incubar las placas durante la noche en un incubador de cultivo celular ajustado a 34 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, para permitir la expresión y acumulación en la superficie de la glicoproteína.Tras la incubación, aspire el medio y reemplácelo con cinco mililitros de DMEM más 10 % de FBS; luego, infecte cada placa con VSV que contenga la glicoproteína quimérica MA rabies G a una multiplicidad de infección de 0,01 a 0,1 e incube a 34 grados Celsius durante la noche. Veinticuatro horas después, verifique los niveles de infección de cada placa mediante microscopía de fluorescencia. Si más del 50 % de las células estuvieron infectadas, recoja el medio.Sustitúyase con cinco mililitros de medio fresco y luego congele el medio recolectado a menos 80 grados Celsius. Repita el procedimiento de recolección 24 horas después durante tres días, para un total de cuatro días de recolección. Congele cada alícuota del medio recolectado después de que la alícuota final se haya congelado completamente a menos 80 grados Celsius, aunque todos los medios recolectados estén a 37 grados Celsius en este momento; debe haber 80 mililitros de medio recolectado, pasando el medio recolectado a través de filtros de 0,45 micrones sobre hielo.Luego, alícuote 36 mililitros de virus en un tubo de centrífuga Beckman y concentre el sobrenadante mediante ultracentrifugación a 80.000 × g durante 90 minutos a cuatro grados Celsius. Asegúrese de que el rotor esté adecuadamente equilibrado tras la centrifugación para verter en un recipiente que contenga lejía al 10 % y utilice un aspirador para eliminar el líquido del costado del tubo. A continuación, agite los tubos que contienen el virus a 120 rpm durante una hora a cuatro grados Celsius y resuspenda el sedimento viral en el volumen más pequeño posible, que generalmente es de aproximadamente 30 microlitros.Una vez que el virus se resuspende, se determina la concentración viral infectando una placa de 24 pocillos de células 293T con una serie de diluciones diez veces consecutivas de uno a un millón, y se realiza la titulación aproximadamente dos días después de la infección. Según procedimientos estándar, las células infectadas viralmente pueden detectarse mediante fluorescencia. Es importante utilizar la línea celular correcta para estos experimentos.El objetivo consiste en tener el receptor TVA expresado en los tipos celulares en los que se desea realizar el mapeo. Esto puede lograrse mediante la expresión del receptor TVA por medios virales o a través de un alelo transgénico. Este experimento utiliza ratones transgénicos triples de seis a diez semanas de edad.Los ratones que expresan un alelo TVA condicional se cruzaron con ratones que expresan un alelo chat, Cree. Luego, estos ratones se cruzaron con una línea que expresa un alelo fluorescente TD tomate. El ratón transgénico final expresa TVA y un alelo TD tomate condicional en todas las células que expresan Cree, incluyendo las células omicrón estrelladas de interés.Y esta expresión se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia. Verifique las coordenadas estereotáxicas para la región de interés en un atlas del cerebro de ratón y prepare el aparato estereotáxico encendiendo el controlador del microinyector y colocando el émbolo y el porta-electrodos en su lugar. Luego, rellene la aguja con aceite mineral para proporcionar una interfaz con el virus y coloque la aguja sobre el émbolo, asegurándose de que no haya burbujas de aire en la aguja.Extraiga el virus y colóquelo en hielo. Configure el microinyector para retirar y mueva el tubo del virus debajo de la micropipeta en el microinyector. Baje la punta de la micropipeta dentro del virus y retire la cantidad necesaria de virus para el experimento.Después de administrar una dosis preoperatoria de buprenorfina, el animal se anestesia adecuadamente según las directrices institucionales. Realice una compresión en el dedo del pie y asegúrese de que la respuesta refleja esté ausente. Antes de comenzar el procedimiento.Coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla calefactora colocada en un soporte móvil para posicionar al animal. Aplique una pomada ocular para prevenir el secado de la córnea mientras el animal esté anestesiado. A continuación, coloque el ratón en el aparato estereotáxico insertando suavemente las barras para las orejas en el conducto auditivo.Asegúrese de que la cabeza esté paralela a la base del estereotáctico y no se mueva lateralmente. A continuación, ajuste la barra de mordida para ayudar a estabilizar la cabeza. Retire el pelo en el área de la incisión.Luego, lave esta área tres veces con etanol, seguido de tres veces con yodo. Después de realizar una incisión sagital en la piel con un par de tijeras para exponer el cráneo, retire la piel hacia atrás con ganchos quirúrgicos caseros. A continuación, aspire la microcapilar con bgma y use los mandos para mover el microinyector hasta las coordenadas del núcleo geniculado lateral.Una vez localizado el NGL, practique un pequeño orificio en el cráneo sobre el sitio de inyección. Coloque la capilar sobre el orificio y bájela lentamente hasta una posición justo dorsal a la superficie del cerebro. Esta es la posición cero de la coordenada dorsal-ventral.La microcapilar debe ser lo suficientemente afilada como para perforar la duramadre del ratón. Bájela lentamente hasta una profundidad de 2,75 milímetros e inyecte la cantidad necesaria de virus a una velocidad de aproximadamente 100 litros por minuto. Deje la aguja en el cerebro durante unos siete minutos para permitir la difusión del virus desde el sitio de inyección y evitar que el virus ascienda por la aguja.Traccionar lentamente durante un período de dos minutos, retirar la aguja del sitio de inyección y fuera del cerebro. Finalmente, suturar el sitio quirúrgico y monitorear a los animales hasta que se hayan recuperado de la anestesia. Administrar buprenorfina cada 12 horas durante dos días.Generalmente, la propagación transsináptica del VSV se puede observar alrededor de las 24 horas posteriores a la inyección. Sin embargo, tiempos de espera más largos darán como resultado una mayor diseminación. Tras la eutanasia del ratón mediante inhalación de dióxido de carbono, extraiga el ojo y sumérjalo en formaldehído al 4 % durante una hora, asegurándose de que el ojo permanezca completamente sumergido.Luego, transfiera el ojo a una placa de Petri que contenga PBS. Utilice un par de pinzas número 55 para retirar rápidamente la córnea y aflojar y diseccionar la retina del resto de los tejidos. El análisis de preparación en montaje completo.Corte la retina sobre un portaobjetos para que quede plana. Coloque espaciadores de silicona alrededor de los bordes del portaobjetos, utilice un medio de montaje de oro prolongado y luego cúbralo con un cubreobjetos de vidrio de espesor cero para el análisis de las secciones de retina. Coloque la retina en una solución de 30% de sacarosa en PBS hasta que la retina se sumerja.Luego, coloque la retina en una mezcla que consiste en una proporción uno a uno de OCT y solución de sacarosa al 30 % durante tres horas. Finalmente, congele rápidamente la retina y almacénela a menos 80 grados Celsius hasta que esté lista para seccionarla. Esta imagen muestra un experimento de curso temporal que demuestra la infectividad de las células TVA 800 y las células 2 9 3 T por vsv A/rG.Los paneles superiores muestran células TVA 800 a las seis horas, un día y dos días posteriores a la infección. Los paneles inferiores muestran células 2 9 3 T en los mismos puntos de tiempo. El virus se disemina entre células que expresan TVA en cuestión de horas, mientras que la diseminación en células 2 9 3 T, que no expresan el receptor TVA, aunque ocurre, sucede mucho más lentamente.La barra de escala representa 100 micrones. Esta imagen muestra una infección representativa de células ganglionares de la retina de ratones que no expresan TVA. Los animales fueron inyectados en el LGN con el virus vsv A / RG.Simulado con R-A-B-V-G y el tejido se recolectó dos días después de la inyección. Aquí se observa una infección escasa, con las células ganglionares de la retina indicadas por la punta de flecha amarilla. Esta imagen muestra una infección más densa.Esto puede lograrse con un mayor índice de transducción del virus y una inyección de buena calidad, como se observa aquí. Diferentes tipos de células ganglionares de la retina pueden identificarse según su morfología, incluyendo células ganglionares de arborización pequeña, células ganglionares melanopsinas tipo uno, células ganglionares selectivas de dirección o DS GCs, y células DS GCs on-off. Aquí, la barra de escala representa 50 micrómetros, como se ve en las siguientes imágenes de un ratón que expresa TVA.La transmisión de VSVA a través de RG desde las GCs DS on-off a las células estrelladas sigue el patrón esperado. Las GCs DS on-off indicadas con la punta de flecha blanca, con relleno verde, transmiten el virus a múltiples células estrelladas indicadas por la punta de flecha amarilla. Como se observa aquí, todas las células verdes que no son GCs DS presentan etiquetado doble con el reportero Cree, lo que indica que son células estrelladas que expresan TVA.Los GCs DS indicados por cabezas de flecha blancas con relleno verde y los ómicas de estallido estelar indicados por cabezas de flecha amarillas estratifican las capas adecuadas de la capa plexiforme interna de la retina o IPL; las células a las que transmite el virus incluyen tanto las on como las off. Ómica de estallido estelar. Los números en esta figura indican las capas del IPL. Una vez dominado, todo el experimento puede realizarse en uno o dos días si se lleva a cabo correctamente.La velocidad del VSV es una de sus principales ventajas tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el rojo del canal o el mapeo de circuitos basado en opsina, para validar el rastreo de circuitos virales y analizar las propiedades de estas conexiones sinápticas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la mayoría de los diferentes pasos involucrados en el rastreo de circuitos virales, desde el cultivo del virus hasta la inyección in vivo y el análisis de neuronas marcadas con fluorescencia.

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Neurociencia

Ofrecemos una guía práctica para la entrega de los...

Revelando la topografía del circuito neuronal en el Multi-Color

El rastreo transsináptico se ha convertido en una poderosa herramienta para analizar las eferentes centrales que regulan objetivos periféricos a través de circuitos multisinápticos. Aquí presentamos un protocolo que explota el virus transsináptico de la pseudorrabia para identificar y localizar un circuito cerebral funcional, seguido de técnicas clásicas de rastreo de tracto para validar conexiones específicas en el circuito entre grupos de neuronas identificados.

Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado

Aprovechando una estrategia genética binaria, proporcionamos un protocolo detallado para el rastreo de circuitos neuronales en ratones que expresan trazadores transsinápticos complementarios después de la recombinación mediada por Cre. Debido a que la producción de trazadores específicos de células está codificada genéticamente, nuestro enfoque experimental es adecuado para estudiar la formación y maduración de circuitos neuronales durante el desarrollo del cerebro embrionario murino a una...

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Aquí describimos un procedimiento basado en el uso de partículas lentivirales para la modificación genética a largo plazo de células madre neurales y/o sus células ependimarias adyacentes en el nicho neurogénico ventricular-subventricular adulto que permite el análisis por separado de los efectos autónomos y no autónomos, dependientes del nicho, sobre las células madre neurales.

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

Describimos una técnica para etiquetar las neuronas y sus procesos a través de anterógrada o retrógrada trazadores inyecciones en núcleos cerebrales utilizando una preparación in vitro. Hemos modificado un método existente de i n vitro electroporación trazador mediante el aprovechamiento de la etiqueta fluorescente mutantes de ratón y equipo óptico básica con el fin de aumentar la precisión de etiquetado.

Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.

Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

Basado en la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales, su co-trasplante en cerebros de tipo salvaje y evaluación morfométrica emparejada de derivados de "prueba" y "control", este método permite el modelado preciso del control genético in vivo del neocortical morfología de las neuronas de una manera simple y asequible.

Trasplante Intraventricular de Precursores Neuronales Deingidos para Estudios de Neuroarquitectura In Vivo

Este protocolo tiene como objetivo generar interneuronas directamente reprogramadas in vivo, utilizando un sistema viral basado en AAV en el cerebro y un reportero de FPSG impulsado por la sinapsina FLEX, que permite la identificación celular y el análisis posterior in vivo.

En Vivo Reprogramación Directa de Células Gliales Residentes en Interneuronas por Inyección Intracerebral de Vectores Virales

El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.

Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a trazar circuitos neuronales mediante un virus trans-sináptico que utiliza la especificidad del receptor TVA. Este método de alto rendimiento permite analizar microcircuitos en el sistema nervioso central de manera eficiente.

Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural

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