Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es observar la partición de los genomas virales en las células en división. Esto se logra haciendo primero un plásmido que se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia. Aquí, un plásmido se diseña para incluir repeticiones en tándem de la secuencia operadora de lactosa o LAC O. El segundo paso es introducir el plásmido en las células en división, seguido de la infección de las células con un retrovirus que codifica el represor de lactosa o el ojo lac fusionado con una proteína fluorescente.

Las proteínas de fusión represoras de lactosa se unirán específicamente a las secuencias operadoras de lactosa en el plásmido sub. Las células se monitorean mediante microscopía de fluorescencia para rastrear plásmidos individuales a través de múltiples ciclos celulares. En última instancia, las imágenes adquiridas se procesan para determinar cómo se mantienen los genomas virales en las células en división.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la PCR cuantitativa, el Southern blot o la hibridación fluorescente in situ, es que esta técnica permite observar plásmidos individuales en múltiples puntos en el tiempo. Para permitir la visualización del plásmido mediante microscopía de fluorescencia, se utilizan técnicas estándar de clonación molecular para introducir un fragmento de ADN que contiene aproximadamente 250 copias de la secuencia operadora de lactosa o LAC O en el plásmido. En este ejemplo, el plásmido es un medio trasero de aproximadamente 170 pares de kilobases que contiene el genoma completo del virus del herpes asociado al sarcoma de CAP o KSHV y codifica la resistencia a la higromicina.

Introducir el ADN plasmídico que contiene LAC O en células de mamíferos hela y SLK por transfección En placas de 60 milímetros, incubar células con plásmido purificado de 10 microgramos, ADN de 25 microlitros, lipectomía, 2000 0,5 mililitros, Optum y 3,5 mililitros. DMEM durante cuatro horas. Cambie el medio a DMEM con un 10% de suero bovino fetal y permita que las células se recuperen durante 48 horas.

Posteriormente, se colocaron las células transfectadas a baja densidad en placas grandes y se cultivaron durante tres semanas en DMEM con un 10% de suero fetal bovino y 300 microgramos por mililitro de higromicina para seleccionar el plásmido introducido, se utilizaron trozos de trips estériles y papel de filtro empapado para transferir las colonias resistentes a la higromicina a nuevas placas de cultivo. Coloque las placas en la incubadora después de una o dos semanas, cuando los clones transfectados hayan crecido para llenar la placa, aislar el ADN para la digestión de restricción y la transferencia del sur para garantizar que el polímero del plásmido LAC O sea homogéneo y del tamaño esperado. Este ejemplo de transferencia muestra que el polímero LAC O en el clon uno es homogéneo e idéntico al del control positivo.

En el carril siete, si el plásmido no ha sido diseñado para expresar una fusión del represor de lactosa lac eye infecte clones adecuados con un retrovirus que codifica lac eye fusionado con una proteína fluorescente roja como lac eye, tomate TD, se elige tomate TD en lugar de proteínas que emiten fluorescencia más cerca del verde para minimizar la fototoxicidad que se produciría por exposiciones múltiples durante largos períodos. Una vez que se introduce la proteína de fusión ocular LAC, cultiva, las células en presencia de 200 microgramos por mililitro IPTG para bloquear las proteínas de fusión de la unión al ADN. Uno de los aspectos más críticos de este procedimiento es la obtención de clones con la intensidad de fluorescencia adecuada.

Se debe examinar un gran número de clones para identificar aquellos con un cultivo de fluorescencia óptimo. Las células durante al menos tres días para permitir la expresión de la proteína de tomate TD del ojo LAC seleccionan clones para aquellos con niveles óptimos de lac eye, tomate TD que revelan señales distintas con niveles mínimos de fondo de proteína de fusión no unida, 24 a 48 horas antes de la obtención de imágenes de las células que expresan tomate LAC I TD las colocan en un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros a una densidad de menos del 10% de confluencia. Esto permitirá que los pares de células se dividan en colonias de ocho a 16 células sin superponerse de una a tres horas antes del inicio de las imágenes.

Enjuague la placa tres veces con medio de cultivo que carezca de fármacos selectivos e IPTG. Esto elimina las células no viables y permite que las proteínas de fusión del ojo lac se unan a los citos LAC en los plásmidos. Reemplace el medio de cultivo con dos mililitros, DMEM con 10% de suero bovino fetal y 25 milimolares Los hippies incuban de una a tres horas justo antes de la obtención de imágenes, reemplace la parte superior de la placa de cultivo con papel de culto estirado en un anillo de montaje para una placa de 35 milímetros.

Esta cubierta inhibirá la evaporación del medio de cultivo, lo que aumentaría la concentración de sal con el tiempo y mataría las células. El sistema de imagen utilizado en este experimento consiste en un microscopio invertido Zeiss Axio 200 M, equipado con una platina motorizada y una cámara EM CCD para la detección sensible de señales. La luz de excitación fluorescente es proporcionada por el LED blanco neutro de un sistema Collibra.

El sistema de imágenes está controlado por un software para adquisiciones automatizadas de imágenes a intervalos largos con múltiples pilas Z. Se utiliza una incubadora superior de etapa para mantener las células a 37 grados centígrados, entre un 5 y un 10% de dióxido de carbono en una cámara humidificada. Utilice un collar calentado para el objetivo de aceite para evitar que el objetivo se desvíe.

El calor de la muestra permite tiempo suficiente para que el sistema alcance una temperatura estable. Para minimizar los artefactos de movimiento durante el experimento, el sistema de imágenes debe colocarse sobre una mesa de aire para estar aislado de las vibraciones. Para comenzar el procedimiento para visualizar el ADN marcado, use imágenes DIC para ver las células y determinar el plano focal de la parte superior e inferior de las células en múltiples campos de visión en cada campo, muévase a un plano focal aproximadamente a un tercio del camino hacia abajo desde la parte superior de la celda, guarde la x, y, coordenadas Z en la lista de posiciones de escenario guardadas.

Cada una de estas posiciones guardadas será el centro de un Zack de imágenes para capturar la célula en el software de control del microscopio, defina un Zack de imágenes que se realizarán en cada posición de etapa guardada, defina suficientes cortes para que se capture toda la celda junto con cortes adicionales por encima y por debajo de los planos en los que se encuentran las celdas. Elija un tamaño de paso Z de 0,35 a 0,50 micras para permitir un muestreo de Nyquist aproximado en la dimensión Z. Estos cortes permiten la detección siguiendo los movimientos de las células durante el ciclo celular y también se utilizan en el procesamiento posterior a la adquisición de las pilas de imágenes.

Esto dará como resultado una pila de 40 a 60 imágenes, dependiendo del grosor de las celdas. Defina un experimento de serie temporal para recopilar una imagen de campo claro de los Zacks a intervalos de 30 minutos e imágenes de fluorescencia a intervalos de 10 a 60 minutos. No utilice imágenes DIC durante el experimento, ya que requieren más luz que las imágenes estándar de campo claro, lo que puede exponer a las células innecesariamente a la fototoxicidad en el transcurso de experimentos largos.

Inicie el experimento controlado por software. Asegúrese de que el sistema no se altere de ninguna manera durante el experimento. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes para el experimento, revise las imágenes de cada Zack y punto de tiempo, recorte las áreas innecesarias de las imágenes para reducir el tiempo de procesamiento de la computadora.

En el siguiente paso para reasignar la intensidad de la señal al píxel de origen en cada pila Z. Utilice un algoritmo de deconvolución en el software de visión Axio basado en la función de dispersión de puntos medidos del sistema de imágenes. Aquí se muestra el resultado de la deconvolución.

Examine las imágenes para realizar un seguimiento de la intensidad, los cambios y los movimientos de los plásmidos durante el ciclo celular y la partición de los plásmidos en células hijas. Estas imágenes, que se realizan computacionalmente para incluir múltiples planos Z en los que residen las diferentes señales, muestran que los núcleos de las células HELOC que expresan tomate TD ojo LAC son fluorescentes debido a la señal de localización nuclear en la proteína de fusión, localizándola en el núcleo. En ausencia de I-P-T-G-K-S-H-V, los genomas que codifican las secuencias de LAC O reclutan muchas copias de la proteína fluorescente y se destacan como señales brillantes sobre la intensidad de fondo del núcleo.

Por el contrario, en presencia de IPTG, se impide que las proteínas fluorescentes del ojo LAC se unan a su secuencia de reconocimiento de la falta de O, las proyecciones de máxima intensidad de Zack adquiridas de un ciclo celular a cinco veces. En esta figura se muestran los puntos de un experimento representativo. Los genomas virales marcados con fluorescencia en la célula visible en el panel A se sintetizan en el panel B. Luego, los genomas virales se dividen en células hijas durante la división celular, como se observa en los paneles C, D y E. El ciclo celular para las células HELOC sanas dura aproximadamente 24 horas, y las células hijas generalmente se adhieren entre sí y se dividen al mismo tiempo en el siguiente ciclo celular.

Con este protocolo, se pueden seguir los genomas virales de la célula durante varias generaciones mientras se intenta este procedimiento. Es importante recordar observar la morfología de las células en el tiempo de generación para asegurarse de que las células estén sanas durante todo el experimento.