Un protocolo simple para el agrupamiento de plaquetas mediada por Plasmodium falciparum por el VIH en un recurso pobre ajuste

Este procedimiento ofrece algunas pautas estandarizadas para realizar ensayos de aglomeración mediada por plaquetas de aislados clínicos o de laboratorio de plasmodium false parem. Primero, recolectar sangre de un paciente infectado y recolectar eritrocitos parasitados por centrifugación, luego cultivar y purificar las etapas maduras asexuales. A continuación, se recoge sangre de un donante sano para preparar y estandarizar el plasma rico en plaquetas mediante centrifugación.

Combine las plaquetas y los eritrocitos parasitados para el ensayo de aglomeración. Los resultados de la microscopía de inmunofluorescencia pueden mostrar grupos de P Fal sperum mediados por plaquetas. Esta técnica está diseñada específicamente para medir el fenotipo aglomerante de plasmodium sra.Clinical

aisladas en un entorno de escasos recursos. Se ha informado que las variaciones mínimas en los procedimientos han aumentado la influencia en el resultado de la aglomeración de ácido en el campo. Por lo tanto, se necesitaba un protocolo claro y fácil de seguir, adaptado a entornos de bajos recursos, para estandarizarlo en los sitios de campo endémicos de malaria. En un citrato de sodio, vacutainer recolecta aproximadamente cinco mililitros de sangre completa de un huésped previo a la malaria o 2,5 mililitros de sangre de pacientes con malaria CM o SM.

Centrifugar la sangre entera a 250 Gs durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera con cuidado el sobrenadante turbio a un tubo limpio de 15 mililitros. Recuerde que las plaquetas se activan fácilmente por la temperatura, las variaciones y los choques físicos.

Enumere la suspensión de PRP utilizando el molesto hemocitómetro de Bower y ajústelo a la concentración deseada con PBS para obtener un pellet de plasma pobre en plaquetas, la mayoría de las plaquetas de una porción de la fracción de PRP por centrifugación a 1500 GS durante 10 minutos. Almacene las fracciones de PRP y PPP a cuatro grados centígrados durante un máximo de ocho a 10 días. Lo ideal es utilizar plaquetas frescas para el ensayo de aglomeración.

Lave los glóbulos rojos periféricos granulados tres veces con cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 en un matraz de cultivo Supplement PRBC con cultivo estándar de malaria, glóbulos rojos medianos y frescos no infectados para lograr un hematocrito del 5%. Impregne los matraces de cultivo con una mezcla de 92,5% de nitrógeno, 2,5% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. A continuación, selle y cultive los parásitos maduros de las pbc del paciente.

Incubar el matraz de cultivo durante 24 a 36 horas en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Coloque aproximadamente de 10 a 15 microlitros de sangre en un extremo de un portaobjetos de vidrio esmerilado que descansa sobre una superficie plana. Toque la gota de sangre con el borde de un segundo portaobjetos hasta que la sangre se distribuya uniformemente por el borde del segundo portaobjetos mientras sostiene el segundo portaobjetos en un ángulo de 45 grados.

Rápida pero suavemente, sin ejercer demasiada presión en el primer portaobjetos, distribuya uniformemente la sangre por el primer portaobjetos. Luego seque al aire la película delgada de sangre, deshidrate el área de la muestra con metanol durante 10 segundos. A continuación, seque al aire, sumerja la muestra con un 2% de keem.

Sostén durante al menos 10 minutos. Enjuague abundantemente hasta que el agua salga clara y se seque al aire. Examine las muestras bajo una lente de emulsión de aceite de 100 x en un microscopio óptico.

A continuación, purifique y sincronice el parum PFS maduro, PRBC como se describe en el protocolo de texto. Todos transfieren el cultivo a un tubo limpio y estéril de 15 mililitros. Granular las células por centrifugación a temperatura ambiente a 370 GS durante cinco minutos.

Ahora aspire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, vuelva a suspender las células de tal manera que la mitad del volumen total sea gelatina fusionada. Un tercio de la segunda mitad es medio libre de proteínas y dos tercios de la segunda mitad son pbcs.

Transfiera la suspensión a un tubo estéril de 15 mililitros e incube durante 15 a 20 minutos en una incubadora a 37 grados centígrados hasta que se forme una demarcación clara entre los niveles superior e inferior. Transfiera con cuidado la capa superior a un tubo estéril fresco de 15 mililitros y agregue 10 mililitros de centrífuga RPMI fresca a 370 a 430 GS durante cinco minutos. A continuación, deseche con cuidado el sobrenadante.

Ahora evalúe el parsit y la etapa de desarrollo mediante un frotis de sangre delgada y examínelo bajo un microscopio óptico como se describió anteriormente. Ajuste la suspensión de P RBC obtenida después de la flotación en gel de plasma a una vez 10 a la octava P RBC por microlitro en un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Suspendemos pbcs al 5%, hematocrito, naranja de aine o bromuro de aterio a 20 microgramos por mililitro, concentración final y PRP al 10% del volumen total.

Del mismo modo, prepare los siguientes controles de glóbulos rojos no infectados y PRP y PRBC con PPP para determinar el papel de las plaquetas en la aglomeración de las PBC. Ahora transfiera la suspensión a un frasco de dos mililitros con tapón de rosca. Coloque el vial bajo agitación suave rodando a 10 a 12 RRP a temperatura ambiente, muestreando a intervalos de 15 a 20 minutos durante un total de 120 minutos para verificar la formación de grumos.

Pipetear 10 microlitros de la muestra en un portaobjetos de vidrio y cubrir con un portaobjetos de vidrio para examinarlo bajo fluorescencia, Un grupo se considera como un agregado de tres o más eritrocitos infectados. En este experimento se analizaron aproximadamente el 70% de las etapas maduras de p FALs parem después del enriquecimiento por flotación en gel de plasma, los grumos se detectan fácilmente bajo el microscopio como bajo luz normal. Aparecen como agregados celulares y bajo fluorescencia como manchas verdes o rojas.

Cuando se tiñe con acro y bromuro de naranja o aterio muere respectivamente. El tamaño del grupo aumenta significativamente a un promedio de más de 15 pbcs por grupo después de la incubación durante 120 minutos, con algunos grupos que contienen numerosos pbcs por grupo que no se pudieron contar visualmente. La frecuencia del fenotipo de aglomeración se calcula como el número de células infectadas presentes en aglomeraciones por cada 1000 células infectadas contadas en ensayos duplicados.

Después de ver este video, ahora debería tener una comprensión clara de cómo realizar un ensayo de aglomeración mediada por plaquetas por plasmodium falciparum. Tenga cuidado de no activar las plaquetas con movimientos bruscos y variaciones de temperatura. Este ensayo también se puede aplicar para medir el ensayo de aglomeración mediada por plaquetas en el paludismo grave.