Name: Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Aprende a rastrear plásmidos individuales en células de mamífero mediante microscopía de fluorescencia usando represor lac marcado. Este método permite observar genomas virales durante múltiples ciclos celulares en tiempo real.

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Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH y ACS, incluyendo T32CA009135, CA133027, CA070723, y CA022443. Bill Sugden es una Sociedad Americana del Cáncer Profesor de Investigación.

1. Ingeniería de células con plásmidos visibles <ol><li> Utilice la digestión de restricción estándar o técnicas de recombinación homóloga para introducir un fragmento de ADN que contiene aproximadamente 250 copias de la secuencia operador lactosa (LACO) en el plásmido para ser visualizados. Nuestra plásmido era un bácmido de aproximadamente 170 kpb y contenía el genoma completo de Sarcoma de Kaposi asociado a herpesvirus (KSHV) y la resistencia a la higromicina codificada 12. </li><li> Introducir Laco que contienen ADN plásmido en células de mamífero por transfección con Lipofectamine 2000. Estamos transfectadas las células HeLa y SLK en placas de 60 mm durante 4 horas con 10 g ADN de plásmido purificado con 25 l Lipofectamine 2000, 0,5 OptiMEM ml, y 3,5 ml de DMEM. </li><li> Cambiar el medio de cultivo a 5 ml de DMEM con 10% de células fetales de suero bovino y se incuban durante 48 hr. </li><li> Las células en placas de baja densidad en platos grandes y células de cultivo en un medio que contiene una selección de antibióticos para la presentación plasmid; se seleccionaron las células en DMEM con suero fetal bovino al 10% con 300 mg / ml de higromicina durante 3 semanas. </li><li> Utilice pedazos de estériles, la tripsina papel de filtro empapado de transferir higromicina colonias resistentes a los platos de la nueva cultura. </li><li> Cuando los clones transfectados han crecido hasta llenar el recipiente, para aislar el ADN de la digestión de restricción y transferencia de Southern para garantizar que el polímero de la plásmido Laco es homogéneo y del tamaño esperado. </li><li> Si el plásmido no se ha modificado genéticamente para expresar una fusión de LacI, infectar clones adecuados con un retrovirus que codifica el represor de lactosa (LacI) fusionada a una proteína fluorescente de color rojo, tal como LacI-tdTomato. Utilizamos tdTomato en lugar de proteínas que presentan fluorescencia verde cerca de minimizar photoxicity que ocurrir incluso a dosis múltiples durante largos tiempos de 13. </li><li> Una vez que la proteína de fusión LacI se introduce, cultivar las células en presencia de 200 mg / ml isopropil-bD-tiogalactósido (IPTG) para bloquear las proteínas de fusión de uniónDNA. </li><li> Cultivar las células durante al menos 3 días para permitir la expresión de la proteína de LacI-tdTomato. </li><li> Clones de pantalla (por lavar el IPTG y visualización de las células como se describe más adelante) para aquellos con niveles óptimos de LacI-tdTomato que revelan distintas señales con niveles de referencia mínimos de proteína no unida fusión. </li></ol> 2. Desarrollo del sistema de imágenes Nuestro sistema de formación de imágenes consiste en un Zeiss Axiovert 200M equipado con una platina motorizada y Plan-Aochromat 63x/1.4 objetivo aceite. Luz de excitación de fluorescencia es proporcionado por el &quot;blanco neutral&quot; LED de un sistema de Colibri. Emisión es detectada por un CascadeII: 1024 cámara EMCCD. Esta es una cámara enfriada, back-diluido con un registro de ganancia para amplificar las señales, la corriente oscura es 0,061 electrones por píxel por segundo, y la eficiencia cuántica es mayor que 0,90. El sistema está controlado por software Axiovision 4,8, incluyendo el módulo SmartExperiments. Para la detección de tdTomaa que utilizamos un 75HE Zeiss Juego de filtros para los que el 85% de la luz que pasa puede excitar el flúor y el 95% de la luz emitida pasará el filtro de emisión. <ol><li> Montar un sistema de imágenes con un microscopio invertido y una cámara EMCCD para la detección sensible de señales, una fuente de luz LED de excitación específica y el cierre rápido, una platina motorizada y brazo de enfoque, y el control de software para la adquisición automática de imágenes en intervalos de tiempo largos con múltiples z-pilas. El sistema debe sentarse en una mesa de aire a ser aislado de las vibraciones. </li><li> Montar una incubadora de etapa-top para mantener las células a 37 º C, 5-10% de CO2 en una cámara humidificada. Transcurrido el tiempo suficiente para que el sistema llega a una temperatura estable para minimizar los artefactos de movimiento durante el experimento. </li><li> Usar un collar caliente para el objetivo de prevenir el objetivo de sifón de calor de la muestra. </li></ol> 3. Visualización de ADN marcadas <ol><li> Células en placas de 35 mmplato de fondo de vidrio a una densidad de menos de 10% de confluencia, lo que permitirá pares de células que se dividan en las colonias de 8-16 células sin superposición. ¿Es esta hr al menos 24-48 antes de formación de imágenes de modo que las células viables tienen tiempo para dividir. </li><li> Uno a tres horas antes del inicio de formación de imágenes, enjuagar la placa 3 veces con medio de cultivo que carece de ambos fármacos selectivos e IPTG. Este procedimiento lava las células no viables y permite que las proteínas de fusión LacI para enlazar sitios Laco en los plásmidos. </li><li> Sustituir el medio de cultivo con 2 ml de DMEM con suero fetal bovino al 10% y HEPES 25 mM. </li><li> Reemplazar la parte superior de la placa de cultivo con CultFoil estira en un anillo de montaje para un plato de 35 mm. Esta tapa inhibir la evaporación del medio de cultivo, lo que aumentaría la concentración de sal en el tiempo y matar a las células. </li><li> El uso de contraste de interferencia (DIC) de imágenes para ver las células y determinar el plano focal de la parte superior e inferior de las células en múltiples campos de visión.En cada campo, se mueven a un plano focal de aproximadamente 1/3 del camino hacia abajo desde la parte superior de la celda. Guarde el x, y, z las coordenadas en la relación de puestos de fase guardado. Nota: Las señales plásmido puede no ser visible a través de los oculares cuando las células son iluminadas por LEDs de la longitud de onda apropiada para la proteína de fusión LacI. Las señales débiles sólo pueden ser visibles con el uso de la cámara EMCCD, que permite la integración de la señal en el tiempo y por lo tanto amplifica eficazmente señales débiles. </li><li> En el software de control del microscopio, definir un z-pila de imágenes que se deben realizar en cada posición de fase guardado. Elija el tamaño de az paso de 0.35-0.50 m, que le permitirá a la aproximación de muestreo de Nyquist en la dimensión z 14. Incluir &quot;extra&quot; rebanadas por encima y por debajo de los planos en los que se encuentran las células; estas rebanadas de permitir la detección siguiendo movimientos de la célula durante el ciclo celular, y también se utilizan en el procesamiento posterior a la adquisición (deconvolución) de las pilas de imagen. Esta inclusión seresultar en una pila de 40-60 imágenes, dependiendo del grosor de las células. </li><li> En el software de control del microscopio, definir un experimento de series de tiempo para recoger una imagen de campo brillante de la z-pilas a intervalos de 30 min (para el seguimiento de las divisiones celulares y las migraciones más largos tiempos) y las imágenes de fluorescencia a intervalos de 10-60 min (para la visualización de plásmidos dentro de las células). No utilice imágenes DIC durante el experimento, ya que requiere más luz que las imágenes de campo claro estándar, que puede exponer a las células innecesariamente a la fototoxicidad en el curso de experimentos de largo. </li><li> Iniciar el experimento controlado por software. Asegúrese de que el sistema no está perturbado (golpeado, expuesto a la luz ambiente en exceso, etc) durante el experimento. </li><li> Si es necesario, reponer el agua en el sistema de humidificación durante el experimento. </li></ol> 4. Post-adquisición de Procesamiento de Imágenes <ol><li> Revisar las imágenes para cada punto z-pila y el tiempo. Recortar cualquier área que no necesite delas imágenes para reducir el tiempo de procesamiento informático en la siguiente etapa. </li><li> Utilizar un algoritmo de deconvolución para volver a asignar a la intensidad de la señal de píxel de origen en cada 15 z-pila. Si bien este deconvolución se puede basar en una función de dispersión de punto teórico para su sistema de imagen, es preferible medir la función de dispersión de punto de su sistema en particular por formación de imágenes microesferas fluorescentes, y el uso de esta medida en el algoritmo de deconvolución. Se midió la función de dispersión puntual de nuestro sistema de formación de imágenes y aplica a. Limitada algoritmo iterativo de máxima verosimilitud en AxioVision software (descripción AxioVision software, Zeiss) </li><li> Examine las imágenes para el seguimiento de los cambios de intensidad y los movimientos de los plásmidos durante el ciclo celular y la división de los plásmidos a las células hijas. </li></ol>

<ol><li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
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<li>Humme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EBV+nuclear+antigen+1+%28EBNA1%29+enhances+B+cell+immortalization+several+thousandfold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).</li>
<li>Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li>
<li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li>
<li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li>
<li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV%27s+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li>
<li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+Kaposi%27s+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li>
<li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome%3A+application+for+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método descrito aquí se puede utilizar para seguir los plásmidos en células de mamíferos vivos en el tiempo que abarca múltiples generaciones. Al limitar la exposición a la luz de excitación, hemos utilizado estas técnicas para seguir las células de parejas recién divididas a través de las colonias de 16-32 células, lo que representa por lo menos 72 horas y 3 divisiones celulares. Estos experimentos proporcionan información que no puede obtenerse a partir de ensayos estáticos, tales como PCR cuantitativa, transferenc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Higromicina </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> 400 g / ml para SLK; 300 g / ml para HeLa </td></tr><tr><td> Isopropil-bD-tiogalactósido (IPTG) </td><td> Roche </td><td> 10 724 815 001 </td><td> Concentración final 200 ug / ml </td></tr><tr&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Con fondo de cristal platos </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> Neutral LED blanco </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> Filtrar Cube 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Plan-Apochromat 63x/1.4 objetivo </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD cámara </td><td> Fotometría </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol mini- </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 digitales </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> Controlador digital de CTI 3700 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> Objetivo calentador </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Fase de calentamiento inserto P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> Stage-top Incubadora S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> Humidificador Sistema </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Pocos plásmidos de origen natural se mantienen en células de mamífero. Entre éstos están los genomas de gamma-herpesvirus, incluyendo el virus de Epstein-Barr (EBV) y el sarcoma de Kaposi asociado a herpesvirus (KSHV), que provocan múltiples malignidades humanas 1-3. Estos dos genomas se replican de manera autorizada, cada uno usando una sola proteína viral y maquinaria de replicación celular, y se pasan a las células hijas durante la división celular a pesar de que carecen de sus centrómeros tradicionales 4-8. Mucho trabajo se ha realizado para caracterizar las repeticiones de estos genomas plásmido utilizando métodos tales como Southern blot y la hibridación fluorescente in situ (FISH). Estos métodos están limitados, sin embargo. PCR cuantitativa y las transferencias de Southern proporcionar información sobre el número medio de plásmidos por célula en una población de células. La FISH es un ensayo de una sola célula que revela tanto el número medio y la distribución de plásmido<html> s por célula en la población de células, pero es estática, no permitiendo ninguna información sobre el padre o progenie de la célula examinada. Aquí se describe un método para visualizar los plásmidos en células vivas. Este método se basa en la unión de una proteína marcada con fluorescencia lactosa represor a múltiples sitios en el plásmido de interés 9. El DNA de interés está diseñada para incluir aproximadamente 250 repeticiones en tándem del operador lactosa (LACO) secuencia. Laco es unido específicamente por la proteína represora de la lactosa (LacI), que puede ser fusionada con una proteína fluorescente. La proteína de fusión puede expresarse a partir del plásmido de ingeniería o introducida por un vector retroviral. De esta manera, las moléculas de ADN están marcados fluorescentemente y por lo tanto se hacen visibles a través de microscopía de fluorescencia. La proteína de fusión se bloquea la unión de la ADN plasmídico por cultivo de células en presencia de IPTG hasta los plásmidos están listos para ser visto. ONTENIDO &quot;&gt; Este sistema permite que los plásmidos sea controlados en células vivas a través de varias generaciones, revelando propiedades de su síntesis y la partición a las células hijas. células ideales son adherente, fácilmente transfectadas, y tienen núcleos grandes. Esta técnica se ha utilizado para determinar que 84% de EBV derivados de plásmidos se sintetizan cada generación y 88% de la partición recién sintetizado plásmidos fielmente a las células hijas en células HeLa. pares de estos plásmidos EBV se observaron a ser atados o asociado a las cromátidas hermanas después de su síntesis en S- fase hasta que se observaron para separar como las cromátidas hermanas en la anafase separados 10. El método se está utilizando actualmente para estudiar la replicación de los genomas HVSK en células HeLa y células SLK. células HeLa se inmortalizan las células epiteliales humanas, y las células inmortalizadas se SLK endoteliales humanas las células. Aunque las células SLK se derivaron originalmente de una lesión KSHV, ni la línea HeLa ni SLK celular naturalmente harbors HVSK genomas 11. Además de estudiar la replicación viral, esta técnica de visualización se puede utilizar para investigar los efectos de la adición, eliminación o mutación de los diversos elementos de secuencia de ADN en la síntesis, la localización, y la partición de otros ADN de los plásmidos recombinantes.

<html> Proyecciones de máxima intensidad de z-pilas adquiridas en un experimento representativo se muestra en la Figura 3. Típicas señales plásmido están presentes en 3-8 rebanadas de la Z-Stack, dependiendo de si representan única o grupo de plásmidos. En el caso de EBV y KSHV plásmidos derivados, las señales se mueven lentamente dentro de la célula hasta que la célula alcanza la mitosis. Las células se migran durante el transcurso del experimento. También se vuelven esféricos y desprenden de la placa d...

Un método de observación de moléculas individuales de ADN en células vivas se describe. La técnica se basa en la unión de una proteína marcada con fluorescencia represor lac a sitios de unión ingeniería genética en el ADN de interés. Este método puede ser adaptado para seguir muchos ADNs recombinantes en células vivas en el tiempo.

Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

Pocos plásmidos naturales se mantienen en células mamíferas. Entre estos se encuentran los genomas de los gammaherpesvirus, incluido el virus de Epstein-Barr (EBV)...

El objetivo general de este procedimiento es observar la partición de genomas virales en células en división. Esto se logra primero mediante la construcción de un plásmido que pueda visualizarse mediante microscopía de fluorescencia. Aquí, un plásmido se modifica genéticamente para incluir repeticiones en tándem de la secuencia operadora de lactosa o LAC O. El segundo paso consiste en introducir el plásmido en células en división, seguido de la infección de las células con un retrovirus que codifica el represor de lactosa o lac eye fusionado a una proteína fluorescente.Las proteínas de fusión del represor de lactosa se unirán específicamente a las secuencias del operador de lactosa en el plásmido sub. Las células se monitorean mediante microscopía de fluorescencia para rastrear plásmidos individuales a través de múltiples ciclos celulares. Finalmente, las imágenes obtenidas se procesan para determinar cómo se mantienen los genomas virales en células en división.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la PCR cuantitativa, el Southern blot o la hibridación fluorescente in situ, es que permite observar plásmidos individuales en múltiples puntos en el tiempo. Para permitir la visualización del plásmido mediante microscopía de fluorescencia, se utilizan técnicas estándar de clonación molecular para introducir un fragmento de ADN que contiene aproximadamente 250 copias de la secuencia operadora de la lactosa, o LAC O, en el plásmido. En este ejemplo, el plásmido es un cósmido de aproximadamente 170 pares de kilobases que contiene todo el genoma del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, o KSHV, y codifica resistencia a la higromicina.Introduzca el plásmido LAC O que contiene ADN plasmídico en células mamíferas HeLa y SLK mediante transfección en placas de 60 milímetros, incubando las células con 10 microgramos de plásmido purificado, ADN, 25 microlitros de lipofectamina, 2000 0,5 mililitros de Opti-MEM y 3,5 mililitros de DMEM durante cuatro horas. Cambie el medio a DMEM con 10% de suero bovino fetal y permita que las células se recuperen durante 48 horas.A continuación, siembre las células transfectadas a baja densidad en placas grandes y cultívelas durante tres semanas en DMEM con 10% de suero bovino fetal y 300 microgramos por mililitro de higromicina para seleccionar el plásmido introducido. Utilice trozos estériles de tiras y papel de filtro empapado para transferir las colonias resistentes a higromicina a nuevas placas de cultivo. Coloque las placas en el incubador después de una a dos semanas, cuando los clones transfectados hayan crecido hasta llenar la placa. Aísle el ADN para digestión con enzimas de restricción y transferencia Southern a fin de verificar que el polímero del plásmido LAC O sea homogéneo y del tamaño esperado. Esta transferencia de ejemplo muestra que el polímero LAC O en el clon uno es homogéneo e idéntico al del control positivo.En la banda siete, si el plásmido no ha sido diseñado para expresar una fusión del represor de la lactosa lac eye, infecte los clones adecuados con un retrovirus que codifique lac eye fusionado a una proteína fluorescente roja, como lac eye, TD tomate. Se elige TD tomate en lugar de proteínas que fluorescen más cerca del verde para minimizar la fototoxicidad que ocurriría por múltiples exposiciones durante largos períodos. Una vez introducida la proteína de fusión LAC eye, cultive las células en presencia de 200 microgramos por mililitro de IPTG para impedir que las proteínas de fusión se unan al ADN. Uno de los aspectos más críticos de este procedimiento es obtener clones con la intensidad de fluorescencia adecuada.Se debe analizar un gran número de clones para identificar aquellos con niveles óptimos de fluorescencia. Cultive las células durante al menos tres días para permitir la expresión de la proteína LAC eye TD tomato. Seleccione clones con niveles óptimos de LAC eye, TD tomato que muestren señales definidas con niveles mínimos de fondo de la proteína de fusión no ligada. De 24 a 48 horas antes de la adquisición de imágenes, siembre las células que expresan LAC I TD tomato en un platillo de fondo de vidrio de 35 milímetros a una densidad inferior al 10 % de confluencia. Esto permitirá que pares de células se dividan en colonias de ocho a 16 células sin solaparse, una a tres horas antes del inicio de la adquisición de imágenes.Lave la placa tres veces con medio de cultivo que carezca tanto de fármacos selectivos como de IPTG. Esto elimina las células no viables y permite que las proteínas de fusión lac eye se unan a las células LAC en los plásmidos. Reemplace el medio de cultivo con dos mililitros de DMEM con 10% de suero bovino fetal y 25 milimolar de Hippies, incube durante una a tres horas justo antes de la obtención de imágenes, y reemplace la tapa del recipiente de cultivo por una lámina de cultivo estirada en un anillo de sujeción para una placa de 35 milímetros.Esta cubierta inhibirá la evaporación del medio de cultivo, lo cual aumentaría la concentración de sales con el tiempo y mataría las células. El sistema de imagen utilizado en este experimento consiste en un microscopio invertido Zeiss Axio 200 M, equipado con una platina motorizada y una cámara EM CCD para la detección sensible de señales. La luz de excitación fluorescente es proporcionada por el LED blanco neutro de un sistema Collibra.El sistema de imagen está controlado por un software para la adquisición automatizada de imágenes durante intervalos prolongados con múltiples series de Z. Se utiliza un incubador montado sobre la platina para mantener las células a 37 grados Celsius, con un 5 a 10 % de dióxido de carbono en una cámara humedecida. Utilice un collar calefactorio para el objetivo de inmersión en aceite con el fin de evitar que el objetivo aspire el aceite.El calor proveniente de la muestra permite tiempo suficiente para que el sistema alcance una temperatura estable. Para minimizar los artefactos por movimiento durante el experimento, el sistema de imagen debe colocarse sobre una mesa antivibratoria para aislarse de las vibraciones. Para comenzar el procedimiento de visualización del ADN marcado, utilice la imagen DIC para observar las células y determinar el plano focal de la parte superior e inferior de las células en múltiples campos de visión; en cada campo, muévase a un plano focal aproximadamente un tercio hacia abajo desde la parte superior de la célula, y guarde las coordenadas x, y, z en la lista de posiciones guardadas de la platina.Cada una de estas posiciones guardadas será el centro de un Zack de imágenes para capturar la célula en el software de control del microscopio; defina un Zack de imágenes que se realizará en cada posición guardada del portaobjetos, defina suficientes cortes para que toda la célula sea capturada junto con cortes adicionales por encima y por debajo de los planos en los que se encuentran las células. Elija un tamaño de paso Z de 0,35 a 0,50 micrómetros para permitir un muestreo aproximado de Nyquist en la dimensión Z. Estos cortes permiten la detección posterior de los movimientos celulares durante el ciclo celular y también se utilizan en el procesamiento posterior a la adquisición de las pilas de imágenes.Esto dará lugar a una serie de 40 a 60 imágenes, dependiendo del grosor de las células. Defina un experimento de series temporales para obtener una imagen de campo brillante de los Zacks a intervalos de 30 minutos e imágenes de fluorescencia a intervalos de 10 a 60 minutos. No utilice la imagen con contraste de interferencia diferencial (DIC) durante el experimento, ya que requiere más luz que la imagen estándar de campo brillante, lo cual puede exponer innecesariamente a las células a fototoxicidad durante experimentos prolongados.Inicie el experimento controlado por software. Asegúrese de que el sistema no se vea perturbado de ninguna manera durante el experimento. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes para el experimento, revise las imágenes para cada Zack y punto de tiempo, y recorte las áreas innecesarias de las imágenes para reducir el tiempo de procesamiento del ordenador.En el siguiente paso, reasigne la intensidad de la señal al píxel de origen en cada pila Z. Utilice un algoritmo de desconvolución en el software Axio Vision basado en la función de dispersión puntual medida del sistema de formación de imágenes. Aquí se muestra el resultado de la desconvolución.Examine las imágenes para rastrear los cambios de intensidad y los movimientos de los plásmidos durante el ciclo celular y la distribución de los plásmidos hacia las células hijas. Estas imágenes, que se generan computacionalmente para incluir múltiples planos Z en los que residen las diferentes señales, muestran que los núcleos de las células HELOC que expresan LAC eye TD tomato son fluorescentes debido a la señal de localización nuclear presente en la proteína de fusión, lo que la dirige al núcleo. En ausencia de I-P-T-G-K-S-H-V, los genomas que codifican las secuencias LAC O reclutan muchas copias de la proteína fluorescente y se destacan como señales brillantes sobre la intensidad de fondo del núcleo.En contraste, en presencia de IPTG, se impide que las proteínas fluorescentes del ojo LAC se unan a su secuencia reconocida lack O, y las proyecciones de intensidad máxima de Zack adquiridas de una célula durante el ciclo celular en cinco puntos temporales se muestran en esta figura. Los genomas virales marcados con fluorescencia en la célula, visibles en el panel A, se sintetizan como se muestra en el panel B. Posteriormente, los genomas virales se reparten hacia las células hijas durante la división celular, tal como se observa en los paneles C, D y E. El ciclo celular de células HELOC sanas dura aproximadamente 24 horas, y las células hijas generalmente se adhieren cerca una de otra y continúan dividiéndose al mismo tiempo en el siguiente ciclo celular.Mediante este protocolo, se puede seguir la evolución de los genomas virales en la célula durante múltiples generaciones mientras se lleva a cabo este procedimiento. Es importante recordar observar la morfología celular en el tiempo de generación para asegurar que las células se mantengan sanas durante todo el experimento.

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Investigación

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Biología

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Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal

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