Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es observar la partición de genomas virales en células en división. Esto se logra primero mediante la construcción de un plásmido que pueda visualizarse mediante microscopía de fluorescencia. Aquí, un plásmido se modifica genéticamente para incluir repeticiones en tándem de la secuencia operadora de lactosa o LAC O. El segundo paso consiste en introducir el plásmido en células en división, seguido de la infección de las células con un retrovirus que codifica el represor de lactosa o lac eye fusionado a una proteína fluorescente.

Las proteínas de fusión del represor de lactosa se unirán específicamente a las secuencias del operador de lactosa en el plásmido sub. Las células se monitorean mediante microscopía de fluorescencia para rastrear plásmidos individuales a través de múltiples ciclos celulares. Finalmente, las imágenes obtenidas se procesan para determinar cómo se mantienen los genomas virales en células en división.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la PCR cuantitativa, el Southern blot o la hibridación fluorescente in situ, es que permite observar plásmidos individuales en múltiples puntos en el tiempo. Para permitir la visualización del plásmido mediante microscopía de fluorescencia, se utilizan técnicas estándar de clonación molecular para introducir un fragmento de ADN que contiene aproximadamente 250 copias de la secuencia operadora de la lactosa, o LAC O, en el plásmido. En este ejemplo, el plásmido es un cósmido de aproximadamente 170 pares de kilobases que contiene todo el genoma del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, o KSHV, y codifica resistencia a la higromicina.

Introduzca el plásmido LAC O que contiene ADN plasmídico en células mamíferas HeLa y SLK mediante transfección en placas de 60 milímetros, incubando las células con 10 microgramos de plásmido purificado, ADN, 25 microlitros de lipofectamina, 2000 0,5 mililitros de Opti-MEM y 3,5 mililitros de DMEM durante cuatro horas. Cambie el medio a DMEM con 10% de suero bovino fetal y permita que las células se recuperen durante 48 horas.

A continuación, siembre las células transfectadas a baja densidad en placas grandes y cultívelas durante tres semanas en DMEM con 10% de suero bovino fetal y 300 microgramos por mililitro de higromicina para seleccionar el plásmido introducido. Utilice trozos estériles de tiras y papel de filtro empapado para transferir las colonias resistentes a higromicina a nuevas placas de cultivo. Coloque las placas en el incubador después de una a dos semanas, cuando los clones transfectados hayan crecido hasta llenar la placa. Aísle el ADN para digestión con enzimas de restricción y transferencia Southern a fin de verificar que el polímero del plásmido LAC O sea homogéneo y del tamaño esperado. Esta transferencia de ejemplo muestra que el polímero LAC O en el clon uno es homogéneo e idéntico al del control positivo.

En la banda siete, si el plásmido no ha sido diseñado para expresar una fusión del represor de la lactosa lac eye, infecte los clones adecuados con un retrovirus que codifique lac eye fusionado a una proteína fluorescente roja, como lac eye, TD tomate. Se elige TD tomate en lugar de proteínas que fluorescen más cerca del verde para minimizar la fototoxicidad que ocurriría por múltiples exposiciones durante largos períodos. Una vez introducida la proteína de fusión LAC eye, cultive las células en presencia de 200 microgramos por mililitro de IPTG para impedir que las proteínas de fusión se unan al ADN. Uno de los aspectos más críticos de este procedimiento es obtener clones con la intensidad de fluorescencia adecuada.

Se debe analizar un gran número de clones para identificar aquellos con niveles óptimos de fluorescencia. Cultive las células durante al menos tres días para permitir la expresión de la proteína LAC eye TD tomato. Seleccione clones con niveles óptimos de LAC eye, TD tomato que muestren señales definidas con niveles mínimos de fondo de la proteína de fusión no ligada. De 24 a 48 horas antes de la adquisición de imágenes, siembre las células que expresan LAC I TD tomato en un platillo de fondo de vidrio de 35 milímetros a una densidad inferior al 10 % de confluencia. Esto permitirá que pares de células se dividan en colonias de ocho a 16 células sin solaparse, una a tres horas antes del inicio de la adquisición de imágenes.

Lave la placa tres veces con medio de cultivo que carezca tanto de fármacos selectivos como de IPTG. Esto elimina las células no viables y permite que las proteínas de fusión lac eye se unan a las células LAC en los plásmidos. Reemplace el medio de cultivo con dos mililitros de DMEM con 10% de suero bovino fetal y 25 milimolar de Hippies, incube durante una a tres horas justo antes de la obtención de imágenes, y reemplace la tapa del recipiente de cultivo por una lámina de cultivo estirada en un anillo de sujeción para una placa de 35 milímetros.

Esta cubierta inhibirá la evaporación del medio de cultivo, lo cual aumentaría la concentración de sales con el tiempo y mataría las células. El sistema de imagen utilizado en este experimento consiste en un microscopio invertido Zeiss Axio 200 M, equipado con una platina motorizada y una cámara EM CCD para la detección sensible de señales. La luz de excitación fluorescente es proporcionada por el LED blanco neutro de un sistema Collibra.

El sistema de imagen está controlado por un software para la adquisición automatizada de imágenes durante intervalos prolongados con múltiples series de Z. Se utiliza un incubador montado sobre la platina para mantener las células a 37 grados Celsius, con un 5 a 10 % de dióxido de carbono en una cámara humedecida. Utilice un collar calefactorio para el objetivo de inmersión en aceite con el fin de evitar que el objetivo aspire el aceite.

El calor proveniente de la muestra permite tiempo suficiente para que el sistema alcance una temperatura estable. Para minimizar los artefactos por movimiento durante el experimento, el sistema de imagen debe colocarse sobre una mesa antivibratoria para aislarse de las vibraciones. Para comenzar el procedimiento de visualización del ADN marcado, utilice la imagen DIC para observar las células y determinar el plano focal de la parte superior e inferior de las células en múltiples campos de visión; en cada campo, muévase a un plano focal aproximadamente un tercio hacia abajo desde la parte superior de la célula, y guarde las coordenadas x, y, z en la lista de posiciones guardadas de la platina.

Cada una de estas posiciones guardadas será el centro de un Zack de imágenes para capturar la célula en el software de control del microscopio; defina un Zack de imágenes que se realizará en cada posición guardada del portaobjetos, defina suficientes cortes para que toda la célula sea capturada junto con cortes adicionales por encima y por debajo de los planos en los que se encuentran las células. Elija un tamaño de paso Z de 0,35 a 0,50 micrómetros para permitir un muestreo aproximado de Nyquist en la dimensión Z. Estos cortes permiten la detección posterior de los movimientos celulares durante el ciclo celular y también se utilizan en el procesamiento posterior a la adquisición de las pilas de imágenes.

Esto dará lugar a una serie de 40 a 60 imágenes, dependiendo del grosor de las células. Defina un experimento de series temporales para obtener una imagen de campo brillante de los Zacks a intervalos de 30 minutos e imágenes de fluorescencia a intervalos de 10 a 60 minutos. No utilice la imagen con contraste de interferencia diferencial (DIC) durante el experimento, ya que requiere más luz que la imagen estándar de campo brillante, lo cual puede exponer innecesariamente a las células a fototoxicidad durante experimentos prolongados.

Inicie el experimento controlado por software. Asegúrese de que el sistema no se vea perturbado de ninguna manera durante el experimento. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes para el experimento, revise las imágenes para cada Zack y punto de tiempo, y recorte las áreas innecesarias de las imágenes para reducir el tiempo de procesamiento del ordenador.

En el siguiente paso, reasigne la intensidad de la señal al píxel de origen en cada pila Z. Utilice un algoritmo de desconvolución en el software Axio Vision basado en la función de dispersión puntual medida del sistema de formación de imágenes. Aquí se muestra el resultado de la desconvolución.

Examine las imágenes para rastrear los cambios de intensidad y los movimientos de los plásmidos durante el ciclo celular y la distribución de los plásmidos hacia las células hijas. Estas imágenes, que se generan computacionalmente para incluir múltiples planos Z en los que residen las diferentes señales, muestran que los núcleos de las células HELOC que expresan LAC eye TD tomato son fluorescentes debido a la señal de localización nuclear presente en la proteína de fusión, lo que la dirige al núcleo. En ausencia de I-P-T-G-K-S-H-V, los genomas que codifican las secuencias LAC O reclutan muchas copias de la proteína fluorescente y se destacan como señales brillantes sobre la intensidad de fondo del núcleo.

En contraste, en presencia de IPTG, se impide que las proteínas fluorescentes del ojo LAC se unan a su secuencia reconocida lack O, y las proyecciones de intensidad máxima de Zack adquiridas de una célula durante el ciclo celular en cinco puntos temporales se muestran en esta figura. Los genomas virales marcados con fluorescencia en la célula, visibles en el panel A, se sintetizan como se muestra en el panel B. Posteriormente, los genomas virales se reparten hacia las células hijas durante la división celular, tal como se observa en los paneles C, D y E. El ciclo celular de células HELOC sanas dura aproximadamente 24 horas, y las células hijas generalmente se adhieren cerca una de otra y continúan dividiéndose al mismo tiempo en el siguiente ciclo celular.

Mediante este protocolo, se puede seguir la evolución de los genomas virales en la célula durante múltiples generaciones mientras se lleva a cabo este procedimiento. Es importante recordar observar la morfología celular en el tiempo de generación para asegurar que las células se mantengan sanas durante todo el experimento.