Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo de plántulas de Arabidopsis en el RootChip, una plataforma de imágenes de microfluidos que combina el control automatizado de las condiciones de crecimiento con control microscópico y la raíz FRET basada en la medición de los niveles intracelulares de metabolitos.

Con el fin de proporcionar el máximo rendimiento, las plantas necesitan ser provistas de un conjunto de nutrientes, las deficiencias de nutrientes, el estrés como el frío o el calor extremo, la sequía o los patógenos causan pérdidas masivas en el rendimiento de los cultivos cada año. El origen de muchos de estos problemas suele estar en la clandestinidad. La raíz es el ancla física de la planta, pero también es el órgano responsable de la absorción de agua y de la absorción de nutrientes minerales como el nitrógeno, el sulfato de fósforo y muchos oligoelementos.

Si queremos desarrollar enfoques sostenibles para producir cultivos de alto rendimiento, necesitamos comprender mejor cómo se desarrollan las raíces, cómo absorben este amplio espectro de nutrientes y cómo interactúan con los organismos simbióticos y patógenos. Para ello, necesitamos ser capaces de explorar las raíces a nivel microscópico por razones obvias. El estudio de la biología de las raíces siempre ha sido más desafiante que el estudio de las partes aéreas de la planta.

Dado que las raíces suelen estar ocultas bajo tierra, no son fácilmente accesibles para los estudios microscópicos. La remoción del suelo causa daños severos al sistema radicular y, por lo tanto, no es una buena manera de estudiar su comportamiento. Una solución para hacer que las raíces sean más accesibles es cultivarlas en jeed o se muestra en este ejemplo en medios hidropónicos.

Los planes de cultivo en medios gelatinosos o en medios hidropónicos se han utilizado con mucho éxito en muchos estudios de raíces, pero con estos métodos, todavía es muy difícil estudiar las raíces en detalle microscópico y durante largos períodos de tiempo para acercarse lo más posible a la raíz en crecimiento y evitar cualquier estrés físico de la preparación para la toma de imágenes. Construimos una plataforma que nos permite cultivar e imagenear las raíces, y al mismo tiempo nos permite controlar y modificar el microambiente de las raíces con muy alta precisión y rapidez. A esta plataforma la llamamos el chip raíz. El chip de raíz es un dispositivo microfluídico fabricado a partir de PDMS, un polímero orgánico a base de silicona.

El chip cuenta con cámaras de observación para el crecimiento y la obtención de imágenes de las raíces de las plántulas de opsis de conejo. Las semillas germinan primero en conos de plástico fabricados con puntas de pipeta de plástico, que llenamos con medios sólidos. Luego, la punta de la raíz crece a través del medio y llega a la cámara donde experimenta un flujo continuo de medio líquido, manteniendo las condiciones en la cámara.

Las válvulas micromecánicas constantes desarrolladas por el laboratorio de Steve Quake en la Universidad de Stanford aquí se muestran en control rojo. El flujo Dado que el chip está montado en una cubierta de vidrio transparente como se usa normalmente para la microscopía, todos los procesos en la cámara de observación se pueden monitorear en un microscopio invertido. La estructura de canal bifurcado que guía el flujo de fluido se puede ver bajo el microscopio.

El chip raíz consta de dos capas, una capa de control que contiene las válvulas y una capa de flujo que contiene los canales a través de los cuales fluyen las soluciones de prueba de medios de crecimiento a las cámaras de observación. El volumen de estas cámaras es de aproximadamente 400 nanolitros. Esto significa que solo se necesitan cantidades muy pequeñas de solución y las condiciones se pueden cambiar muy rápidamente.

Este protocolo describe cómo se preparan las raíces vivas de ocho plántulas de Arabidopsis para obtener imágenes microscópicas paralelas en el chip de la raíz y se observan durante un máximo de tres días, comenzando llenando una placa de Petri de 10 milímetros con un medio de crecimiento que contiene un 1% de agar mientras el medio aún está líquido. Llene 10 puntas de pipeta de microlitros con cinco microlitros de medio de la placa de Petri utilizando una pipeta multicanal. Las puntas llenas se almacenan en la caja de puntas de pipeta hasta que el medio esté sólido.

Luego corte conos de plástico de cuatro milímetros de largo y colóquelos en posición vertical en una placa de Petri que contenga un medio de crecimiento sólido. Después de la esterilización de la superficie, las semillas individuales se colocan encima de los conos llenos de medios. A continuación, el plato se sella con cinta adhesiva de microporos y la placa se almacena a cuatro grados para sincronizar la germinación.

Después de tres días, las placas se transfieren a un gabinete de crecimiento para comenzar la germinación. Nuestras condiciones de crecimiento en este experimento son de 23 grados. Con un punto de luz de 16 horas, un ciclo de oscuridad de ocho horas entre cinco y siete días después de la germinación, la plántula debe estar lista para ser transferida a la raíz de la plántula y, si corresponde, la expresión de un marcador fluorescente debe verificarse bajo un microscopio de disección.

Tan pronto como las puntas de las raíces de las plántulas llegan a la salida inferior del cono de plástico, las plántulas individuales se marcan para transferirlas al chip. Se deben seleccionar unas 10 plántulas de plantas en caso de que una se dañe durante la transferencia para esterilizar el chip de raíz. Para experimentos a largo plazo, el dispositivo se envuelve en tejido, se coloca en una placa de Petri de vidrio y se esteriliza en autoclave.

Este chip acaba de ser autoclave antes. El experimento después de enfriar el chip se superpone con medios de crecimiento líquidos. El chip debe estar completamente cubierto, pero el nivel de líquido no debe superar los tres milímetros sobre la superficie del chip.

Se utiliza una pipeta de 20 microlitros para extraer los medios a través de la entrada y la salida de la cámara Root. Esto llena la cámara de observación. Con los medios seleccionados, los conos de plástico ahora se conectan al chip raíz.

El cono debe encajar perfectamente en las entradas. Dado que el chip raíz está montado sobre una capa delgada de vidrio óptico, se debe tener cuidado de no aplicar demasiada presión al chip. Durante este paso, el chip ahora se prepara para una incubación nocturna dentro del medio líquido para evitar que el chip flote.

Dos portaobjetos de vidrio, uno cortado por la mitad, se colocan sobre el chip. Se añade una barra magnética y se cierra el plato. El ensamblaje ahora se transfiere a un agitador magnético, que agitará suavemente el medio para facilitar el crecimiento de las raíces hacia las salidas.

El chip raíz. Las entradas están perforadas en ángulo para soportar aún más el crecimiento en la dirección deseada. Incline ligeramente el conjunto levantando el lado del chip que está opuesto a las salidas.

El chip se ilumina con una lámpara anular conectada a un interruptor temporizador para mantener el ritmo de luz y oscuridad. Después de la incubación durante la noche, el medio de crecimiento líquido se prepara en un vial presurable hermético. Los siguientes pasos deben realizarse rápidamente y sin interrupción para evitar el secado de las plántulas.

El chip ahora se retira del medio líquido y se coloca boca abajo en la abertura inferior del portador del chip, que también está invertido. El chip debe orientarse de modo que el lado que contiene las entradas de la capa de control quede orientado hacia el lado de la línea de presión. Dos conectores grandes en la pared lateral del soporte.

El cubreobjetos de la parte inferior del chip se seca secando suavemente con papel de seda y se fija al soporte. Con cinta adhesiva, se invierte todo el conjunto. Los conectores de los tubos se llenan de agua con una jeringa y cada conector de los tubos se conecta a la entrada correspondiente.

En el chip. El tubo se conecta al medio y a la solución. A continuación, los viales y el aire se extraen de las tuberías aplicando presión a la bilis diablina de la solución con una jeringa de aire, el portador se cubre con plástico transparente.

Para mantener una alta humedad en el conjunto, el portador se coloca en la platina del microscopio. Debe encajar exactamente en las muescas del escenario. Las válvulas de viruta, así como el flujo de medio a través de la viruta, se controlan mediante presión de aire.

Dos líneas con reguladores se ramifican de una línea de presión principal. Uno se utiliza para controlar el flujo de fluido y el otro está conectado a válvulas de aire solenoides. Estas válvulas se operan desde la computadora a través del controlador de válvulas USB y son responsables de accionar las válvulas en el chip.

Ambos reguladores de presión deben estar cerrados antes de conectar el chip. Los tubos, los conectores y los viales de solución ahora están conectados a las líneas de presión correspondientes. Se añaden unos mililitros de agua a los depósitos del portador.

Es posible que sea necesario repetir este paso en el transcurso de experimentos más largos. Para mantener la humedad alta, mantenga la carga de volumen para minimizar la cantidad potencial de líquido que podría derramarse sobre el microscopio. El anillo de luz se mueve a su posición sobre el chip para mantener el ciclo de luz y oscuridad hasta que comience el experimento.

Las válvulas del chip se cierran aplicando presión, en este caso abriendo las válvulas de aire del solenoide. La interfaz de vista de laboratorio permite el control de las válvulas haciendo clic en el botón debajo del número de válvula. El verde brillante indica la aplicación de presión y el cierre de una válvula de viruta.

Este esquema ilustra la organización del sistema de válvulas, mientras que las válvulas cuatro a ocho actúan como válvulas simples, las válvulas cero a tres actúan. En grupos con este sistema, se puede abordar una cámara individual activando una combinación de válvulas, por ejemplo, para guiar el flujo de fluido exclusivamente a la tercera cámara desde las válvulas superiores cero, tres y cuatro deben estar cerradas. Además, las válvulas seis, siete y ocho controlan qué solución se utiliza para lavar las entradas A, B y C ahora activan las tres válvulas de entrada de solución para cerrarlas.

La interfaz del controlador cuenta con un bucle de retroalimentación, que permite monitorear el estado del sistema. Esta función se puede activar haciendo clic en el botón de relectura. El regulador de presión para la capa de control se abre primero y se ajusta a 15 PSI.

Luego, el regulador de la capa de flujo se abre y se ajusta a cinco PSI. Se abre la válvula de entrada para el medio de crecimiento elegido y se enjuagan las cámaras con las rutas de flujo del medio que deben verificarse bajo el microscopio. En la mayoría de los casos, el aire queda atrapado en los canales y debe eliminarse.

Además, los canales del aire de control todavía contienen aire que debe ser expulsado y reemplazado por el agua de los conectores de tubería. Este proceso se denomina relleno de callejón sin salida. Ambas tareas se logran lavando cada una de las ocho cámaras varias veces hasta que todo el aire es forzado de los canales al PDMS.

El sistema se puede programar para automatizar experimentos. Estas rutinas también se pueden utilizar para desgasificar el chip. El propósito principal del chip raíz es combinar una plataforma de imágenes y un sistema de profusión en un solo dispositivo.

Para demostrar la manipulación del microambiente de las raíces, enjuagamos las cámaras con tinte y medimos el intercambio de fluido dentro de las cámaras. A la presión recomendada de cinco PSI, medimos un intercambio completo en 10 segundos a un caudal calculado de aproximadamente 1,5 microlitros por minuto. También observamos el crecimiento de las raíces de las plántulas, en este caso cultivadas en la oscuridad y suministradas con 10 milimolares de glucosa como fuente de energía externa.

Dependiendo de las condiciones de crecimiento, como la luz y la composición del medio, las plantas se pueden observar en el chip de raíz hasta por tres días. Este sistema se ha utilizado para monitorizar los niveles intracelulares de glucosa y galactosa en raíces que expresan nanosensores codificados genéticamente. Estos sensores basados en la transferencia de energía de primera resonancia o traste se desarrollaron en el laboratorio de Fromer.

Para este experimento, las raíces del chip se perfundieron con pulsos cuadrados de solución de glucosa o galactosa. Los niveles intracelulares de azúcares se monitorizaron y se muestran aquí, expresados como una relación entre la intensidad del aceptor de fluoro cuatro citrino y la intensidad del ECFP donante a la izquierda. Observamos la cantidad de sensores de citrino en la imagen central o métrica de la punta de la raíz, y a la derecha, trazamos la cantidad de azúcar como respuesta a tres pulsos cuadrados repetidos de glucosa en verde y galactosa en rojo.

El aumento en la proporción indica una acumulación de azúcar. Las principales ventajas del chip de raíz sobre los métodos de crecimiento convencionales son la preparación mínimamente invasiva para la microscopía, la capacidad de alterar de manera reversible y repetida el entorno de la raíz y la capacidad de observación continua del tejido fisiológicamente competente y fisiológicamente saludable durante un período de días. Otra ventaja realmente importante es que solo se necesitan cantidades mínimas de líquido para suministrar a las raíces todos los nutrientes necesarios con el tiempo.

Esto hace que el chip de raíz sea muy rentable, especialmente cuando se aplican reactivos costosos. Continuamos optimizando el chip de raíz y extendiendo su usabilidad porque creemos que al hacer que este importante órgano sea más accesible para los tratamientos y la observación, las herramientas microfluídicas como el chip de raíz potencialmente abrirán nuevas dimensiones de la investigación de plantas. Puede encontrar más información sobre cómo construir un sistema de chips raíz en nuestro sitio web.

Las virutas se pueden pedir en la fundición de Stanford.