El uso de LysoTracker para detectar la muerte celular programada en embriones y la diferenciación de células madre embrionarias

El objetivo del siguiente procedimiento es demostrar cómo sostener los lisosomas de dos tipos de muestras, embriones de ratón y células madre diferenciadas con colorante lyo tracker para detectar patrones de muerte celular. Para preparar muestras de embriones, primero se aíslan quirúrgicamente los embriones y se colocan en una placa para preparar células diferenciadas. Las células madre embrionarias se utilizan para crear cuerpos embrionarios.

Estos cuerpos embrionarios se cultivan en suspensión y luego se cultivan como una monocapa en un portaobjetos de cámara. Los embriones que se venden en monocapa se pueden incubar en un tubo rojo y luego se enjuagan y fijan las muestras, luego se pueden fotografiar para examinar y cuantificar los resultados de tinción que se obtienen con Liso Tracker. La tinción es un procedimiento sencillo que puede utilizarse para determinar la muerte celular programada en embriones y células cultivadas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de túnel, es que, debido a que el colorante rastreador OT es una molécula pequeña, el tejido grueso se puede analizar rápida y fácilmente. Aunque este método puede proporcionar información sobre los patrones de muerte celular programada en embriones de ratón y cultivos diferenciados, también se puede aplicar a otros tipos de tejidos, como embriones de pollo y células madre adultas en diferenciación. Empareje ratones hembra jóvenes con un macho semental y, en las mañanas siguientes, verifique si hay un tapón vaginal, lo que indica que se ha producido el apareamiento.

El mediodía del día en que aparece el tapón vaginal es efectivamente 0,5 días. Después del coto en el día embrionario de interés, eutanasia a la hembra de acuerdo con los protocolos aprobados y retire el útero a una placa de Petri de 10 centímetros con BSS de Hank y enjuague la sangre. Separa los embriones y retíralos del útero.

Retire las membranas embrionarias adicionales y haga al menos un enjuague con el BSS de Hank para eliminar los tejidos extraños y la sangre. Mantenga los embriones disecados en hielo mientras los limpia. Los otros.

Prepare cinco mililitros de solución de tinción de embriones Liso tracker. Se trata de un volumen suficiente para una o dos colecciones de embriones. Mezcle suavemente la solución para dispersar el tinte, luego transfiera los embriones a la solución e incube a 37 grados centígrados durante 45 minutos.

Después de la incubación, enjuague suavemente los embriones en el BSS de Hank cuatro veces durante cinco minutos en cada lavado. Es importante hacer los enjuagues suavemente para no dañar el tejido. Retira el líquido, prestando mucha atención lentamente a dónde están los delicados embriones, y dejando siempre una porción del líquido cubriéndolos.

A continuación, fije los embriones en formaldehído al 4% durante la noche del día siguiente. Enjuague los embriones una vez en el BSS de Hank durante 10 minutos para eliminar el fijador. Ahora deshidrata los tejidos a través de una serie de metanol para eliminar las manchas de fondo.

Este paso mejora la relación señal/ruido durante la obtención de imágenes antes del almacenamiento. Si es necesario, recoja una muestra de tejido de cada embrión para su análisis genético. Posteriormente, rehidratar la muestra de tejido antes del genotipado.

Separe los embriones en tubos individuales con etiquetas que coincidan con la muestra de tejido. Ahora es posible almacenar los embriones aislados indefinidamente en metanol a menos 20 grados centígrados. Protegido de la luz.

Comience preparando los cuerpos de los embriones a través del método de la gota colgante. Con una densidad inicial de 500 células por gota de 20 microlitros después de tres días, transfiera los cuerpos embrionarios a cultivos en suspensión en placas de Petri no adherentes de 10 centímetros. Cultivarlos durante cinco días, cambiando los medios cada dos días después de cinco días.

Transfiera los cuerpos embrionarios a portaobjetos gelatinizados de ocho cámaras, colocando uno o dos cuerpos embrionarios en cada cámara. Cultive los cuerpos embrionarios durante otros 10 días. Cambiando el medio cada dos días después de 10 días, aspire suavemente el medio existente y agregue 300 microlitros de solución de tinción celular Lyo tracker a cada cámara.

Tenga cuidado de pipetear manualmente el medio colocando la punta de la pipeta en la esquina de la cámara. De esta manera, no quitará accidentalmente el, aún uniendo cada cuerpo de la superficie del vidrio. Cuando vuelva a añadir el medio, coloque la punta de la pipeta en la esquina de la cámara y vuelva a añadir el medio muy lentamente.

Incubar las cámaras a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Luego enjuáguelos dos veces con DPBS durante cinco minutos por enjuague. Ahora fije las células en paraldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, retire el fijador con DPBS en dos enjuagues de cinco minutos. Para montar los embriones, colóquelos en un portaobjetos de vidrio de depresión profunda o en un pequeño escudo infeccioso de placa de Petri. Prepare las muestras de células para la microscopía aspirando el DPBS.

Retire la cámara del portaobjetos y deje que se seque al aire durante unos cinco minutos. Cubra con papel de aluminio para proteger el fluro. A continuación, añada un medio de montaje acuoso, como un escudo vectorial, con dappy y coloque un cubreobjetos en la parte superior.

Ahora el portaobjetos ha sido montado y está listo para la toma de imágenes. Visualice las muestras con un microscopio de disección o compuesto equipado con un filtro de varilla, dominé o rojo de Texas. La tinción suele ser bastante brillante, por lo que las exposiciones prolongadas no suelen ser necesarias en el modo manual.

Tome fotos digitales de todas las muestras en las mismas condiciones de exposición. Para cuantificar las imágenes, ábralas en Adobe Photoshop o en un programa de imágenes similar. Para determinar la cantidad de tinción de lyo tracker, seleccione el canal rojo.

Observe el recuento de píxeles de toda la imagen según lo revelado por la función de histograma. Siguiente umbral, la imagen de tal manera que la mancha roja ahora está representada por píxeles blancos. Esto convierte la imagen a blanco y negro.

Elija un nivel de umbral y utilícelo para todas las imágenes del conjunto. Seleccione los píxeles blancos con la herramienta de gama de colores y utilice la función de histograma para obtener el recuento total de píxeles blancos. Utilice el canal azul para contar el número de núcleos en el campo.

Puede ser útil mantener un registro del recuento anotando la imagen, registrar los valores y utilizarlos para calcular el nivel medio de tinción por célula. Repita este análisis con el mismo ajuste de umbral para todas las imágenes restantes. Para tomar muestras se utilizó un rastreador para teñir embriones mutantes de erizo sónico.

Dado que el rastreador de O es una molécula pequeña y altamente difusible, las áreas profundas dentro de la méen de un embrión completo se tiñen a los 10,5 días después del cotus, la muerte celular programada o PCG aumentó considerablemente en los embriones mutantes nulos de erizo sónico, particularmente en las regiones de las extremidades y otras personas. Las yemas de las extremidades se fotografiaron en montajes de agujeros con mayor aumento para evaluar el patrón general. Las partes disecadas también se seccionaron con un microtono vibrante.

La punta de flecha apunta a un aumento de la tinción en la punta distal nula del erizo sónico en secciones obtenidas con un criostato La tinción en túnel se utilizó junto con OT Tracker en estos cortes, aunque no existe una correlación estricta uno a uno entre el lyo tracker y la tinción en túnel, las regiones generales de PCD se superponen considerablemente con un aumento mayor. Es posible ver una punción que se tiñe positivamente con el ensayo de túnel, pero no la punción de otro troquel que se tiñe solo con el troquel de lira y la punción que tiene tinción superpuesta. Después de 10 días de cultivo del cuerpo embrionario, las células se diferenciaron en una variedad de tipos de células, incluidas neuronas, células musculares y cardiomiocitos.

En el cultivo normal de células madre embrionarias diferenciadas, hay unas pocas células que se sometieron a PCD según se detectó con ensayos de seguimiento y túnel. A continuación, las células fueron tratadas con peróxido de hidrógeno para inducir la muerte celular por estrés oxidativo. Una dosis baja de peróxido de hidrógeno aumentó tanto el lyo tracker como la tinción de túnel en comparación con ningún tratamiento.

De manera similar a los resultados en el embrión, ambas tinciones marcaron células comunes y únicas. Una dosis alta de peróxido de hidrógeno dio lugar a una contracción celular y a una mayor difusión del seguimiento de OT y la positividad del túnel. A modo de comparación, se utilizó la inanición sérica para inducir la autofagia después de una hora de inanición sérica.

Aumenta la tinción del rastreador de OT. Sin embargo, la positividad del túnel se mantuvo en niveles normales. Por lo tanto, si bien la reer es fácil y útil, es importante hacer un seguimiento con ensayos adicionales para determinar si la tinción representa apoptosis o autofagia después de cuantificar las muestras.

Utilizando el método simple de Photoshop demostrado anteriormente, los resultados confirmaron que el aumento de las concentraciones de peróxido de hidrógeno resultó en un mayor nivel de tinción de lisa una vez dominado, este procedimiento de tinción se puede realizar en menos de dos horas si se realiza correctamente después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como la tinción inmunológica NX in five o lc three para confirmar el tipo de muerte celular. No olvides que actualmente Trecker green solo funciona en células vivas, por lo que Reca red es tu mejor opción para muestras que requieren fijación.