Examinando familia Bcl-2 Función con grandes vesículas unilamelares

Este sistema modelo bioquímicamente definido de grandes vesículas Ella imita la membrana mitocondrial externa para observar la función de las proteínas BCL dos in vitro. Primero, combine los lípidos y cree una película lipídica en un vial sellado. Luego, prepare una solución fresca de LUV y solubilice la película lipídica.

A continuación, extruya la solución lipídica y purifique las grandes LUV mediante filtración en gel. El paso final consiste en analizar las LUV en busca de un aumento inducido por detergentes en la fluorescencia. En última instancia, el sistema modelo de LUV se utiliza para evaluar la función y regulación de proteínas permeables a la membrana, como las proteínas BCL-2 recombinantes.

Este enfoque que utiliza vesículas grandes tiene varias ventajas sobre sistemas existentes como las mitocondrias. Las vesículas se generan con lípidos purificados en ausencia de proteínas. Están definidas bioquímicamente tanto en composición como en tamaño.

Esto permite interpretaciones claras de los resultados, ya que las únicas proteínas bajo estudio son las que se añaden. Este método puede proporcionar información mecanicista sobre la capacidad de la familia BCL dos para regular la integridad de la membrana mitocondrial externa. También puede aplicarse a otros sistemas que investiguen la remodelación de membranas y la actividad permeabilizante.

Esto incluiría maquinaria mitocondrial dinámica o toxinas formadoras bacterianas. Trabajar en una campana extractora con iluminación mínima. Enjuagar una jeringa de vidrio tipo Hamilton Gast con cloroformo.

Luego, en un vial de vidrio GL de 1,5 mililitros, combine los cuatro miligramos de lípidos solubilizados en cloroformo. A continuación, para eliminar el cloroformo, aplique un flujo suave de un gas inerte como nitrógeno o argón. Después de dos a tres horas, verifique una película lipídica seca en el fondo y las paredes del vial en tampón LUV.

Prepare soluciones de 500 microlitros del colorante polianiónico y del agente apagador iónico CAS mediante vortex. Las soluciones a mezclar. Luego combine las soluciones de A NTS y DPX mediante vortex durante un minuto y sométalas a sonicación en un baño de agua ultrasónico para asegurar que las soluciones estén completamente solubilizadas y homogéneas.

Ahora agregue la solución A-N-T-S-D-P-X a la película lipídica y selle el vial con película de parafina. Soneque la película lipídica durante cinco minutos. La solución aparecerá lechosa tras la sonicación. Asegúrese de que la solución esté completamente solubilizada, ya que los agregados lipídicos pequeños afectarán negativamente los pasos siguientes. Además, revise el fondo y los lados del vial para asegurarse de que no quede ninguna película lipídica residual.

Monte el extrusor según las instrucciones del fabricante utilizando tampón LUV para humedecer los soportes del filtro y la membrana de policarbonato; apriete la carcasa del dispositivo de manera que no haya pérdida de volumen durante la extrusión, pero sin excederse para no romper la membrana. Pruebe el extrusor con tampón LUV para asegurarse de que no haya fugas ni problemas. Ahora, llene la jeringa derecha con la solución lipídica y realice 31 extrusiones para que las vesículas grandes de ELLA atraviesen la membrana al menos una vez y se recojan en la jeringa izquierda. Las primeras extrusiones pueden requerir un poco más de presión si la solución atraviesa repentina y rápidamente la membrana.

Verifique la membrana en busca de roturas y cámbiela según sea necesario. Añada a la columna en un solo paso. Evite alterar la interfase de las perlas.

Deje que el tampón salga completamente de la columna. Cuando el flujo se detenga, tape la columna y llénela suavemente con tampón LUV, asegurándose de no perturbar las perlas. Luego retire el tapón y recoja seis fracciones de un mililitro cada una.

Los AUV normalmente se eluyen en las fracciones tres y cuatro y pueden identificarse por una apariencia turbia para reciclar el lavado de la columna y almacenar a cuatro grados Celsius. Los UUV en la fracción de la columna se detectan mediante un aumento en la fluorescencia debido a la presencia de chaps. Recuerde usar placas negras opacas de 96 pocillos para todos los estudios de LUV.

Pipetee 100 microlitros de tampón LUV o LUV más 0,5 % CHAPS en seis pocillos. Añada cinco microlitros de la fracción adecuada a cada uno y mezcle para la sinergia biotecnológica H uno. Abra el software Gen5 2.0, con una longitud de onda de excitación de 355 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 520 nanómetros.

Gane voltaje en la posición óptica 125 en la parte superior y lea la altura hasta 5,5 milímetros. Ahora lea la placa a 37 grados Celsius e identifique las fracciones que contienen LUV. Recupere las fracciones de LUV purificados.

Estos ensayos están diseñados para medir la capacidad de las proteínas BCL dos de inducir directamente la permeación de LUV y también para regular la actividad de permeación. Combine los componentes del ensayo en el orden indicado. En el manuscrito adjunto se proporcionan detalles sobre las titulaciones de las proteínas BS y bid.

Incube las reacciones a 37 grados Celsius durante los puntos temporales del ensayo. Inserte la placa en el lector de microplacas, que agitará la placa y medirá la fluorescencia como se mostró anteriormente. Este experimento utiliza liposomas LUV activados con detergente OG para generar un control positivo de permeación.

Vale la pena destacar que las concentraciones de OG inferiores al 0,025 % no afectan directamente la permeación de LUV aquí. También se utiliza un tratamiento con chaps al 0,5 % para determinar la cantidad máxima de fluorescencia de LUV por ensayo. Un punto de partida necesario para estudiar la permeación de LUV con proteínas de la familia BCL-2 es establecer las concentraciones de Bax y Bid que promuevan la liberación óptima.

Estas curvas de titulación de backs y bid muestran la liberación de fondo mínima y la sinergia óptima. Alternativamente, la permeación de LUV puede medirse de forma cinética. Estas lecturas se realizaron cada dos minutos durante 30 minutos, con dos segundos de agitación suave de la placa antes de cada lectura.

Este experimento determina la influencia de una proteína antiapoptótica sobre la permeación de LUV dependiente de Bax y Bid. BCL-XL inhibe la actividad de Bax y Bid de manera dependiente de la dosis. En un ensayo de represión D, el efecto inhibitorio puede revertirse mediante la adición de proteínas BH3 exclusivamente.

Por ejemplo, la puma beta se une a BCL-xl, lo que permite que Bax y Bid actúen de forma sinérgica y realicen la permeabilización. Las grandes vesículas ELLA. Una vez dominada esta técnica para generar grandes vesículas unilaminares, se posibilita el análisis eficiente y rápido de proteínas de la familia BCL-2, péptidos y moléculas pequeñas en un entorno bioquímicamente definido, similar al de la membrana externa mitocondrial. Es importante destacar que este ensayo permite el análisis rápido de cientos de condiciones utilizando tanto puntos finales como parámetros cinéticos.

No olvide que tanto las UUV como las proteínas BCL dos son altamente susceptibles a artefactos inducidos por detergentes. Utilice equipo limpio y libre de detergentes para garantizar resultados reproducibles.