Ingeniería de tejidos del intestino en un modelo murino

Este video demostrará nuestra técnica para generar intestino delgado modificado por tejido en el ratón utilizando unidades de organoides en un enfoque de andamio. En este experimento, los animales fueron tratados de acuerdo con el comité institucional de cuidado y uso de animales y las pautas del Centro de Cuidado de Animales del Hospital de Niños del Instituto de Investigación Savon de Los Ángeles. El primer paso es la obtención de intestino de ratón completo.

El ratón y los instrumentos sacrificados humanamente se preparan con etanol al 70% en agua, y se realiza una incisión en la línea media para acceder a la cavidad peritoneal. El intestino delgado se eviscera y se divide justo distal al ligamento de los trillos. A continuación, se disecciona brusca y sin rodeos para separarlo del mesenterio y sus vasos.

Finalmente, el íleon ha seccionado cinco milímetros proximal a la válvula ileocecal. Se muestra que el intestino delgado extraído está a escala. Aquí procedemos a abrir el intestino longitudinalmente a lo largo del borde antimesentérico en una solución salina tamponada de Hank con una solución antifúngica antibiótica X.

A continuación, el intestino se limpia con materia fecal en el plato, seguido de tres lavados repetidos con HBSS y un tubo de ensayo. El tejido intestinal se hunde hasta el fondo del tubo y un material flotante es un residuo mesenquimal que se puede desechar. La solución de lavado se retira cuidadosamente con una pipeta.

A continuación, el intestino se pica en trozos cuadrados de menos de un milímetro con unas tijeras. El material picado se recoge con una pipeta automática. El material de lavado picado ya está listo para la digestión.

La solución de digestión contiene DASE 0,125 miligramos por mililitro y colagenasa 800 unidades por mililitro en HBSS con antibiótico antifúngico. Nótese el color parduzco de la solución de digestión en comparación con el HBSS con antibiótico antifúngico. Se prepara recién y se añaden 10 mililitros al material picado.

Se incuba a 37 grados centígrados durante 20 minutos en un rotador. El tejido se altera aún más mediante la iteración con una pipeta, como se muestra aquí. Esto se repite de 20 a 50 veces hasta obtener una apariencia uniforme.

La punta de pipeta de 10 mililitros tiene un tamaño óptimo. Para ello, se detiene la reacción con tres mililitros de DMEM de cuatro grados con un 10% de suero bovino fetal. El material se centrifuga durante 10 minutos.

A 500 RPM, el sobrenadante se desecha y el pellet se resuspende en un lavado de 10 mililitros de DMEM de cuatro grados con suero bovino fetal al 10%. A continuación, se centrifuga durante cinco minutos a 800 RPM para recuperar todo el tejido, excepto las células individuales que permanecen en el sobrenadante S y se desechan. El pellet contiene las unidades de organoides, el material más ligero en la parte superior, indicado por las pinzas y el material de la cintura.

Por debajo de esta capa, el DMEM con suero se retira con una pipeta. Se tiene cuidado de no suspender el pellet en la pipeta. Las últimas gotas se pueden eliminar de forma más segura con la pipeta de plástico desechable.

Aquí se muestra el andamio de polímero de ácido poliglicólico o PGA utilizado en nuestros experimentos. Los dos milímetros distales de la punta de una pipeta desechable de 1000 microlitros se recortan con tijeras estériles. Cargamos el polímero con unidades de organoides en cuatro placas de cultivo de pared para minimizar la dispersión del material lejos del polímero.

Las unidades de organoides se cargan en el andamio con la pipeta primero en el lumen y luego en la superficie exterior. Se utiliza una segunda pinza para garantizar un recubrimiento adecuado del lumen, se tiene cuidado de no alterar la forma cilíndrica del polímero. El ratón huésped utilizado en el caso de un donante transgénico es un diabético no obeso inmunodeprimido.

Animal inmunodeficiente en cadena gamma inmunodeficiente severo o patín gamma. De lo contrario, se pueden implantar huéspedes singénicos para su implantación. Después de inducir la anestesia general, se afeita, se prepara y se cubre el abdomen.

Se realiza una incisión de 0,5 centímetros en la línea media. El epiplón mayor se identifica y se eviscera cuidadosamente. El polímero cargado se envuelve en el epiplón y se asegura con una sutura monocryl de cinco oh.

Es de vital importancia que el epiplón no se desgarre, o las células pueden filtrarse al peritoneo. El polímero cargado asegura el epiplón se reemplaza en el abdomen, que se cierra en capas. Se utiliza una sutura de Vicryl de cuatro oh, de forma interrumpida, para cerrar.

Primero la capa muscular y luego la piel para la analgesia postoperatoria, dos miligramos por kilogramo. El ketoprofeno en agua estéril se inyecta como una rueda subcutánea adyacente a la incisión cuatro semanas después de la implantación, el animal huésped se sacrifica humanamente y se vuelve a abrir la incisión original. La construcción de ingeniería tisular se identifica como un globo y puede ser adherente al estómago y a las vísceras intraabdominales.

Las adherencias se reducen bruscamente y se recupera un esteroide de intestino modificado por tejidos. Aquí se muestra el esteroide cosechado en comparación directa con el polímero inicial. En esta imagen, el lumen del intestino diseñado se ha abierto bruscamente para revelar su interior.

El tejido puede fijarse para el análisis histológico o utilizarse de forma inmediata para diversos ensayos biológicos moleculares, como hemos demostrado en otras publicaciones. Aquí se muestra una micrografía de tinción de hematina y eosina de baja potencia de una construcción típica de intestino delgado de ingeniería tisular exitosa. La flecha hacia la izquierda indica el lumen revestido con mucosa intestinal, y la flecha hacia la derecha muestra el páncreas del huésped.

Que se ha adherido a la construcción.