Un protocolo simple para el agrupamiento de plaquetas mediada por Plasmodium falciparum por el VIH en un recurso pobre ajuste

Este procedimiento ofrece algunas pautas estandarizadas para realizar ensayos de agregación mediados por plaquetas de aislamientos clínicos o de laboratorio de Plasmodium falsa parem. Primero, recolecte sangre de un paciente infectado y obtenga eritrocitos parasitados mediante centrifugación, luego cultive y purifique las etapas asexuales maduras. A continuación, recolecte sangre de un donante sano con el fin de preparar y estandarizar el plasma rico en plaquetas mediante centrifugación.

Combine las plaquetas y los eritrocitos parasitados para el ensayo de agregación. Los resultados de la microscopía de inmunofluorescencia pueden mostrar agregados de P. falciparum mediados por plaquetas. Esta técnica está diseñada específicamente para medir el fenotipo de agregación de Plasmodium sra.

Aislados clínicos en un entorno con recursos limitados. Se ha informado que variaciones mínimas en los procedimientos pueden aumentar la influencia en el resultado del ácido coagulante en el campo. Por lo tanto, se necesitaba un protocolo claro y fácil de seguir, adaptado a entornos con bajos recursos, para estandarizar los procedimientos en sitios de campo endémicos para malaria. En un vacutainer con citrato de sodio, recolecte aproximadamente cinco mililitros de sangre total de un huésped naïve a malaria o 2,5 mililitros de sangre de pacientes con malaria CM o SM.

Centrifugar la sangre completa a 250 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, transferir cuidadosamente el sobrenadante turbio a un tubo limpio de 15 mililitros. Tenga en cuenta que las plaquetas se activan fácilmente por cambios de temperatura, variaciones y choques físicos.

Enumerar la suspensión de PRP utilizando una cámara de Neubauer, un citómetro hemático, y ajustar a la concentración deseada con PBS para obtener un pellet de plasma pobre en plaquetas; la mayoría de las plaquetas se obtienen a partir de una fracción de PRP mediante centrifugación a 1500 ×g durante 10 minutos. Almacenar las fracciones de PRP y PPP a cuatro grados Celsius durante un máximo de ocho a 10 días. Idealmente, utilizar plaquetas frescas para el ensayo de agregación.

Lave los glóbulos rojos periféricos sedimentados tres veces con cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 en un matraz de cultivo. Suplemente los GRP con medio de cultivo estándar para malaria y glóbulos rojos frescos no infectados para obtener un hematocrito del 5%. Sature los matraces de cultivo con una mezcla de 92,5% nitrógeno, 2,5% oxígeno y 5% dióxido de carbono. Luego selle y cultive para obtener parásitos maduros a partir de los GBM del paciente.

Incube el frasco de cultivo durante 24 a 36 horas en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Coloque aproximadamente de 10 a 15 microlitros de sangre en un extremo de una portaobjetos de vidrio esmerilado colocado sobre una superficie plana. Toque la gota de sangre con el borde de un segundo portaobjetos hasta que la sangre se distribuya uniformemente a lo largo del borde del segundo portaobjetos, manteniendo este portaobjetos en un ángulo de 45 grados.

Extienda rápidamente pero suavemente, sin ejercer demasiada presión sobre el primer portaobjetos, la sangre de forma uniforme a través del primer portaobjetos. Luego, seque al aire la película delgada de sangre, deshidrate el área del espécimen con metanol durante 10 segundos. A continuación, seque al aire y luego sumerja el espécimen en 2%keem.

Mantenga durante al menos 10 minutos. Enjuague abundantemente hasta que el agua salga clara y seque al aire. Examine las muestras bajo un objetivo de emulsión oleosa de 100 x en un microscopio óptico.

A continuación, purifique y sincronice el P. falciparum maduro, PRBC, según se describe en el protocolo escrito. Transfiera toda la cultura a un tubo estéril limpio de 15 mililitros. Pelote las células mediante centrifugación a temperatura ambiente a 370 ×g durante cinco minutos.

Ahora aspire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado. Luego, resuspenda las células de manera que una mitad del volumen total sea jello fusing. Un tercio de la segunda mitad es medio libre de proteínas y dos tercios de la segunda mitad son pbcs.

Transfiera la suspensión a un tubo estéril de 15 mililitros e incube de 15 a 20 minutos en un incubador a 37 grados Celsius hasta que se forme una delimitación clara entre las capas superior e inferior. Transfiera cuidadosamente la capa superior a un tubo estéril nuevo de 15 mililitros y agregue 10 mililitros de RPMI fresco. Centrifugue a 370-430 GS durante cinco minutos. Luego deseche cuidadosamente el sobrenadante.

Ahora evalúe el parásito y la etapa de desarrollo mediante frotis sanguíneo delgado y examine al microscopio óptico como se describió anteriormente. Ajuste la suspensión de GRP obtenida tras la flotación con gel de plasma a una concentración de un vez diez a la octava GRP por microlitro en un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Suspender las CPM al 5 % de hematocrito con naranja de acetometilina o bromuro de aterio a una concentración final de 20 microgramos por mililitro, y el PRP al 10 % del volumen total.

De manera similar, prepare los siguientes controles: glóbulos rojos no infectados, PRP y PRBC con PPP para determinar el papel de las plaquetas en la agregación de los PBC. Ahora transfiera la suspensión a un vial de dos mililitros con tapa roscada. Coloque el vial bajo agitación suave mediante rotación a 10-12 RRP a temperatura ambiente, tomando muestras a intervalos de 15 a 20 minutos durante un total de 120 minutos para verificar la formación de agregados.

Pipetee 10 microlitros de la muestra sobre un portaobjetos de vidrio y cúbralo con un cubreobjetos de vidrio para examinarlo mediante fluorescencia. Se considera un agregado como un conjunto de tres o más eritrocitos infectados. Este experimento analizó aproximadamente el 70 % de estadios maduros de p FALs parem tras el enriquecimiento mediante flotación con gel de plasma. Los agregados se observan fácilmente al microscopio como bajo luz normal. Aparecen como agregados celulares y bajo fluorescencia como manchas verdes o rojas.

Cuando se tiñen con acro y naranja o con colorantes de bromuro de atherium, respectivamente. El tamaño del agregado aumenta significativamente hasta un promedio superior a 15 PBC por agregado tras una incubación de 120 minutos, con algunos agregados que contienen numerosos PBC por agregado que no pudieron contarse visualmente. La frecuencia del fenotipo de agregación se calcula como el número de células infectadas presentes en agregados por cada 1000 células infectadas contadas en ensayos por duplicado.

Después de ver este video, ahora debería tener una comprensión clara de cómo realizar un ensayo de agregación mediado por plaquetas de plasmodium falciparum. Tenga cuidado de no activar las plaquetas con movimientos bruscos y variaciones de temperatura. Este ensayo también puede aplicarse para medir la agregación mediada por plaquetas en malaria grave.