Name: Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Aprende a cultivar plántulas de Arabidopsis en el RootChip, una plataforma microfluídica que permite el control automatizado de condiciones de crecimiento y el monitoreo microscópico del desarrollo radicular durante hasta tres días.

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Damos las gracias a Philipp Denninger para obtener ayuda con la preparación de vídeo y Chaudhuri Bhavna para proporcionar líneas de plantas que expresan FRET sensores. Este trabajo fue apoyado por becas de la National Science Foundation (MCB 1.021.677), el Departamento de Energía (DE-FG02-04ER15542) de la WBF, los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto Médico Howard Hughes de SRQGG fue apoyada por una larga EMBO -período de la beca. MM fue apoyado por la Fundación Alexander von Humboldt.

Nota: Realice todos los pasos de las medidas preparatorias en condiciones estériles. 1. Preparación de los conos de plástico para la germinación de la semilla <ol><li> Llenar un 10 cm de placa de Petri con medio de crecimiento que contenía 1% de agar a un espesor de 5 mm. Utilizamos una fuerza media modificada Hoagland medio 4, pero la composición del medio debe ser elegido para adaptarse a los requisitos individuales experimentales. </li><li> Mientras que el medio es todavía líquida, utilice una pipeta multicanal para cubrir puntas de pipeta de 10 ml con 5 ml de medio de la placa de Petri. </li><li> Guarde las puntas llenas en la caja de punta de la pipeta hasta que el medio es sólido, luego se corta a 4 conos de plástico mm de largo y el lugar en posición vertical en una placa de Petri que contiene medio de crecimiento sólido. </li></ol> 2. La germinación de semillas y crecimiento de plántulas <ol><li> Surface esterilizar las semillas en 5% de NaOCl durante 5 min, se lava tres veces con agua estéril, a continuación, colocar una sola semilla en la parte superior de cada uno de los cono medio llenos. </li><li> Selle la placa con cinta Micropore (3M) y se almacena a 4 ° C para sincronizar la germinación. </li><li> Después de tres días, transferir las placas a una cabina de crecimiento para iniciar la germinación. Nuestras condiciones de crecimiento son de 23 ° C en un ciclo de 16 horas de alta light/8h oscuro (Intensidad de la luz: 100 μE m -2 s -1). </li><li> Entre 5 y 7 días después de la germinación, las plántulas deben estar listos para la transferencia a la RootChip. En este momento, puntas de las raíces deben estar cerca de los desagües de fondo de los conos de plástico. Comprobar el estado de plántula, longitud de raíz y, en su caso, la expresión de un marcador fluorescente bajo un microscopio de disección. </li><li> Marcar plántulas individuales para la transferencia en el chip. Seleccione una decena de plantas de semillero en caso de que uno se daña durante la transferencia. </li></ol> 3. La transferencia de plántulas en el RootChip <ol><li> Para esterilizar el RootChip de experimentos a largo plazo, envuelvael dispositivo en papel de seda, el lugar en un plato Petri de vidrio, y autoclave. </li><li> Una vez que el RootChip se haya enfriado, cubrir con medio de cultivo líquido. El RootChip debe estar completamente sumergido, pero el nivel del líquido no debe ser mayor de 3 mm por encima de la superficie RootChip. </li><li> Con una pipeta 20 ul, tirar de medio a través de la entrada de la raíz y salida de la cámara para llenar la cámara de observación con el medio. </li><li> Conos de plástico diseñados seleccionado en el paso 2.5 en las entradas de RootChip. Los conos deben quedar bien ajustados en las entradas. Dado que el RootChip está montado sobre una fina capa de cristal óptico, no se aplican demasiada presión al chip. </li><li> Incubar la RootChip durante la noche en medio líquido. Para evitar flotante, colocar dos portaobjetos de vidrio en el chip. Añadir una barra de agitación magnética y cerrar el plato. </li><li> Traslado a la asamblea a un agitador magnético y agitar suavemente el medio. </li><li> La entradas RootChip se cruzan los canales en un ángulo de 30 ° en el dispositivo normal a FACIlitate crecimiento de las raíces en los canales (Figura 1A). Para apoyar aún más el crecimiento en la dirección deseada, incline ligeramente el conjunto mediante la colocación de un portaobjetos de vidrio bajo la placa de Petri en el lado opuesto de la viruta de las salidas. </li><li> Para mantener el ciclo luz / oscuridad, iluminar las plantas de semillero con una lámpara de anillo (Intensidad de la luz: 100 μE m -2 s -1) conectado a un temporizador. </li></ol> 4. Conexión de la RootChip al Transportista <ol><li> El día siguiente, llenar un vial hermético, presurizable con medio de crecimiento líquido (Figura 1B). </li><li> Invertir el soporte de chip y colocarlo sobre una superficie estable. Quitar el RootChip del medio líquido e insertarla lado PDMS abajo en la abertura inferior del soporte de chip. Oriente el chip de manera que el lado que contiene las entradas de la capa de control se enfrenta al lado de los conectores de tubo de presión de línea en la pared lateral portador. </li><li> Secar la cubierta de vidrio en elparte inferior del chip secando suavemente con papel de seda. Asegure el RootChip a la compañía con la cinta y el derecho a toda la asamblea. </li><li> Conectores de tubería se realizan cortando un tubo flexible de plástico microperforado (TYGON, 0.20 &quot;x 0.060&quot; OD) en trozos de 5 cm de largo y conecta a los tubos de acero inoxidable microperforado (Nueva Inglaterra tubo pequeño, 0,025 &quot;de diámetro exterior x 0.013&quot; x 0.75 &quot; de largo). Rellenar los conectores de tubo con agua usando una jeringa y el tapón cada conector del tubo en la entrada de control de la capa correspondiente en el chip. El agua después se llenan los canales de la capa de control y se utiliza para transmitir la presión a las válvulas micromecánicos. </li><li> Enchufe los extremos opuestos de las líneas en los medios de comunicación y envase de la solución (s). Aplicar presión en el vial de solución con una jeringa de aire. La presión de aire mayor en el envase de la solución forzará líquido en las líneas. </li></ol> 5. Montaje de la RootChip en el microscopio <ol><li> Coloque el soporte sobre el Microscetapa de opa. Para reducir la posibilidad de que el conjunto de desplazamiento durante el curso del experimento, debido a las vibraciones en la sala, el portador debe encajar exactamente en las muescas del inserto etapa. </li><li> Las válvulas de chips y el flujo del medio a través del chip son controlados por la presión del aire. Dos líneas con los reguladores se separaron de una línea de presión principal - una se utiliza para controlar el flujo de medio a través de los canales, y el otro se conecta a las válvulas de solenoide de aire que accionan las válvulas hasta empuje de la capa de control. Las válvulas de solenoide se manejan desde el ordenador a través del controlador USB de la válvula (desarrollado por Rafael Gómez-Sjöberg, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley). Cierre las dos reguladores de presión antes de conectar el chip. </li><li> Añadir unos mililitros de agua a los embalses de la compañía para mantener la humedad alta dentro de la asamblea. Este paso se debe repetir en curso de los experimentos más largos para mantener las plantas se sequen. Mantenga el volumen bajo para reducir al mínimo tél cantidad de líquido que podría ser derramado sobre el microscopio. Para experimentos a largo plazo, la salida de los puntos de venta de chips puede ser guiado en los depósitos de la compañía mediante la conexión de los puntos de venta de chips para los depósitos con un tubo microperforado (ver paso 4.4). Alternativamente, el flujo de salida que se acumula sobre la superficie del chip pueden ser recogidos por pipeteado. </li><li> Preparar hojas cuadradas de plástico transparente de protectores de hojas (C-Line). Fijar el plástico transparente a la compañía por la cinta de doble cara para mantener la humedad alta en la asamblea. </li><li> Coloque el anillo de luz sobre el chip y mantener el ciclo luz / oscuridad. El anillo de luz debe ser desconectada antes del comienzo de cualquier experimento que utiliza marcadores fluorescentes, como la iluminación directa va a interferir con la colección de imágenes. </li></ol> 6. Funcionamiento de la RootChip utilizando el interfaz de LabVIEW La interfaz de controlador de RootChip para la plataforma de software LabVIEW puedepuede descargar desde nuestro sitio web <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> Las válvulas en el chip se cierran mediante la aplicación de presión a la capa de control, en este caso mediante la apertura de las válvulas de solenoide de aire. La interfaz de control permite el accionamiento de las válvulas haciendo clic en el botón situado debajo del número de la válvula. Verde brillante indica la aplicación de presión y el cierre de una válvula de chip (Figura 2B). Activar las tres válvulas de entrada de solución en la interfaz de controlador antes de abrir los reguladores de presión. Nota: La interfaz de controlador dispone de un circuito de retroalimentación, que permite el seguimiento del estado del sistema. Esta función puede activarse haciendo clic en la &quot;relectura&quot; en la interfaz de controlador. </li><li> Abra el regulador de presión para la capa de control y establecido inicialmente en 15 psi, a continuación, abra el regulador para la capa de flujo y fijado inicialmente a 5 psi. Dependiendo del caudal deseado, las presiones pueden ser ajustados después. </li><li> Abrir la válvula de entrada para el medio de crecimiento de elección para vaciar las cámaras con el medio. </li><li> Ver las trayectorias de flujo bajo el microscopio. Normalmente, el aire queda atrapado en los canales de flujo y debe ser eliminado. Adicionalmente, los canales de la capa de control todavía contienen aire que debe ser forzado a salir y se sustituye por el agua de los tubos conectores (sin salida de llenado). Ambas tareas se logran mediante el lavado de cada una de las ocho cámaras en varias ocasiones (5 psi) hasta que el aire es forzado desde los canales en el PDMS (&quot;desgasificación&quot;). Nota: El controlador de interfaz puede ser programado para automatizar experimentos. Tales rutinas también puede utilizarse para desgasificar el chip. </li></ol> 7. Los resultados representativos El propósito principal de la RootChip es combinar una plataforma de imágenes y un sistema de perfusión en un solo dispositivo con un alto nivel de integración. Para demostrar la manipulacióndel microambiente de las raíces que lavarse las cámaras con colorante oscuro (dilución 1:4 en medio hidropónico) y se midió el intercambio de fluidos dentro de las cámaras. A la presión recomendada de 5 psi se midió un cambio completo dentro de 10 segundos a una velocidad de flujo calculado de aproximadamente 1,5 l / min (Figura 3). También se observó crecimiento de las raíces de las plántulas, en este caso crecido en la oscuridad y se suministra con 10 mM de glucosa como fuente de energía externa (Figura 4). Dependiendo de las condiciones de crecimiento tales como la luz y la composición del medio, las plantas se puede observar en la RootChip de hasta tres días. El RootChip se ha utilizado para monitorizar la glucosa intracelular y los niveles de galactosa en las raíces que expresan nanosensores genéticamente codificados, basado en Förster Resonancia transferencia de energía (FRET) 5-7. Las raíces en el chip se perfundieron con pulsos cuadrados de glucosa o galactosa solución ( <strong&gt; Figura 5). Los niveles intracelulares de azúcares fueron controlados y se muestran aquí expresado como una relación de la intensidad de la Citrino fluoróforo receptor a la intensidad de la ECFP donante. El aumento de la relación indica la acumulación de azúcar. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. RootChip principio. <ol class="ualpha"><li> El RootChip cuenta con ocho cámaras de observación para el crecimiento y la imagen de las raíces. Las primeras semillas germinan en conos de plástico - fabricada a partir de puntas de pipeta de plástico - que se llena con un medio sólido. La punta de la raíz crece a través del medio y llega a la cámara donde un flujo continuo de medio líquido mantiene las condiciones de la constante de cámara. Las válvulas micromecánicos (rojo) controlar el flujo. El chip está montado sobre una cubierta de vidrio óptico. El dibujo no está a escala. (Adaptado con el permiso de Grossmann et al., 2011 Plant Cell.) </li><li> Scheme de un frasco de solución de presurizable con el diafragma (rojo). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Conectar y montar el RootChip. <ol class="ualpha"><li> Vista superior de la RootChip completamente conectado y el vehículo montado en un microscopio invertido. </li><li> Esquema que ilustra el sistema de válvulas y el interfaz de control. Un ejemplo de una válvula de ajuste para guiar el flujo de fluido a una sola cámara se muestra. Mientras que las válvulas de 4 a 8 actúan como válvulas, válvulas individuales de 0 a 3 actúan en grupos. Con este sistema una cámara individual puede ser abordado mediante la activación de una combinación de válvulas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Intercambio de soluciones en el cap de observaciónámbar. de visualización del tipo de cambio de líquido en una cámara de observación utilizando solución de colorante. La imagen es una superposición de campo claro y falso color de intensidad de la señal de tinte. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. El chip crecimiento de las raíces. La observación de una sola raíz creciente expresar un fluorescente FRET nanosensor para la glucosa / galactosa en el transcurso de 20 horas. Formato de hora: hh: mm, barra de escala: 100 m. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Medir los niveles de azúcar en la intracelulares utilizando nanosensores FRET. <ol class="ualpha"><li> La cantidad de sensor se muestra como la intensidad citrino dentro de la punta de la raíz (izquierda). La respuesta de la intracelular FRET nanosensor para la aplicación de la glucosa o galactosa solución se muestra como imágenes ratiometric. (Adaptado con el permiso de Grossmann et al., 2011 PlaCelular nt) barra de escala. 100 m. </li><li> Seguimiento de FRET los cambios de relación en respuesta a impulsos repetidos tres cuadrados de la glucosa (verde) y galactosa (en rojo). </li></ol>

<ol><li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
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<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li>
<li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li>
<li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-in-chip%3A+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las principales ventajas de la RootChip sobre los métodos convencionales de crecimiento son la preparación mínimamente invasiva para la microscopía, la capacidad de alterar de forma reversible y repetidamente el entorno de las raíces, y la capacidad para la observación continua de tejido sano desarrollo competente y fisiológicamente durante un período de varios días. Anteriormente, las plántulas fueron cultivadas en medios gelificados verticalmente y se transfiere a un sistema de perfusión inmediatamente antes del experimento, que permite sólo medir raíces individuales en un momento 8. Herramientas de microfluídica se han utilizado para la Arabidopsis, pero en un nivel de integración bajo 9 o sin control de la perfusión 10. El RootChip combina un alto nivel de integración con la capacidad de automatizar el flujo de experimentos mediante la orientación precisa. Otra ventaja de esta plataforma, típico de todos los dispositivos de microfluidos 11, es que sólo cantidades mínimas de líquido se requiere para suministrar la raíz con la tuerca necesariorients, incluso para los experimentos que abarcan varios días. El RootChip está diseñado como un dispositivo de un solo uso, pero dado que los costes de producción de patatas fritas son bajas, las pequeñas cantidades de reactivos consumidos hace que el chip todavía muy rentable. Hay algunos pasos críticos que deben ser adoptadas para garantizar la salud de las plantas de semillero: El volumen en los conos de plástico es sólo l 3-4, que comenzará a secarse cuando se expone al aire. Por lo tanto, es fundamental que los conos se transfieren en el chip rápidamente y la humedad se mantiene alta hasta que las raíces han llegado a las cámaras de observación, que los abastecen con agua suficiente. Pasos 4.2 a 4.5 se debe realizar rápidamente y sin interrupción para evitar la desecación de las plántulas. Pasos 3,5 - 3,8 describir la incubación de la viruta en medios líquidos durante el cual las raíces crecen en las cámaras de observación. Este paso puede ser omitido por el montaje de la viruta en la carrier inmediatamente e iniciar la perfusión constante con medio de crecimiento. Sin embargo, se recomienda sumergir en el medio de cultivo durante la noche, ya que tiene algunas ventajas: 1) Se crea un ambiente húmedo por lo que las plántulas son menos propensos a ser desecado a medida que crecen dentro de la cámara de observación, 2) el chip se sumerge en un líquido, por lo que desgasificación (paso 6,4) será más rápido. Es importante utilizar los medios con bajas concentraciones de soluto. Soluciones más concentradas pueden precipitar y obstruir los canales, sobre todo si el chip se utiliza durante varios días. Una vez que el dispositivo está conectado a la línea de presión de aire, el flujo de medio de cambio es controlada por la presión hidráulica en las válvulas. Para garantizar el cierre adecuado de las válvulas micromecánicos, es importante elegir una presión de control que es aproximadamente tres veces mayor que la presión del flujo. La presión de aire no debe exceder de 15 psi como el fluido será empujado fuera de las entradas de la raíz. Presiones más altas may también provocar la deslaminación del chip, que hace que el chip inutilizable. Una limitación de la RootChip es que PDMS es poroso e hidrofóbicas. Mientras que el material es prácticamente inerte a soluciones acuosas, que pueden absorber compuestos orgánicos 12. Esto puede interferir con un intercambio rápido de soluciones como compuestos orgánicos pueden filtrarse a partir del material, incluso cuando el suministro de este compuesto se ha detenido en la entrada. Debido a la porosidad, el uso de disolventes orgánicos que pueden causar la hinchazón de la PDMS 12. Seguimos para optimizar la RootChip y extender su utilidad, por ejemplo con las raíces de las plantas de cultivo. Creemos que mejorando el acceso a la raíz para el tratamiento y la observación, las herramientas de microfluidos, como el RootChip abrirá nuevas dimensiones de la investigación de la raíz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artículos </td><td> Fuente </td><td> Información </td></tr><tr><td> El portador de chip, software y otro tipo de información. </td><td> Institución Carnegie - DPB </td><td> CAD y CNC para la fabricación de los archivos de soporte, software de control y más información están disponibles para su descarga desde el sitio web <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS</a> Los transportistas también se pueden pedir desde este sitio web. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Fundición de Stanford </td><td> Diseños de máscaras y protocolos de fabricación están disponibles bajo petición. Listo para usar RootChips se puede pedir a <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Chip de la controladora </td><td> -Casa construida-</td><td> El sistema de controlador de la válvula automática fue desarrollado originalmente por Rafael Gómez-Sjöberg, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley. Una instrucción detallada sobre cómo construir su propio controlador de la válvula de accionamiento se puede encontrar en <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la rootchip

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Las funciones de las raíces como el ancla de la planta física y es el órgano responsable de la captación de agua y nutrientes minerales tales como los elementos nitrógeno, fósforo, sulfato y de seguimiento que las plantas adquieran en el suelo. Si queremos desarrollar enfoques sostenibles para la producción de alto rendimiento de los cultivos, tenemos que comprender mejor cómo se desarrolla la raíz, tiene un amplio espectro de nutrientes, e interactúa con organismos simbióticos y patógenos. Para lograr estas metas, tenemos que ser capaces de explorar sus raíces en detalle microscópico durante períodos de tiempo que van desde minutos a días. Hemos desarrollado el RootChip, un polidimetilsiloxano (PDMS) - dispositivo de microfluidos basada en, lo que nos permite crecer y las raíces de las plántulas de Arabidopsis imagen, evitando cualquier tensión física a las raíces durante la preparación para la imagen 1 (Figura 1). El dispositivo contiene una estructura de canal bifurcado con válvulas de micro-mecánicos para guiar el flujo de fluidoa partir de entradas de solución a cada una de las ocho cámaras de observación 2. Este sistema de perfusión permite el microambiente raíz para ser controlado y modificado con precisión y rapidez. El volumen de las cámaras es de aproximadamente 400 nl, por lo que requieren sólo cantidades mínimas de solución de ensayo. A continuación presentamos un protocolo detallado para el estudio de la biología de raíz en el RootChip el uso de imágenes basadas en los enfoques de la resolución en tiempo real. Las raíces pueden ser analizados a lo largo de varios días utilizando microscopía de lapso de tiempo. Las raíces pueden ser perfundidos con soluciones nutritivas o inhibidores, y hasta ocho plantas de semillero pueden ser analizados en paralelo. Este sistema tiene el potencial para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo el análisis de crecimiento de las raíces en la presencia o ausencia de productos químicos, la fluorescencia basada en el análisis de la expresión génica, y el análisis de los biosensores, por ejemplo FRET nanosensores 3.

Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo de plántulas de Arabidopsis en el RootChip, una plataforma de imágenes de microfluidos que combina el control automatizado de las condiciones de crecimiento con control microscópico y la raíz FRET basada en la medición de los niveles intracelulares de metabolitos.

Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

La raíz funciona como el anclaje físico de la planta y es el órgano responsable de la absorción de agua y nutrientes minerales, tales como el nitrógeno, ...

Para proporcionar rendimientos máximos, es necesario suministrar a las plantas una serie de nutrientes, ya que las deficiencias de nutrientes, así como estrés causado por frío o calor extremo, sequía o patógenos, provocan pérdidas masivas en el rendimiento de los cultivos cada año. El origen de muchos de estos problemas suele estar bajo tierra. La raíz es el anclaje físico de la planta, pero también es el órgano responsable de la absorción de agua y de la captación de nutrientes minerales como nitrógeno, sulfato de fósforo y muchos elementos traza.Si queremos desarrollar enfoques sostenibles para producir altos rendimientos de cultivos, necesitamos comprender mejor cómo se desarrollan las raíces, cómo absorben este amplio espectro de nutrientes y cómo interactúan con organismos simbióticos y patógenos. Para lograrlo, necesitamos poder explorar las raíces a nivel microscópico por razones obvias. Estudiar la biología de las raíces siempre ha sido más desafiante que el estudio de las partes aéreas de la planta.Dado que las raíces generalmente están ocultas bajo tierra, no son fácilmente accesibles para estudios microscópicos. La extracción del suelo causa daños severos al sistema radicular y, por lo tanto, no es una buena manera de estudiar su comportamiento. Una solución para hacer las raíces más accesibles es cultivarlas en agar o, como se muestra en este ejemplo, en medios hidropónicos.El cultivo de plantas en medios gelificados o en medios hidropónicos se ha utilizado con gran éxito en muchos estudios de raíces, pero con estos métodos, aún es muy difícil estudiar las raíces con detalle microscópico y durante largos períodos de tiempo. Para acercarnos lo más posible a la raíz en crecimiento y evitar cualquier estrés físico derivado de la preparación para la obtención de imágenes, construimos una plataforma que nos permite cultivar e imaginar raíces, y al mismo tiempo nos permite controlar y modificar el microentorno de las raíces con una precisión y velocidad muy elevadas. Esta plataforma la denominamos chip de raíz. El chip de raíz es un dispositivo microfluídico fabricado a partir de PDMS, un polímero orgánico a base de silicona.El chip presenta cámaras de observación para el crecimiento y la obtención de imágenes de raíces de plántulas de rabbit opsis. Primero, las semillas germinan en conos de plástico fabricados a partir de puntas de pipeta de plástico, que rellenamos con medio sólido. Luego, la punta de la raíz crece a través del medio y alcanza la cámara, donde experimenta un flujo continuo de medio líquido, manteniendo así las condiciones dentro de la cámara.Las válvulas micro-mecánicas constantes desarrolladas en el laboratorio de Steve Quake en la Universidad de Stanford se muestran aquí con control en rojo. Como el chip está montado sobre un vidrio de cubierta transparente, tal como se utiliza normalmente para microscopía, todos los procesos en la cámara de observación pueden monitorizarse mediante un microscopio invertido. La estructura de canal bifurcado que dirige el flujo de fluido puede observarse al microscopio.El chip de raíz consta de dos capas: una capa de control que contiene las válvulas y una capa de flujo que contiene los canales por los cuales los medios de crecimiento y las soluciones de prueba fluyen hacia las cámaras de observación. El volumen de estas cámaras es aproximadamente 400 nanolitros. Esto significa que se necesitan únicamente cantidades muy pequeñas de solución y que las condiciones pueden cambiarse muy rápidamente.Este protocolo describe cómo preparar raíces vivas de ocho o más plántulas de Arabidopsis para su observación microscópica simultánea en un chip de raíz y su seguimiento durante hasta tres días. Comience llenando una placa de Petri de 10 milímetros con medio de crecimiento que contenga agar al 1 % mientras el medio aún esté líquido. Llene puntas de pipeta de 10 microlitros con cinco microlitros de medio de la placa de Petri utilizando una pipeta multicanal. Las puntas llenas se almacenan en la caja de puntas de pipeta hasta que el medio se solidifique.Luego, corte conos de plástico de cuatro milímetros de longitud y colóquelos en posición vertical en una placa de Petri que contenga medio de crecimiento sólido. Después de la esterilización superficial, se coloca una semilla individual encima de los conos llenos de medio. La placa se sella entonces con cinta microporo y se almacena a cuatro grados para sincronizar la germinación.Después de tres días, las placas se transfieren a un gabinete de crecimiento para iniciar la germinación. Nuestras condiciones de crecimiento en este experimento son 23 grados, con un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Entre cinco y siete días después de la germinación, la plántula debería estar lista para su transferencia al chip radicular; se debe evaluar la salud de la plántula y la longitud de la raíz, y, en su caso, verificar la expresión de un marcador fluorescente mediante un microscopio estereoscópico.En cuanto las puntas de las raíces de las plántulas alcancen la salida inferior del cono de plástico, se marcan plántulas individuales para su traslado al chip. Se deben seleccionar unas 10 plántulas por si alguna resulta dañada durante la transferencia, para esterilizar el chip de raíz. Para experimentos a largo plazo, el dispositivo se envuelve en tejido, se coloca en una placa de Petri de vidrio y se autoclava.Este chip acaba de ser esterilizado en autoclave. Después del enfriamiento del chip, el experimento se cubre con medio de crecimiento líquido. El chip debe quedar completamente cubierto, pero el nivel del fluido no debe superar los tres milímetros por encima de la superficie del chip.Se utiliza una pipeta de 20 microlitros para aspirar el medio a través de la entrada de raíz y la salida de la cámara. Esto llena la cámara de observación. Con el medio seleccionado, ahora se insertan conos de plástico en el dispositivo de raíz.El cono debe encajar firmemente en las entradas. Dado que el chip de raíz está montado sobre una capa delgada de vidrio óptico, se debe tener cuidado de no aplicar demasiada presión sobre el chip. Durante este paso, el chip ya está preparado para una incubación nocturna en medio líquido para evitar que el chip flote.Se colocan dos portaobjetos de vidrio, uno cortado por la mitad, sobre el chip. Se añade una barra magnética de agitación y se cierra el recipiente. El conjunto se transfiere ahora a un agitador magnético, que agitará suavemente el medio para facilitar el crecimiento de las raíces hacia las salidas.Las entradas del chip de raíz están perforadas en un ángulo para apoyar aún más el crecimiento en la dirección deseada. Incline ligeramente el ensamblaje elevando el lado del chip opuesto a las salidas.El chip se ilumina con una lámpara anular conectada a un interruptor temporizador para mantener el ritmo luz-oscuridad. Después de la incubación nocturna, se prepara medio de crecimiento líquido en un vial sellable y presurizable. Los siguientes pasos deben realizarse rápidamente y sin interrupción para evitar el secado de las plántulas.El chip se retira ahora del medio líquido y se coloca boca abajo en la abertura inferior del portachi, que también está invertido. El chip debe orientarse de modo que el lado que contiene las entradas de la capa de control quede frente al lado de la línea de presión. Dos conectores grandes en la pared lateral del portachi.El cubreobjetos en la parte inferior del chip se seca mediante un suave secado con papel de tejuelo y se fija al soporte. Con cinta, todo el conjunto se invierte a continuación. Los conectores de tubo se llenan con agua utilizando una jeringa, y cada conector de tubo se conecta a la entrada correspondiente.En el chip. Los tubos se conectan a los medios y soluciones. Los viales y el aire se eliminan luego de las líneas aplicando presión a la bilis de la solución con una jeringa de aire, y el portador se cubre con plástico transparente.Para mantener una alta humedad en el ensamblaje, el portador se coloca sobre la platina del microscopio. Debe encajar exactamente en las muescas de la platina. Las válvulas del chip, así como el flujo del medio a través del chip, se controlan mediante presión de aire.De una línea principal de presión se derivan dos líneas con reguladores. Una se utiliza para controlar el flujo de fluido y la otra está conectada a válvulas neumáticas solenoides. Estas válvulas son operadas desde la computadora mediante el controlador de válvulas USB y son responsables de accionar las válvulas en el chip.Se deben cerrar ambos reguladores de presión antes de conectar el chip. Ahora se conectan los tubos, conectores y viales de solución a las líneas de presión correspondientes. Se agregan algunos mililitros de agua a los depósitos del portador.Es posible que este paso deba repetirse durante el transcurso de experimentos más largos. Para mantener la humedad alta, mantenga la carga de volumen al mínimo para reducir la cantidad potencial de líquido que podría derramarse sobre el microscopio. La luz anular se coloca en posición sobre el chip para mantener el ciclo de luz y oscuridad hasta que comience el experimento.Las válvulas del chip se cierran aplicando presión, en este caso mediante la apertura de las válvulas de aire solenoides. La interfaz de LabVIEW permite el control de las válvulas haciendo clic en el botón debajo del número de la válvula. El verde brillante indica la aplicación de presión y el cierre de una válvula del chip.Este esquema ilustra la organización del sistema de válvulas, mientras que las válvulas cuatro a ocho actúan como válvulas individuales, las válvulas cero a tres actúan en grupos. En este sistema, se puede dirigir un flujo hacia una cámara individual activando una combinación de válvulas; por ejemplo, para guiar el flujo de fluido exclusivamente hacia la tercera cámara desde la parte superior, las válvulas cero, tres y cuatro deben cerrarse. Además, las válvulas seis, siete y ocho controlan qué solución se utiliza para lavar las entradas A, B y C; ahora active las tres válvulas de entrada de solución para cerrarlas.La interfaz del controlador incluye un bucle de retroalimentación, que permite monitorear el estado del sistema. Esta función puede activarse haciendo clic en el botón de lectura de retorno. Primero se abre el regulador de presión para la capa de control y se ajusta a 15 PSI.Luego se abre el regulador para la capa de flujo y se ajusta a cinco PSI. Se abre la válvula de entrada para el medio de crecimiento elegido y se lavan las cámaras; los recorridos del flujo del medio deben verificarse bajo el microscopio. En la mayoría de los casos, el aire queda atrapado en los canales y debe eliminarse.Además, los canales del aire de control aún contienen aire que debe ser expulsado y reemplazado por el agua proveniente de los conectores de los tubos. Este proceso se denomina llenado por extremo cerrado. Ambas tareas se logran lavando cada una de las ocho cámaras varias veces hasta que todo el aire es expulsado de los canales hacia el PDMS.El sistema puede programarse para automatizar experimentos. Dichas rutinas también pueden utilizarse para desgasificar el chip. El objetivo principal del chip radicular es combinar una plataforma de imagen y un sistema de perfusión en un único dispositivo.Para demostrar la manipulación del microentorno de las raíces, enjuagamos las cámaras con un colorante y medimos el intercambio de fluido dentro de las cámaras. A la presión recomendada de cinco PSI, medimos un intercambio completo en 10 segundos, con una velocidad de flujo calculada de aproximadamente 1,5 microlitros por minuto. También observamos el crecimiento de raíces de plántulas en este caso cultivadas en la oscuridad y suministradas con 10 milimolares de glucosa como fuente externa de energía. Dependiendo de las condiciones de crecimiento, como la luz y la composición del medio, las plantas pueden observarse en el chip de raíz hasta por tres días. Este sistema se ha utilizado para monitorear los niveles intracelulares de glucosa y galactosa en raíces que expresan nanosensores codificados genéticamente. Estos sensores, basados en la transferencia de energía de resonancia o fret, fueron desarrollados en el laboratorio Frommer.Para este experimento, las raíces en el chip se perfundieron con pulsos cuadrados de solución de glucosa o galactosa. Los niveles intracelulares de azúcares se monitorearon y se muestran aquí, expresados como una relación entre la intensidad del fluoróforo aceptor citrina y la intensidad del donador ECFP a la izquierda. Observamos la cantidad de sensores citrina en el centro o la imagen métrica de razón del ápice radicular, y a la derecha, trazamos la cantidad de azúcar como respuesta a tres pulsos cuadrados repetidos de glucosa en verde y galactosa mostrada en rojo.El aumento en la relación indica una acumulación de azúcar. Las principales ventajas del trozo de raíz frente a los métodos convencionales de crecimiento son la preparación mínimamente invasiva para la microscopía, la capacidad de alterar reversible y repetidamente el entorno de la raíz y la posibilidad de observar continuamente tejidos fisiológicamente sanos y con competencia desarrolladora durante varios días. Otra ventaja realmente importante es que se necesitan cantidades mínimas de líquido para suministrar a las raíces todos los nutrientes necesarios a lo largo del tiempo.Esto hace que el chip de raíz sea muy rentable, especialmente cuando se aplican reactivos costosos. Continuamos optimizando el chip de raíz y ampliando su utilidad porque creemos que, al hacer que este órgano importante sea más accesible para tratamientos y observación, herramientas microfluídicas como el chip de raíz podrían abrir nuevas dimensiones en la investigación vegetal. Más información sobre cómo construir un sistema de chip de raíz puede encontrarse en nuestro sitio web.Los chips se pueden pedir en el Stanford Foundry.

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