Name: Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Aprende a evaluar funciones mitocondriales y viabilidad celular en células tubulares renales mediante modulación de isoenzimas de proteína quinasa C. Este método revela el papel de PKC en el metabolismo energético renal.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, 2R01DK59558 (para GN). UAMS Traslacional del Instituto de Investigación financiado por los Institutos Nacionales de Salud Centro Nacional para la Investigación de los Recursos subvención UL1 RR029884 proporcionó financiación parcial para Core Citometría de Flujo en UAMS. Agradecemos al Dr. Peipei Ping (Universidad de California en Los Angeles, Los Angeles, CA) para proporcionar una alícuota de adenovirus que lleva el ADNc que codifica el dominante negativo (inactivo) mutante de PKC-ε y el Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) para proporcionar una alícuota de vector adenoviral que codifica el mutante constitutivamente activa de PKC-ε. También queremos agradecer a los Dres. Peter Parker y Peter Sugden (Imperial College London, Londres, Reino Unido) para proporcionar cDNA que codifica constitutivamente activa PKC-ε.

<ol><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li>
<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells%3A+improvements+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li>
<li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits%3A+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li>
<li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C%2C+Ras+plays+multiple+roles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li>
<li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B5+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li>
<li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ERK1%2F2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li>
<li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li>
<li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B1+and+ERK1%2F2+mediate+mitochondrial+dysfunction%2C+decreases+in+active+Na%2B+transport%2C+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li>
<li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-%281%2C2-dichlorovinyl%29-L-cysteine+injury+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li>
<li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+functional+p21WAF1%2FCIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis%3A+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El enfoque aquí presentado permite la sobreexpresión de isoenzimas individuales de la PKC en el cultivo primario de las células tubulares renales proximales. Hay varias ventajas de este enfoque: 1. Permite la investigación de los mecanismos de regulación en una población homogénea de células (células tubulares renales proximales) que son el objetivo principal de diversos insultos (isquemia, hipoxia, estrés oxidativo), drogas y nephrotoxicants dentro del riñón. 2. Funciones mitocondriales en este modelo in v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Campana de flujo laminar </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml y 15 ml Dounce molinillo de tejido </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 y 235 micras de malla de nylon </td><td> Piezas pequeñas </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml tubo de centrífuga estéril </td><td> Biologix </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml micro tubo </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm platos de cultivo estériles </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Centrífugas </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotores: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Ajustable micro-centrífuga </td><td> SIGMA </td><td> Modelo 1 a 15 </td></tr><tr><td> Monitor de Oxígeno Biológico </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Modelo 5300A </td></tr><tr><td> Monocameral Micro sistema de oxígeno </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> La sonda de oxígeno </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Baño Recirculador </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl y Kit de membrana estándar </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Agitador magnético </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Grabadora de cama plana </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-y 96-y placas transparentes </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Agitador orbital MaxQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> FLUOR Spectra Plus (absorbancia / fluorescencia / luminiscencia lector) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Con camisa de agua EE.UU. Autoflow automática incubadora de CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm de poliestireno tubos de cultivo de ensayo de citometría de flujo </td><td> Marca Fisher </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Objetivo de inmersión en agua 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxamina mesilato </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Colagenasa de tipo I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetracloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine yoduro (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Red </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP bioluminiscencia Kit de ensayo HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Anexina V - FITC </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa c isoenzimas

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

La proteína quinasa C (PKC), la familia de isoenzimas está implicado en numerosos procesos fisiológicos y patológicos. Nuestros datos recientes demuestran que la PKC regula la función mitocondrial y estado de energía celular. Numerosos informes demuestran que la activación de la PKC-a y PKC-ε mejora la función mitocondrial en el corazón isquémico y media la cardioprotección. En contraste, se ha demostrado que la PKC-α y PKC ε-están implicados en nephrotoxicant inducida por disfunción mitocondrial y la muerte celular en células de riñón. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo in vitro de células renales que mantienen activas las funciones mitocondriales en los que las isoenzimas PKC podría ser selectivamente activados o inhibidos para determinar su papel en la regulación de la fosforilación oxidativa y la supervivencia celular. Los cultivos primarios de células renales tubulares proximales (POCT) se cultivaron en condiciones mejoradas resultantes en la respiración mitocondrial y la actividad de Mitoenzimas mitocondriales similares a los de POCT in vivo. Debido a las técnicas tradicionales de transfección (Lipofectamine, electroporación) son ineficientes en cultivos primarios y tienen efectos adversos sobre la función mitocondrial, PKC-ε ADNc mutantes fueron entregados a través de POCT vectores adenovirales. Este enfoque implica la transfección de más del 90% RPTC culto. A continuación, se presentan los métodos para evaluar el papel de la PKC-ε en: 1. regulación de la morfología mitocondrial y funciones asociadas con la síntesis de ATP, y 2. supervivencia de POCT en cultivo primario. PKC-ε es activada por la sobreexpresión constitutivamente activa PKC-ε mutante. PKC-ε es inhibida por la sobreexpresión del mutante inactivo de la PKC-ε. La función mitocondrial se evalúa mediante el examen de la respiración, la integridad de la cadena respiratoria, actividades de complejos respiratorios y F 0 F 1-ATPasa, la tasa de producción de ATP, y el contenido de ATP. La respiración es unssessed en digitonina-permeabilizadas POCT como el estado 3 (respiración máxima en presencia de exceso de sustratos y ADP) y las respiraciones no acoplados. Integridad de la cadena respiratoria se evaluó midiendo las actividades de los cuatro complejos de la cadena respiratoria en las mitocondrias aisladas. Capacidad de la fosforilación oxidativa se evalúa midiendo el potencial de membrana mitocondrial, la tasa de producción de ATP, y la actividad de F 0 F 1-ATPasa. El estado de energía de POCT se evalúa mediante la determinación del contenido intracelular de ATP. Morfología mitocondrial en células vivas se visualizaron usando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente que se acumula específicamente en las mitocondrias, y las monocapas en vivo se examina bajo un microscopio de fluorescencia. Viabilidad RPTC se evalúa utilizando anexina V / yoduro de propidio tinción seguido por citometría de flujo para determinar la apoptosis y oncosis. Estos métodos permiten una activación selectiva / inhibición de las isoenzimas PKC individuopara evaluar su papel en las funciones celulares en una variedad de condiciones fisiológicas y patológicas que pueden ser reproducidos en in vitro.

La Figura 1 muestra que la entrega adenoviral de ADNc que codifica los constitutivamente activos (caPKC-ε) e inactiva (dnPKC-ε) mutantes de resultados PKC-ε en los niveles de proteína significativamente mayores de PKC-ε en POCT y en las mitocondrias. Las células infectadas con el vector de ADNc que lleva caPKC-ε sobreexpresa el fosforilada (activa) forma de PKC-ε mientras que las células infectadas con el ADNc que codifica dnPKC-ε overexpressed PKC-ε que era inactivo (no fosforilado) (figura 1)....

Los efectos de la activación de la proteína quinasa C (PKC) las isoenzimas en las funciones mitocondriales asociadas con la respiración y la fosforilación oxidativa y en la viabilidad celular se describen. El enfoque se adapta técnica adenoviral para sobreexpresar selectivamente las isozimas de la PKC en cultivo de células primarias y una diversidad de ensayos para determinar las funciones mitocondriales y el estado de energía de la célula.

Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

La familia de isozimas de la proteína quinasa C (PKC) está implicada en numerosos procesos fisiológicos y patológicos. Nuestros datos recientes demuestran que la PKC...

Este experimento utiliza la modulación selectiva de las isoformas de la proteína quinasa C para determinar sus funciones mitocondriales y celulares en células tubulares proximales renales bajo diversas condiciones fisiológicas y patológicas. Primero, aísle las células tubulares proximales renales primarias del cortex renal o RPCs que poseen metabolismo oxidativo, semejante al de los túbulos proximales renales.Infecte in vivo las RPC con vectores adenovirales que expresan formas activas e inactivas de la proteína cinasa C. Luego, analice las diferentes funciones mitocondriales y la viabilidad celular para determinar el efecto de la enzima sobre la capacidad mitocondrial de sintetizar ATP y prevenir la muerte celular. Además, realice un análisis por inmunotransferencia de la proteína cinasa C épsilon fosforilada y total en lisados celulares tomados conjuntamente.Los resultados muestran que la activación de la proteína quinasa épsilon regula negativamente la capacidad mitocondrial para generar ATP, disminuye los niveles celulares de ATP y la viabilidad de las células tubulares proximales renales. La principal ventaja de esta técnica frente a nuestras técnicas existentes, como las líne

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Investigación

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Biología

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Aprende a evaluar funciones mitocondriales y viabilidad celular en células tubulares renales mediante modulación de isoenzimas de proteína quinasa C. Este método revela el papel de PKC en el metabolismo energético renal.

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