Name: Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende a estudiar infecciones recurrentes por virus herpes simple en ratones mediante reactivación con luz UVB. Este modelo de queratitis estromal herpética permite evaluar la progresión de la enfermedad corneal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer al Dr. Jay Pepose para ayudar a enseñar el modelo para nosotros. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) y una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera en el Departamento de Oftalmología.

Nota Animal Care: Analgésicos no se utilizan en este modelo ya que son anti-inflamatoria y por lo tanto invalidaría el modelo. 1. Preparación de Virus <ol><li> Grow HSV-1 en células Vero (80% confluentes) utilizando una dilución inicial de 0,01 multiplicidad de infección (en matraz T-150, a unos 5 x 10 5 unidades formadoras de placa) durante 3-4 días hasta que todas las células han redondea y son desalojados fácilmente pulsando el matraz. </li><li> Retire el medio a tubos de centrífuga estériles y se centrifuga en Sorvall Legend RT a 4 ° C y 3.500 rpm durante 15 min. Después de eliminar el sobrenadante (ver 1,3), se resuspende el pellet grande de cada tubo de 50 ml con 5 ml del total de los medios de comunicación. Someter a ultrasonidos durante 1 min en dos ráfagas de 30 seg. </li><li> Remover el sobrenadante y poner en 50 ml tubos estériles de Oak Ridge, y centrifugar a 9.000 rpm, durante 1 hora a 4 ° C en un Beckman J2-21 centrífuga. Esto es para producir un pequeño sedimento viral. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Combine ultrasonidos de 1,2 ingenioh pellet de 1,3 y sonicar de nuevo durante 45 segundos. Centrífuga Sorvall Legend en RT a 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Guardar el sobrenadante. Esto constituye la reserva de virus que se divide en alícuotas y se almacenó a -70 ° C. </li><li> Título de virus en células Vero. Por lo general la placa de 10 0 a 10 -8 dilución (cada una siendo una dilución de 10-veces) 2x de 2 conjuntos de dilución separados. La titulación de virus se realiza en placas de 12 pocillos estériles. </li></ol> 2. Infección del ratón <ol><li> Inyectar cada ratón con 0,1 ml de anestésico cocktail/20 g de peso corporal del ratón (ketamina, 60 mg / kg + xilazina 5 mg / kg que se diluyó en HBSS). Este cóctel se utiliza porque es uno de los medios más seguros de la anestesia cuando se utilizan dosis adecuadas y los efectos de esta droga son de muy corta duración. </li><li> Cuando los ratones se anestesian rayar la córnea del ojo derecho con una aguja de calibre 30 utilizando un microscopio de disección para asegurarse de que la córnea no es perforada. </li><li> Cada rece ratónIVED una inyección intraperitoneal de 1 ml de suero humano agrupado (Sigma, Temecula, CA; anti-HSV reactividad con una dosis eficaz para el 50% de neutralización viral de 1:800) con el fin de proteger a las córneas de los daños durante la infección primaria. </li><li> Número de los ratones con clips para las orejas, ya sea por el oído o punzón. </li><li> Después de que todos los ratones se han numerado; utilizando una pipeta 20 l, se infectan cada ojo con 10 6 PFU (5 l). Nos infectar un solo ojo y típicamente el ojo derecho. También ponemos 5 l de HBSS para el otro ojo para mantenerla húmeda mientras están anestesiados. 5 ul es suficiente para mantener la hidratación de los ojos, ya que los procedimientos se realizan en menos de 10 min, y los animales son dosificados con anestésico en consecuencia. La infección se confirmó en muestras de secreciones ratones 3 días después de la infección con un aplicador de algodón estéril que fue hidratado en 1 ml de medio de Vero. Entonces, 100 l se añade a las células Vero cultivadas en placas de 48 pocillos. Estas placas están monitoreando diariamente por efectos citopáticos<html> (CPE). </li></ol> 3. Reactivación de ratones de la latencia <ol><li> Los ratones son anestesiados por lo menos 5 semanas después de la infección primaria. Cabe señalar que hemos reactivado ratones hasta un año después de la infección primaria y no han observado diferencias significativas en la respuesta. </li><li> Una vez anestesiados se colocan TM20 cromato-Vu transiluminador, que emite radiación UV-B en una longitud de onda máxima de 302 nm tal que solamente un solo ojo se expone a la luz UV-B. Cada ratón se expone a la luz mJ 250 cm de UV-B 2. </li><li> La reactivación se determinaron en muestras de secreciones ojos con aplicador de algodón estéril que se coloca primero en 1 ml de medio de Vero en el día 0 (antes de la exposición UV-B en el control de excretores espontáneas) y después en los días 1 a 7 después de la irradiación UV-B. El material de frotis se evaluaron como se describe en 2,5). Para aquellos que tienen hisopos virus infeccioso de la cantidad de virus se tituló por un ensayo de placa estándar usando placas de 12 pocillos. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. Evaluación Clínica <ol><li> Los ratones se evalúan para la enfermedad de ojo clínico de un observador enmascarado utilizando un microscopio binocular de disección. </li><li> La opacidad corneal se califica en una escala de 0 a 4, donde 0 indica estroma claro, 1 indica opacificación estromal leve, 2 indica opacidad moderada con discernibles características del iris, 3 indica opacidad densa con pérdida de detalle definido iris excepto los márgenes de la pupila, y 4 indica opacidad total sin vista posterior. </li><li> La neovascularización se califica en una escala de 1 a 8 dividiendo la córnea en 4 cuadrantes iguales y determinar el grado de vascularización en cada uno de estos cuadrantes. </li><li> La blefaritis se mide de la siguiente manera: 0, sin lesiones: 1, hinchazón de párpados mínimo, 2, descarga ocular moderada hinchazón y costras, 3, inflamación severa, moderada pérdida de pelo periocular, y lesiones en la piel, y 4, inflamación grave con ojos cerrados con costra, pérdida severa del pelo periocular y lesiones cutáneas. </li><li> Evidencia de la encefalitis inclusiónded espalda encorvada, de pelo rizado, y evidentes anomalías neurológicas. Los ratones son sacrificados cuando muestran importantes signos de encefalitis. </li></ol> 5. Los resultados representativos El modelo recurrente que se ha descrito anteriormente se publicó por primera Shimeld, et al. 1-3. Probaron y nuestro laboratorio ha estado usando una versión modificada de este modelo a publicar muchos manuscritos durante los 4-15 años. El modelo se utilizó para definir el papel que la citocina interferón γ-juega en recurrente por VHS-1 enfermedad 10. Como se muestra en la Figura 3, los ratones que carecen de IFN muestra peor enfermedad corneal que hizo ratones de tipo salvaje 14. También fue utilizado con éxito para definir el valor terapéutico de la vacuna varias distintas construcciones 6,10,11. Tenga en cuenta que en un caso prueba la vacuna funcionó bien profilácticamente pero no demostrar ser terapéuticamente eficaz 6. Sin embargo,cuando una vacuna incompetente para la replicación viral fue probado, no fue sólo profilácticamente eficaz, pero también fue muy eficaz terapéuticamente 10,11, véase la Figura 5 en la referencia 10. Más recientemente, hemos utilizado este modelo para determinar si las diferencias de género fueron detectables en ratones sometidos a HSK recurrente. Como muestra la Figura 1 muestra, los ratones machos C57BL / 6 muestran significativamente menos opacidad corneal que hacer C57BL hembra / 6 ratones. Del mismo modo, cuando la neovascularización corneal se evaluó, los ratones machos demostrado el crecimiento de vasos significativamente menos nuevo en la córnea que los ratones hembra (Figura 2). Actualmente estamos estudiando si este fenotipo es cepa específica mediante la realización de análisis similares en otras cepas de ratones. También determinará si la diferencia se debe a la falta de testosterona o la presencia de estrógenos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig1.jpg" /> Figura 1. Enfermedad corneal en C57BL macho y hembra / 6 cepas de ratón después de UV-B reactivación inducida. Ratones con infección latente se indujeron para reactivar con irradiación UV-B y los ratones se monitorizaron para la opacidad de la córnea durante 35 días. El número de ratones utilizados en estos estudios fueron los siguientes: machos, n = 15; hembras, n = 15. Los resultados indican media ± SEM. * No fue significativamente mayor inducida por el virus de la enfermedad en ratones hembra C57BL / 6 de 14 a 35 días (P = 0,001 a 0,01). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig2.jpg" /> Figura 2. Enfermedad corneal en C57BL macho y hembra / 6 cepas de ratón después de UV-B reactivación inducida. Ratones con infección latente se indujeron para reactivar con irradiación UV-B y los ratones se monitorizaron para la neovascularización corneal durante 35 días. El número de ratones utilizados en estos estudios fueron los siguientes: machos, n= 15; hembras, n = 15. Los resultados indican media ± SEM. * No fue significativamente mayor inducida por el virus de la enfermedad en ratones hembra C57BL / 6 de 14 a 28 días (P = 0,001 a 0,01).

<ol><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+model+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+latent+infection+and+induction+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+protects+the+mouse+eye+from+damage+after+herpes+simplex+virus+infection+by+limiting+spread+of+virus+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system.</a> J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).</li>
<li>Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+model+of+recurrent+herpes+simplex+viral+keratitis+induced+by+ultraviolet+B+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).</li>
<li>Keadle, T. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+ameliorates+corneal+disease+in+a+mouse+model+of+recurrent+herpetic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis.</a> Microbial Path. 38, 13-21 (2005).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+recombinant+glycoprotein+D+subunit+vaccine+on+the+development+of+primary+and+recurrent+ocular+infection+with+herpes+simplex+virus+type+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inf.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice.</a> J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+IL-1+and+TNF-a+are+required+for+recurrent+herpetic+keratitis+in+NIH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).</li>
<li>Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+cytokine+expression+in+a+murine+model+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunol.+Inflam%22%5BJournal%5D)">Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+and+CD8%2B+cells+are+key+participants+in+the+development+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> Microbial Path. 32, 255-262 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+immunization+with+a+virion+host+shutoff-defective%2C+replication-incompetent+herpes+simplex+virus+type+1+strain+limits+recurrent+herpetic+ocular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection.</a> J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+vaccination+with+vhs%28-%29+herpes+simplex+virus+reduces+the+severity+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+aminoguanidine+on+primary+and+recurrent+ocular+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection.</a> Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).</li>
<li>Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL3+protects+mice+from+corneal+pathology+during+recurrent+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection.</a> Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).</li>
<li>Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+gamma+is+not+required+for+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Virology. 380, 46-51 (2008).</li>
<li>Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Interferon-gamma+by+an+adenovirus+vector+blocks+herpes+simplex+virus+Type+1+reactivation+in+vitro+and+in+vivo+independent+of+RNase+L+and+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways.</a> J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El modelo recurrente de la queratitis estromal herpética (HSK) aquí descrito permite al investigador para estudiar HSK humano en un modelo que sea más coherente con la que se observa durante la enfermedad humana. Por lo tanto, los puntos fuertes del modelo son que la enfermedad se produce en el contexto de un sistema inmune que ya tiene por estimulada durante la enfermedad primaria. Dado que estos ratones tienen ya una respuesta inmune a HSV-1, los factores que reactivan que la respuesta inmune son probablemente diferen...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Suero humano</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-C1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman</td><td>52-21</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador</td><td>UVP</td><td>95-0452-02</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Oak Ridge</td><td>Nalgene</td><td>Z 720410</td><td></td></tr><tr><td>Matraces- 7150</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>Placas- 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>CLS 3513</td><td></td></tr><tr><td>Placas- 48 pocillos</td><td>Corning</td><td>CLS 3548</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estériles- 30 ml</td><td>Corning</td><td>CLS 430828</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores estériles con punta de algodón</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 30G</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 25G</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr></tbody></table>

queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio hsk humanos

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Enfermedad herpética ocular, denominada queratitis herpética estromal (HSK), es una infección potencialmente cegamiento de la córnea que causa más de 300.000 visitas clínicas cada año para su tratamiento. Entre 1 y 2 por ciento de los pacientes con enfermedad clínica experimentará la pérdida de la visión de la córnea infectada. La gran mayoría de estos casos son el resultado de la reactivación de una infección latente por el herpes simplex virus tipo I y no debido a la enfermedad aguda. Curiosamente, la infección aguda es el modelo más utilizado para estudiar esta enfermedad. Sin embargo, se consideró que un modelo recurrente de HSK sería más un reflejo de lo que ocurre durante la enfermedad clínica. Los modelos animales recurrentes para HSK han empleado tanto en conejos y ratones. La ventaja de los conejos es que experimentan reactivación de la latencia en ausencia de cualquier estímulo conocido. Dicho esto, es difícil de explorar el papel que juegan muchos factores inmunológicos en HSK recurrente debido a que el modelo de conejo no tiene la inmunidadrecursos metodológicos y genéticos que tiene el mouse. Hemos elegido utilizar el modelo de ratón para el HSK recurrente, ya que tiene la ventaja de que hay muchos recursos disponibles y también sabemos que cuando la reactivación se produce debido a la reactivación es inducida por la exposición a la luz UV-B. Hasta el momento, este modelo ha permitido a los laboratorios de usarlo para definir varios factores inmunológicos que son importantes para esta enfermedad. También ha permitido poner a prueba tanto terapéutico y eficacia de la vacuna.

La mayoría de los estudios de la enfermedad corneal herpética utilizar un modelo de infección primaria. Sin embargo, la infección primaria con el virus HSV-1 no suele conducir a la enfermedad humana. Aquí se describe un modelo de la enfermedad herpética recurrente corneal, que más estrechamente imita la enfermedad humana.

Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

La enfermedad herpética ocular, denominada queratitis estromal herpética (QEH), es una infección de la córnea potencialmente cegadora que provoca más de 300 000 casos clínicos...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la infección recurrente por el virus del herpes simple o HSV. Esto se logra primero infectando ratones de tal manera que queden infectados de forma latente sin daño corneal. Una vez que se ha establecido completamente la latencia, el siguiente paso consiste en reactivar el virus mediante la exposición a luz UVB; en la etapa final, se recoge el filme lagrimal para la detección de la excreción viral y luego se observa al ratón durante al menos cinco semanas para monitorear la enfermedad.En última instancia, la gravedad de la enfermedad que se desarrolla en los ratones puede evaluarse mediante la puntuación de la queratitis estromal herpética. Esta enfermedad afecta a muchas personas en todo el mundo. Esta enfermedad en particular es una de las principales causas de ceguera infecciosa.Tenemos un modelo que utilizamos en ratones para imitar esta enfermedad en particular. Existen otros modelos que en realidad pueden simular esta enfermedad, pero consideramos que este es la mejor representación de dicha enfermedad. Me gustaría dedicar unos minutos hoy para presentar a las personas que verá en este video.Esta es Chloe, quien ha estado trabajando conmigo durante los últimos meses. Este es Nippo, un estudiante de verano que trabaja en el laboratorio. Comience el experimento cultivando HSV tipo uno en células Vero durante tres a cuatro días hasta alcanzar una confluencia del 80 % en un matraz T150.Para este momento, las células habrán adquirido una forma redondeada y se desprenderán fácilmente al golpear el frasco. Transfiera la suspensión celular a tubos cónicos estériles de 50 mililitros y luego centrifugue las células durante 15 minutos. Añada 1, 510 veces G a cuatro grados Celsius en una centrífuga de mesa.A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos estériles de Oak Ridge de 50 mililitros y luego divida cinco mililitros de medio en total entre cada uno de los tubos cónicos para resuspender. Suspender los pellet grandes, luego sonicar los pellet resuspendidos durante un minuto en dos pulsos de un treintaidosavo. Después de centrifugar el sobrenadante en una centrífuga de alta velocidad de piso, se obtiene un pequeño pellet vírico.Después de desechar el sobrenadante, combine los sobrenadantes con los pequeños pellets virales y someta nuevamente a sonicación durante 45 segundos. A continuación, centrifugue la solución de células y virus sometida a sonicación en una centrífuga de sobremesa durante cinco minutos a 280 × g y 4 °C, y luego alícuote el sobrenadante para su almacenamiento como stock viral a -70 °C hasta la titulación en placa.Diluciones de diez veces del virus a partir del sobrenadante del stock vírico, desde 10 a la cero hasta 10 a la menos ocho, dos veces a partir de dos juegos separados de diluciones, en células Vero en placas estériles de 12 pocillos. Comience el procedimiento de infección anestesiando el ratón. El ratón debe permanecer completamente anestesiado durante 20 a 30 minutos para permitir que el virus sea absorbido antes de que el ratón despierte.A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, utilice una aguja de calibre 30 para rayar la córnea del ojo derecho. Ahora numere el animal mediante perforación en la oreja. A continuación, inyecte al ratón un mililitro de suero humano agrupado con el fin de proteger las córneas de daños durante la infección primaria.Luego, utilice un pipeteador de 20 microlitros para infectar el ojo rayado con 10 a la sexta unidades formadoras de placas y coloque cinco microlitros de HBSS en el otro ojo para mantenerlo húmedo mientras el animal está anestesiado, a fin de confirmar la infección. Hidrate un aplicador de algodón estéril con un mililitro de medio Vero. Tres días posteriores a la infección, hisopé el ojo infectado con el aplicador y luego transfiera 100 microlitros del medio hisopado a células Vero cultivadas en placas de 48 pocillos, al menos cinco semanas después de la infección primaria.Frote el ojo infectado de un ratón anestesiado tal como se acaba de mostrar. Marque el frotis como día cero en la tapa de la placa de 48 pocillos para controlar los parpadeos espontáneos. Luego, coloque el ratón en un transiluminador que pueda emitir UVB con una longitud de onda máxima de 302 nanómetros, de manera que solo un ojo quede expuesto a la luz UVB, y exponga al ratón a 250 milijoules de luz UVB por centímetro cuadrado.Luego, realice un hisopado del ojo diariamente desde el día uno hasta el siete. Después de la irradiación con UVB, para aquellos hisopos que contengan virus infeccioso, cuantifique la cantidad de virus mediante un ensayo estándar de placas utilizando placas de 12 pocillos para evaluar a los ratones por enfermedad ocular clínica. Coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico binocular.La opacidad corneal se califica en una escala de cero a cuatro, donde cero indica estroma claro, uno indica opacificación estromal leve, dos indica opacidad moderada con iris discernible, tres indica opacidad densa con pérdida de los detalles definidos del iris excepto en los márgenes de la pupila, y cuatro indica opacidad total sin visión posterior.La neovascularización se califica en una escala de uno a ocho dividiendo la córnea en cuatro cuadrantes iguales y determinando el grado de vascularización en cada uno de estos cuadrantes. En esta primera figura, se indujo la reactivación con irradiación UVB en ratones infectados de forma latente y luego se monitoreó la opacidad corneal en los ratones durante 35 días. Estos datos demuestran que los ratones macho C 57 black six presentan significativamente menos opacidad corneal que los ratones hembra C 57 black six, ya que hubo una enfermedad inducida por el virus significativamente mayor en los ratones hembra C 57 black six desde el día 14 hasta el día 35.Asimismo, cuando se evaluó la neovascularización corneal bajo las mismas condiciones experimentales, los ratones macho mostraron un crecimiento significativamente menor de nuevos vasos en la córnea en comparación con los ratones hembra, y una vez más, existe una enfermedad inducida por el virus significativamente mayor en los ratones hembra C57BL/6 entre los días 14 y 28. Al intentar este procedimiento, recuerde anestesiar completamente a los ratones para que permanezcan dormidos entre 20 y 30 minutos. Después de ver este video, espero que tenga una comprensión de cómo utilizar el modelo de queratitis estromal recurrente en ratones para estudiar esta enfermedad humana.

recurrent-herpetic-stromal-keratitis-mice-model-for-studying-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este artículo de vídeo se describe el uso de un...

Ex Vivo organotípicos Modelo corneal aguda de herpes simplex virus tipo epitelial que la infección

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón humanizado dual con un sistema inmunológico humano y células hepáticas. Consiste en el trasplante de células hepáticas humanas y células madre y progenitoras hematopoyéticas en un ratón transgénico inmunodeficiente mediante inyección intraesplénica, lo que conduce al injerto de células hepáticas y al desarrollo de células inmunitarias humanas.

Desarrollo de un modelo de ratón humanizado con células hepáticas humanas y células inmunitarias

Hipertensión ocular crónica se induce mediante fotocoagulación con láser de la malla trabecular en los ojos de ratón. La presión intraocular (PIO) es elevada durante varios meses después del tratamiento con láser. La disminución de la agudeza visual y la sensibilidad al contraste de los animales experimentales se vigila por medio de la prueba de optomotor.

Un modelo de ratón inducida por láser de la hipertensión ocular crónica a Caracterizar los defectos visibles

Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

La piel es un tejido objetivo del patógeno humano virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1). Para explorar la ruta de invasión del VHS-1 en el tejido, establecimos un modelo de infección ex vivo de láminas epidérmicas murinas, que representan la capa más externa de la piel.

Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

(Hu-NSG) ratón humanizado del NOD/SCID/IL2rγnull modelo para estudios de latencia y replicación del VIH

Aquí se describen tres enfoques experimentales para estudiar la dinámica de la infección por VIH en ratones humanizados. El primero permite el estudio de eventos de infección crónica, mientras que los dos últimos permiten el estudio de eventos agudos después de una infección primaria o reactivación viral.

Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados

El modelo de inoculación de la almohadilla es una herramienta valiosa para caracterizar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por virus in vivo. En particular, proporciona una evaluación clara de la cinética viral y los procesos inmunopatológicos asociados iniciados en el sistema nervioso periférico.

Modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral

Describimos el uso de una córnea porcina para probar la eficacia antiviral de los fármacos experimentales.

Explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1

La hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental murino de dermatitis alérgica de contacto (ACD). El CHS se basa en la sensibilización con hapteno reactivo mediante la pintura de la piel afeitada del pecho y el abdomen, con un posterior desafío de la piel del oído con un hapteno diluido, causando una reacción de hinchazón que se evalúa de varias maneras.

Hipersensibilidad de contacto como modelo murino de dermatitis alérgica de contacto

Este protocolo explicará cómo establecer un modelo murino de cicatrización hipertrófica que aumente la señalización de mecanotransducción para simular una cicatrización similar a la humana. Este método consiste en aumentar la tensión mecánica a través de una incisión en cicatrización en un ratón y utilizar un dispositivo especializado para crear tejido cicatricial excesivo y reproducible para análisis histológicos y bioinformáticos detallados.

Un modelo de ratón de cicatrices hipertróficas similares a las humanas impulsadas por mecanotransducción

Aprende a estudiar infecciones recurrentes por virus herpes simple en ratones mediante reactivación con luz UVB. Este modelo de queratitis estromal herpética permite evaluar la progresión de la enfermedad corneal.

Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

Explorar más videos