Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

Este experimento utiliza la modulación selectiva de las isoformas de la proteína quinasa C para determinar sus funciones mitocondriales y celulares en células tubulares proximales renales bajo diversas condiciones fisiológicas y patológicas. Primero, aísle las células tubulares proximales renales primarias del cortex renal o RPC que poseen metabolismo oxidativo, semejante al de los túbulos proximales renales.

Infecte in vivo las RPC con vectores adenovirales que expresan formas activas e inactivas de la proteína cinasa C. Luego, analice las diferentes funciones mitocondriales y la viabilidad celular para determinar el efecto de la enzima sobre la capacidad mitocondrial de sintetizar ATP y prevenir la muerte celular. Asimismo, realice un análisis por inmunotransferencia de la proteína cinasa C épsilon fosforilada y total en lisados celulares obtenidos conjuntamente.

Los resultados muestran que la activación de la proteína quinasa épsilon regula negativamente la capacidad mitocondrial para generar ATP, disminuye los niveles celulares de ATP y la viabilidad de las células tubulares proximales renales. La principal ventaja de esta técnica frente a nuestras técnicas existentes, como las líneas celulares, es que los cultivos primarios de células tubulares proximales renales mantienen las funciones diferenciadas y el metabolismo oxidativo de los túbulos proximales renales. Dado que las proteínas quinasas pueden utilizarse como dianas y agentes terapéuticos potenciales, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia, ya sea para prevenir lesiones renales o para acelerar la recuperación renal tras una lesión.

Este método puede aportar información sobre el mecanismo de lesión y recuperación. También puede aplicarse, por ejemplo, al riñón de conejo aislado recientemente, lavando secuencialmente con 50 mililitros cada uno de medio D-M-E-M-F 12 estéril, solución salina tamponada con fosfato estéril, pH 7,4, y solución de PBS con óxido de hierro, para obtener la corteza de cada riñón.

Primero, homogenice el tejido utilizando un homogenizador de 15 mililitros. Luego, pase el homogenizado a través de dos tamices de malla estériles hacia un vaso de un litro estéril. Enjuague las células que quedan en los tamices con tampón que contenga deferoxamina.

Transfiera cualquier tejido que quede en el fondo del tamiz de 85 micrones a 40 mililitros de tampón que contenga deferoxamina, colocado en un tubo cónico de centrífuga. Mezcle suavemente la suspensión celular con el imán fuerte.

Capture los glomérulos cargados de hierro y aspire el hierro adherido al imán. Ajuste el volumen de la suspensión celular a 40 mililitros y agregue un mililitro de medio de digestión que contenga colagenasa. Incube a temperatura ambiente durante 17 minutos.

Mezclar suavemente la suspensión. Recoger las células mediante centrifugación a 50 veces G durante dos minutos a cuatro grados Celsius tras varios lavados. Resuspender el sedimento celular en 46 mililitros de medio que no contenga semilla de glucosa.

Siembre los RPC primarios a una densidad de un miligramo de proteína por placa de cultivo en dos mililitros de medio D-M-E-M-F 12 sin glucosa en un agitador orbital a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Tras reponer el medio, proceda a infectar las células TPR confluentes con adenovirus que portan ADNc para una proteína quinasa C épsilon constitutivamente activa o una proteína quinasa C épsilon dominante negativa, incube durante 24 horas, reponga el medio y cultive los RPC primarios transfectados durante otras 24 horas. Para visualizar la morfología mitocondrial de la monocapa de células primarias, reponga el medio, agregue MIT tracker red 580 y devuelva las placas al incubador durante 30 minutos.

Luego examine las monocapas vivas bajo un microscopio fluorescente utilizando inmersión acuosa. Objetivo dos. Para evaluar la función mitocondrial, analice la respiración en estado tres de la suspensión de CRTP en una cámara de consumo de oxígeno equipada con un electrodo del tipo Clark.

Primero, mida la respiración en estado dos en ausencia de un DP. Luego, agregue un DP hasta una concentración final de 0,4 milimolar. Para iniciar la respiración en estado tres, proceda a la respiración en estado cuatro. Agregue oligomicina hasta una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro.

Incluya también una medición de la respiración desacoplada mediante la adición de FCCP 0.5 micromolar a las células que respiran en el estado tres. Añada lentamente 20 microlitros de la solución de JC uno 0.5 milimolar a cada placa de cultivo de RPTC y agite suavemente para mezclar completamente el colorante. Devuelva las placas al incubador durante 30 minutos.

A continuación, coloque los cultivos en hielo y realice dos lavados con PBS frío. Luego, recoga las células. Transfiera las células de TPR a un tubo eppendorf y rompa las monocapas en una suspensión de células individuales mediante pipeteo.

Analice la fluorescencia mediante citometría de flujo utilizando excitación con un láser de argón de 488 nanómetros. Luego calcule el potencial de membrana mitocondrial de mitocondrias aisladas. Facilite la evaluación de la integridad de la cadena respiratoria.

Después de dos lavados de las monocapas de RPTC con tampón PBS frío, recoger las células y hacer un pellet por centrifugación. Lavar el pellet una vez con un mililitro de tampón A y luego homogeneizar las células en un homogeneizador Dounce hasta que la mayoría de las células del homogenato estén rotas al inspeccionarse bajo el microscopio. A continuación, eliminar los restos celulares mediante centrifugación a baja velocidad.

Centrifugar las mitocondrias crudas del sobrenadante a 15 000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y realizar tres lavados de las mitocondrias sedimentadas en tampón C. Suspender el sedimento mitocondrial en 50 a 100 microlitros del tampón de ensayo y congelar en nitrógeno líquido para analizar la actividad de la NADH ubiquinona oxidoreductasa. Añadir 500 microlitros del tampón de ensayo con aditivos y mitocondrias; incluir también una muestra en blanco que contenga todos los aditivos pero sin mitocondrias. Equilibrar la placa a 30 grados Celsius con agitación durante cinco minutos.

A continuación, coloque la placa en el espectrofotómetro y agregue 10 microlitros de ubiquinona 3,25 milimolar para iniciar la reacción en cada pozo. Registre la absorbancia a 340 nanómetros durante tres minutos a intervalos de 22 segundos. En un ensayo similar, mida la actividad de la citocromo C oxidasa utilizando citocromo C reducido como sustrato para la reacción de la ATP sintasa.

Prepare mezclas para ensayar la actividad total de APAs y la actividad de APAs insensible a la oligomicina de cada grupo de tratamiento. Incube las muestras en la mezcla de reacción a 31 grados Celsius durante 10 minutos. Inicie la reacción añadiendo un sustrato de TP e incube a 31 grados Celsius durante cinco minutos.

Transfiera 200 microlitros de la mezcla de incubación a un tubo que contenga 50 microlitros de TCA tres molar, precipite las proteínas en hielo durante 10 minutos. Luego, haga un pellet por centrifugación. A continuación, cargue una placa de 96 pocillos con 50 microlitros de cada patrón de fosfato y 50 microlitros de cada sobrenadante de muestra en duplicado.

Luego, agregue 250 microlitros de reactivo Sumner a cada pocillo e incube a 30 grados Celsius durante 15 minutos. A continuación, registre la absorbancia a 595 nanómetros. Lave las monocapas de RPTC dos veces con tampón PBS frío con hielo.

Recoger las células en un mililitro de PBS y transferir la suspensión celular a un tubo einor. Pelotar las muestras de RPTC mediante centrifugación y determinar un contenido de TP utilizando el método de luciferasa de un kit de ensayo de bioluminiscencia de ATP. Para el análisis de viabilidad celular en placas de 35 milímetros, utilizar cinco monocapas de RPTC para tres grupos de tratamiento control: células positivas para onosis, células positivas para apoptosis y un control sin tinción, distribuidas en dos placas.

Añada dos microlitros de cisplatino 50 milimolar al segundo conjunto. Añada dos microlitros de hidroperóxido de t-butilo 500 milimolar. Después de teñir las células utilizando yoduro de propidio según se detalla en el texto adjunto, lave las monocapas con el tampón de unión.

A continuación, tiña las células utilizando ANEXINA cinco conjugada con ZI según se describe en el protocolo del texto. Luego, recolecte suavemente las células y suspenda en 500 microlitros de tampón de unión. Utilizando un raspador de goma.

Utilice una pipeta para dispersar las células en una suspensión de células individuales y transfiera la suspensión celular a tubos para citometría de flujo. Dispersar las células en una suspensión de células individuales. Proceda inmediatamente a cuantificar la fluorescencia para PI y FE mediante citometría de flujo. La administración adenoviral de CD NA que recubre las formas mutantes constitutivamente activa e inactiva de la proteína quinasa C épsilon provoca un aumento significativo en los niveles proteicos de la proteína quinasa C épsilon en RPTC y en las mitocondrias.

Como era de esperar, la forma constitutivamente activa de la enzima está fosforilada en las RP tcs y la enzima dominante negativa no está fosforilada. La presencia de proteína quinasa C épsilon activa disminuye la respiración mitocondrial en las RPCT independientemente del sustrato utilizado para energizar las mitocondrias. Sin embargo, la proteína quinasa C épsilon inactiva no tiene ningún efecto sobre la respiración mitocondrial.

Curiosamente, la activación de la proteína quinasa C épsilon en las CTPR reduce la actividad de los complejos uno y cuatro. Esta disminución en la respiración de las CTPR se asocia con aumentos en el potencial de la membrana mitocondrial. El mutante dominante negativo no tiene tal efecto.

Estos cambios también se acompañan de disminuciones en la actividad de una sintasa de TP en mitocondrias aisladas de CTPR que sobreexpresan la proteína quinasa C épsilon activa. Como resultado, el contenido de ATP en CTPR que sobreexpresan la proteína quinasa C épsilon activa se reduce; la activación sostenida de la proteína quinasa C épsilon tiene profundos efectos sobre la morfología mitocondrial, evidenciados por la fragmentación mitocondrial.

La activación, pero no la inhibición, de la proteína quinasa C también provoca cambios en la morfología de las células tubulares proximales renales, causando encogimiento celular y alargamiento de las células sobrevivientes. Estos efectos mitocondriales de la sobreexpresión de la proteína quinasa C épsilon activa en las células progenitoras renales también se correlacionaron con la muerte celular por necrosis y apoptosis.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sobreexpresar proteínas en cultivos primarios utilizando la técnica con adenovirus y cómo evaluar la capacidad mitocondrial para la síntesis de TP. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Y, por último, no olvide que trabajar con adenovirus requiere acceso a instalaciones adecuadas, por lo que debe tomar precauciones como las apropiadas.