Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad
December 28th, 2012
Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente aplicable a otras In vivo
El objetivo general de este procedimiento es aislar las proteínas unidas a la cromatina del corazón del ratón. Esto se logra primero homogeneizando el corazón y luego aislando los núcleos cardíacos del virus sacarosa, gradiente de densidad. A continuación, a continuación, se separa el plasma nuclear de la fracción de cromatina.
A continuación, las proteínas se extraen de la pastilla de cromatina para enriquecer las proteínas que se unen ligeramente al ADN. Finalmente, las proteínas se extraen de una pastilla de cromatina diferente para enriquecer las proteínas estrechamente unidas al ADN. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren las características del proteoma nuclear bajo diferentes condiciones fisiológicas a través del análisis cuantitativo de espectrometría de masas sin marcadores.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardíaco, como cómo la remodelación de la cromatina contribuye a la hipertrofia e insuficiencia cardíaca. Después de sacrificar un ratón adulto y extirpar el corazón, enjuáguelo con PBS helado. A continuación, colócalo en un vaso con dos mililitros de tampón de lisis que contiene una mezcla de inhibidores de proteasa y fosfatasa y homogeneízalo.
Vierta los lisados a través de un colador de 100 micras y recoja el filtrado en un tubo de 1,5 mililitros a partir de este punto, a menos que se especifique lo contrario, mantenga la muestra en hielo. Centrifugar la muestra a 4.000 rpm durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el supinato que contiene el citosol y guárdelo a menos 80 grados centígrados.
Reeses dobla el pellet en 200 microlitros de tampón de lisis. Agregue un mililitro de tampón de sacarosa a un tubo nuevo y coloque suavemente el pellet resuspendido sobre la almohadilla de sacarosa usando una centrífuga de pipeta de transferencia a 5.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Retire la película delgada en la parte superior, así como la almohadilla de sacarosa, que contiene la membrana.
Enjuague el pellet restante que contiene los núcleos con 200 microlitros de P-B-S-E-D-T-A tate helado, los núcleos que contienen el pellet en 200 microlitros de tampón de extracción de detergente y vórtice la muestra dos veces durante 10 segundos cada una. Coloque la muestra en hielo durante 10 minutos y luego centrifugue a 13.000 RPM durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el supinato que contiene proteínas del nucleoplasma y guárdelo a menos 80 grados centígrados.
Enjuague los pellets con P-B-S-E-D-T-A y vuelva a suspenderlo en 300 microlitros de tampón Tris, S-D-S-E-D-T-A. Sonicar la muestra de tres a seis veces durante 10 segundos cada una. Para romper el ADN, manteniendo la muestra en hielo entre sindicaciones centrífugas, 13.000 RPM durante cinco minutos de cuatro grados centígrados.
Mantenga el supinato que contiene la proteína aislada y guárdelo a menos 80 grados centígrados para enriquecer proteínas como las histonas, estrechamente unidas al ADN. Llevar a cabo un fraccionamiento separado para aislar el cromosoma, comenzando con un corazón adulto aislado o cardiomiocitos de PARPs de rata Triturar el pellet de cromatina en 400 microlitros de ácido sulfúrico 0,4 N y vórtice. Para eliminar los grumos, gire la muestra a cuatro grados centígrados durante 30 minutos o durante la noche después de la incubación, retire los restos nucleares girándolos a 16.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Transfiera el supinato a un tubo nuevo y agregue 132 microlitros de ácido tricloroacético gota a gota a la muestra. Invierta el tubo varias veces e incube en hielo durante 30 minutos. Después de centrifugar, deseche el supinato y use acetona helada para enjuagar suavemente la bolita que contiene histonas y centrifugar.
De nuevo, repita la acetona, lave y seque al aire el pellet antes de volver a suspenderlo. En 100 microlitros de tampón Triss S-D-S-E-D-T-A. Use un molar triss para ajustar el pH a ocho.
Sonicar la muestra en un baño de agua durante 15 minutos. Almacene la muestra a menos 80 grados centígrados. Utilice la espectrometría de masas para llevar a cabo análisis para determinar la pureza e identificar las proteínas que se muestran aquí.
Los cromatogramas iónicos extraídos superpuestos para un solo péptido que se ha mapeado a la proteína HMGB uno. Cada cromatograma proviene de una muestra de cromatina diferente y ha sido codificado por colores para representar el estado fisiológico del ratón del que se adquirió la muestra. Se analizaron tres réplicas biológicas para cada una de las condiciones fisiológicas, hipertrofia cardíaca basal e insuficiencia cardíaca y se analizó cada muestra dos veces, dando un total de 18 cromatogramas gramos.
Al integrar el área bajo la curva, se puede determinar la abundancia relativa para cada réplica. En este panel, se han promediado las seis réplicas para cada una de las tres condiciones fisiológicas para dar valores generales de abundancia. De este análisis se desprende claramente que la abundancia de HGB cambia durante el curso de la enfermedad, como se observa aquí.
El espectro de fragmentación de este péptido confirma su secuencia de aminoácidos y permite que se mapee en la proteína H MG B one. Por el contrario, la cuantificación de un péptido diferente de la histona H 4 muestra que su abundancia no cambia con la enfermedad. Podemos analizar la reproducibilidad de los cambios en la abundancia de péptidos que observamos entre los diferentes estados fisiológicos mediante análisis estadístico.
En primer lugar, la abundancia de todos los péptidos identificados en cada réplica se somete a un anova, seguido de un análisis de componentes principales o PCA. El agrupamiento de réplicas técnicas y biológicas en este gráfico confirma que los cambios de abundancia detectados por espectrometría de masas son consistentes y reproducibles entre los diferentes estados de la enfermedad. Basal en azul, hipertrofia, rojo, falla en verde, de igual importancia que la cuantificación y reproducibilidad de los resultados, es el aumento de la cobertura del proteoma nuclear posibilitado por el subfraccionamiento nuclear.
Esta figura ilustra que el análisis de todo el núcleo nuclear por sí solo no logra descubrir ni siquiera la mayoría de las proteínas nucleares identificadas cuando se combinan análisis individuales de los compartimentos separados. Además, la superposición moderada entre las diferentes fracciones demuestra la relevancia biológica de considerar estos compartimentos individualmente para obtener más información sobre la función nuclear y la regulación génica. Por último, la capacidad de fraccionar específicamente los cromosomas extraídos con ácido o detergente enriquece las proteínas estructurales clave de la cromatina, como las histonas, lo que permite un análisis de espectrometría de masas más centrado en un grupo de proteínas sin necesidad de anticuerpos específicos para cada variante e isoforma Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe mantener las muestras que se analizarán en el espectrómetro de masas libres de contaminación por queratina.
Esto es especialmente importante en los pasos posteriores al aislamiento de la proteína.
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Visión general
Este artículo describe un método para aislar proteínas unidas a la cromatina del tejido cardíaco de ratón, lo cual es crucial para entender el proteoma nuclear en diversas condiciones fisiológicas. El enfoque utiliza espectrometría de masas cuantitativa sin etiquetas para analizar las características de las proteínas asociadas con la enfermedad cardíaca.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Investigación cardiovascular
Fundamentos
- Los avances en espectrometría de masas permiten el análisis de proteínas de alto rendimiento.
- El fraccionamiento subcelular ayuda a estudiar las modificaciones de proteínas.
- Entender las proteínas asociadas a la cromatina es vital en modelos de enfermedades.
- Los modelos de enfermedad cardíaca proporcionan información sobre la dinámica del proteoma nuclear.
Propósito del estudio
- Aislar proteínas unidas a la cromatina del tejido cardíaco de ratón.
- Analizar las interacciones de las proteínas con el ADN bajo diversas condiciones.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de la enfermedad cardíaca.
Métodos utilizados
- Homogeneización del tejido cardíaco de ratón.
- Aislamiento de núcleos cardíacos mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa.
- Separación del plasmo nuclear de la fracción de cromatina.
- Extracción de proteínas de los sedimentos de cromatina para su análisis.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de proteínas asociadas a la cromatina.
- Identificación de proteínas unidas de manera débil y fuerte al ADN.
- Análisis cuantitativo revela características del proteoma nuclear.
- Información sobre la dinámica de las proteínas en condiciones fisiológicas.
Conclusiones
- El método proporciona un marco para estudiar las proteínas de la cromatina en la enfermedad cardíaca.
- Los resultados contribuyen a entender los roles de las proteínas en la fisiología cardíaca.
- El enfoque es aplicable a otros modelos in vivo de enfermedades humanas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of chromatin proteomes in disease enables biopharma teams to interrogate nuclear protein dynamics underlying gene regulation in cardiac pathology. This workflow provides predictive confidence for target validation and mechanistic de-risking at the intersection of epigenetics and disease progression. The approach supports portfolio decisions by clarifying nuclear protein contributions to disease-relevant transcriptional programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin remodeling and its impact on cardiac disease mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying nuclear protein abundance across disease states.
- Facilitates mechanistic de-risking through compartment-specific proteomic profiling.
- Provides data for predictive confidence in target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nuclear sub-fractions for downstream quantitative mass spectrometry workflows.
- Enables reproducible, label-free quantification of chromatin-associated proteins.
- Supports assay standardization by isolating proteins loosely and tightly bound to DNA.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns proteomic changes with disease-relevant physiological states in cardiac models.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking nuclear protein dynamics.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative proteomic data.
- Provides translational biomarker candidates through compartment-specific protein profiling.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing and mechanistic de-risking in cardiac disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on chromatin remodeling and gene regulation in disease.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative proteomic outputs for nuclear sub-compartments.
- Analytics: Provides statistical analysis (ANOVA, PCA) to compare protein abundance across conditions.
- Translational Research: Links proteomic changes to disease progression and biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for nuclear proteome analysis across organ systems and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes nuclear proteome isolation and quantification for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying nuclear protein roles in disease.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and translational biomarker candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclear fractionation and quantitative mass spectrometry.
- Demands access to high-resolution mass spectrometric instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates rigorous sample handling to prevent contamination and ensure reproducibility.
- Adaptable to various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.
- Dependent on careful compartmentalization to maximize proteome coverage and biological insight.
