Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos
18 de diciembre de 2012
La mayoría de los estudios de la enfermedad corneal herpética utilizar un modelo de infección primaria. Sin embargo, la infección primaria con el virus HSV-1 no suele conducir a la enfermedad humana. Aquí se describe un modelo de la enfermedad herpética recurrente corneal, que más estrechamente imita la enfermedad humana.
El objetivo general de este procedimiento es estudiar la infección recurrente por el virus del herpes simple o HSV. Esto se logra primero infectando ratones de tal manera que queden infectados de forma latente sin daño corneal. Una vez que se ha establecido completamente la latencia, el siguiente paso consiste en reactivar el virus mediante la exposición a luz UVB; en la etapa final, se recoge el filme lagrimal para la detección de la excreción viral y luego se observa al ratón durante al menos cinco semanas para monitorear la enfermedad.
En última instancia, la gravedad de la enfermedad que se desarrolla en los ratones puede evaluarse mediante la puntuación de la queratitis estromal herpética. Esta enfermedad afecta a muchas personas en todo el mundo. Esta enfermedad en particular es una de las principales causas de ceguera infecciosa.
Tenemos un modelo que utilizamos en ratones para imitar esta enfermedad en particular. Existen otros modelos que en realidad pueden simular esta enfermedad, pero consideramos que este es la mejor representación de dicha enfermedad. Me gustaría dedicar unos minutos hoy para presentar a las personas que verá en este video.
Esta es Chloe, quien ha estado trabajando conmigo durante los últimos meses. Este es Nippo, un estudiante de verano que trabaja en el laboratorio. Comience el experimento cultivando HSV tipo uno en células Vero durante tres a cuatro días hasta alcanzar una confluencia del 80 % en un matraz T150.
Para este momento, las células habrán adquirido una forma redondeada y se desprenderán fácilmente al golpear el frasco. Transfiera la suspensión celular a tubos cónicos estériles de 50 mililitros y luego centrifugue las células durante 15 minutos. Añada 1, 510 veces G a cuatro grados Celsius en una centrífuga de mesa.
A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos estériles de Oak Ridge de 50 mililitros y luego divida cinco mililitros de medio en total entre cada uno de los tubos cónicos para resuspender. Suspender los pellet grandes, luego sonicar los pellet resuspendidos durante un minuto en dos pulsos de un treintaidosavo. Después de centrifugar el sobrenadante en una centrífuga de alta velocidad de piso, se obtiene un pequeño pellet vírico.
Después de desechar el sobrenadante, combine los sobrenadantes con los pequeños pellets virales y someta nuevamente a sonicación durante 45 segundos. A continuación, centrifugue la solución de células y virus sometida a sonicación en una centrífuga de sobremesa durante cinco minutos a 280 × g y 4 °C, y luego alícuote el sobrenadante para su almacenamiento como stock viral a -70 °C hasta la titulación en placa.
Diluciones de diez veces del virus a partir del sobrenadante del stock vírico, desde 10 a la cero hasta 10 a la menos ocho, dos veces a partir de dos juegos separados de diluciones, en células Vero en placas estériles de 12 pocillos. Comience el procedimiento de infección anestesiando el ratón. El ratón debe permanecer completamente anestesiado durante 20 a 30 minutos para permitir que el virus sea absorbido antes de que el ratón despierte.
A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, utilice una aguja de calibre 30 para rayar la córnea del ojo derecho. Ahora numere el animal mediante perforación en la oreja. A continuación, inyecte al ratón un mililitro de suero humano agrupado con el fin de proteger las córneas de daños durante la infección primaria.
Luego, utilice un pipeteador de 20 microlitros para infectar el ojo rayado con 10 a la sexta unidades formadoras de placas y coloque cinco microlitros de HBSS en el otro ojo para mantenerlo húmedo mientras el animal está anestesiado, a fin de confirmar la infección. Hidrate un aplicador de algodón estéril con un mililitro de medio Vero. Tres días posteriores a la infección, hisopé el ojo infectado con el aplicador y luego transfiera 100 microlitros del medio hisopado a células Vero cultivadas en placas de 48 pocillos, al menos cinco semanas después de la infección primaria.
Frote el ojo infectado de un ratón anestesiado tal como se acaba de mostrar. Marque el frotis como día cero en la tapa de la placa de 48 pocillos para controlar los parpadeos espontáneos. Luego, coloque el ratón en un transiluminador que pueda emitir UVB con una longitud de onda máxima de 302 nanómetros, de manera que solo un ojo quede expuesto a la luz UVB, y exponga al ratón a 250 milijoules de luz UVB por centímetro cuadrado.
Luego, realice un hisopado del ojo diariamente desde el día uno hasta el siete. Después de la irradiación con UVB, para aquellos hisopos que contengan virus infeccioso, cuantifique la cantidad de virus mediante un ensayo estándar de placas utilizando placas de 12 pocillos para evaluar a los ratones por enfermedad ocular clínica. Coloque el ratón bajo un microscopio estereoscópico binocular.
La opacidad corneal se califica en una escala de cero a cuatro, donde cero indica estroma claro, uno indica opacificación estromal leve, dos indica opacidad moderada con iris discernible, tres indica opacidad densa con pérdida de los detalles definidos del iris excepto en los márgenes de la pupila, y cuatro indica opacidad total sin visión posterior.
La neovascularización se califica en una escala de uno a ocho dividiendo la córnea en cuatro cuadrantes iguales y determinando el grado de vascularización en cada uno de estos cuadrantes. En esta primera figura, se indujo la reactivación con irradiación UVB en ratones infectados de forma latente y luego se monitoreó la opacidad corneal en los ratones durante 35 días. Estos datos demuestran que los ratones macho C 57 black six presentan significativamente menos opacidad corneal que los ratones hembra C 57 black six, ya que hubo una enfermedad inducida por el virus significativamente mayor en los ratones hembra C 57 black six desde el día 14 hasta el día 35.
Asimismo, cuando se evaluó la neovascularización corneal bajo las mismas condiciones experimentales, los ratones macho mostraron un crecimiento significativamente menor de nuevos vasos en la córnea en comparación con los ratones hembra, y una vez más, existe una enfermedad inducida por el virus significativamente mayor en los ratones hembra C57BL/6 entre los días 14 y 28. Al intentar este procedimiento, recuerde anestesiar completamente a los ratones para que permanezcan dormidos entre 20 y 30 minutos. Después de ver este video, espero que tenga una comprensión de cómo utilizar el modelo de queratitis estromal recurrente en ratones para estudiar esta enfermedad humana.
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Descripción general
Este estudio presenta un modelo recurrente de enfermedad corneal herpética, que imita de cerca la enfermedad humana causada por el virus del herpes simple (HSV). El modelo permite investigar las infecciones recurrentes por HSV y su impacto en la salud corneal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Virología
- Oftalmología
Antecedentes
- La queratitis estromal herpética es una de las principales causas de ceguera infecciosa en todo el mundo.
- Los modelos de infección primaria no representan con precisión la enfermedad humana.
- Comprender las infecciones recurrentes es fundamental para desarrollar tratamientos eficaces.
- Este estudio tiene como objetivo establecer un modelo que refleje el proceso de la enfermedad humana.
Objetivo del estudio
- Estudiar infecciones recurrentes por HSV en un entorno controlado.
- Evaluar la progresión de la enfermedad en un modelo que imita las condiciones humanas.
- Valorar la eficacia de posibles intervenciones terapéuticas.
Métodos Utilizados
- Se infectan ratones para establecer una infección latente por HSV sin daño corneal.
- Se induce la reactivación del virus mediante exposición a luz UVB.
- Se recoge el filme lagrimal para la detección de liberación viral.
- Se monitorean los ratones para evaluar la progresión de la enfermedad durante cinco semanas.
Resultados principales
- El modelo imita con éxito la enfermedad corneal herpética recurrente.
- Se detectó la liberación viral tras la reactivación.
- La puntuación de la enfermedad indicó la gravedad de la queratitis en los ratones.
- Los hallazgos contribuyen a comprender las enfermedades corneales relacionadas con el HSV.
Conclusiones
- Este modelo recurrente es una herramienta valiosa para estudiar las infecciones por HSV.
- Proporciona información sobre los mecanismos de la enfermedad y tratamientos potenciales.
- Investigaciones futuras pueden basarse en estos hallazgos para mejorar los resultados en los pacientes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La queratitis estromal herpética recurrente (HSK) en ratones proporciona un modelo clínicamente relevante para estudiar la reactivación del HSV y la patología corneal, reflejando estrechamente el curso clínico en humanos. Este modelo permite una evaluación rigurosa de los mecanismos inmunológicos y las intervenciones terapéuticas bajo condiciones controladas de reactivación. Su valor predictivo apoya la validación temprana de dianas terapéuticas y la reducción de riesgos en terapias candidatas para portafolios de enfermedades oculares inducidas por HSV.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías inmunológicas implicadas en la reactivación del HSV y la enfermedad corneal.
- Apoya la validación funcional de dianas implicadas en la patogénesis viral recurrente.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al distinguir entre factores desencadenantes de enfermedad aguda y recurrente.
- Proporciona una plataforma para la evaluación basada en hipótesis de las interacciones huésped-patógeno.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece un sistema reproducible para cuantificar la excreción viral y la patología corneal.
- Normaliza la puntuación de la enfermedad para la opacidad y la neovascularización, favoreciendo la comparabilidad de ensayos.
- Permite una evaluación robusta de candidatos terapéuticos y vacunales en un contexto relevante para la enfermedad.
- Facilita la escalabilidad para el cribado de compuestos y la comparación entre estudios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con los mecanismos de enfermedades humanas al modelar la reactivación del HSV y la patología recurrente.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de estrategias inmunomoduladoras.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de candidatos con eficacia demostrada en entornos de enfermedad recurrente.
- Facilita el desarrollo de biomarcadores para puntos finales traslacionales como la opacidad corneal y la neovascularización.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este modelo de ratón se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir la reactivación controlada del HSV, la evaluación cuantitativa de la enfermedad y el análisis inmunológico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los factores inmunitarios que impulsan la queratitis herpética recurrente.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas de la carga viral y la patología corneal.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la gravedad de la enfermedad y el impacto terapéutico entre cohortes.
- Investigación Traducional: Conecta los conocimientos mecanicistas con la validación preclínica en un modelo clínicamente relevante.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para la prueba iterativa de diversas modalidades terapéuticas dirigidas a la recurrencia del VHS.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva para la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación del VHS.
- Valor operativo: Proporciona protocolos estandarizados y reproducibles para la inducción y puntuación de la enfermedad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción de terapias dirigidas al VHS basándose en puntos finales relevantes para la traslación.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos con eficacia en modelos de enfermedad recurrente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en virología, modelos de enfermedades oftálmicas y manejo de animales.
- Exige acceso a equipos de irradiación UVB y protocolos de puntuación validados.
- Necesita estandarización entre equipos para la inducción de la enfermedad y la medición de resultados.
- La adaptación a otras cepas o especies puede requerir optimización del protocolo.
- Las limitaciones del modelo incluyen respuestas inmunitarias específicas de la especie y las exigencias técnicas de la evaluación corneal.
