Name: Imágenes bacteriana Bioluminiscente En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Descubre el seguimiento bacteriano en ratones vivos mediante imagen bioluminiscente. Este método permite monitorear el crecimiento de bacterias en xenoinjertos tumorales para desarrollar terapias oncológicas.

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Los autores desean agradecer el apoyo pertinente a este manuscrito de la Comisión Europea del Séptimo Programa Marco (PIOF-GA-2009-255.466) y el Consejo de Investigación en Salud de Irlanda (HRA_POR/2010/138). Lux-etiquetados E. coli fue una especie de regalo del doctor Cormac Gahan, University College Cork.

1. La inducción de tumores <ol><li> Para la inducción de tumores de rutina, la dosis tumorígena mínima de células suspendidas en 200 l de medio de cultivo libre de suero se inyecta por vía subcutánea (sc) en el flanco de la infección libre de 6-8 semanas de edad hembras Balb / C o ratones atímicos MF1-nu/nu n = 6 (Harlan, Oxfordshire, Reino Unido) (1 x 10 6 células 4T1) utilizando una aguja de jeringa de calibre 21-. La viabilidad de las células utilizadas para la inoculación fue mayor que 95% según se determinó por recuento visual usando un hemocitómetro y la exclusión del colorante azul de tripano (Gibco). </li><li> Después del establecimiento del tumor, los tumores se dejaron crecer y desarrollar y se monitorizó dos veces semanalmente. El volumen del tumor se calculó según la fórmula V = (ab 2) Π / 6, donde a es el diámetro más largo del tumor y b es el diámetro más largo perpendicular a un diámetro. </li></ol> 2. Preparación bacteriana <ol><li> La cepa bacteriana utilizada en este PROTOCOLO DEl fue E. coli K-12 MG1655, una proteína no-toxina que expresa cepa, que alberga un plásmido luxABCDE-codificación que permite a las bacterias para ser detectada por BLI. E. coli MG1655 que contienen el luxABCDE integrado se cultivó aeróbicamente a 37 ° C en medio LB (Sigma-Aldrich, Irlanda) suplementado con 300 mg / ml de eritromicina (Em). El derivado de MG1655 bioluminiscente se ha creado con el plásmido p16S lux que contiene la AYUDA P constitutiva luxABCDE operón 1. </li><li> Para la preparación para administración a ratones, los cultivos se incubaron en medio LB a 37 ° C en un agitador a 200 rpm hasta la fase logarítmica media-(densidad óptica a 600 nm). Las bacterias fueron cosechadas por centrifugación (6.000 xg durante 5 min), se lavaron con PBS (Sigma), y se diluyó en PBS 1 × 10 7 unidades formadoras de colonias (ufc) / ml para la administración IV, o 1 x 10 10 de alimentación forzada. </li></ol> 3. Bacteriana Administraciónción <ol><li> Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos experimentales cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm 3 en volumen. Para la administración intravenosa, los ratones recibieron cada uno restringidas 10 6 células en 100 l, se inyecta directamente en la vena lateral de la cola usando una aguja de jeringa 28G. El recuento de viables de cada inóculo se determinó mediante siembra retrospectiva. </li><li> Para los estudios de colonización GIT, 10 9 células bacterianas se administra por vía oral en 100 l por ratón por sonda, en tres días consecutivos. Preexistentes niveles de bacterias comensales se redujeron antes de la alimentación mediante la adición de 5 mg / ml de estreptomicina en el agua potable del ratón durante 7 días antes del comienzo de sonda oral 1. </li></ol> 4. Bioluminiscencia de imágenes <ol><li> 2D in vivo BLI imágenes se realizó usando el IVIS100 (pinza). En la administración de tiempo definido después de los puntos bacteriana, los ratones fueron anestesiados utilizando XGI-8 Caliper Anestesia GasSistema con 3% isofluorano, y todo el cuerpo de análisis de imágenes se realizó en el sistema IVIS 100 para 2-5 min a una sensibilidad alta. </li><li> Para imágenes en 3D, los ratones anestesiados se colocaron en un servicio de transporte de imágenes del ratón dentro del sistema de formación de imágenes ópticas para obtener imágenes de dorsal (IVIS Spectrum, Caliper). Para adquirir imágenes de la señal de luciferasa bacteriana para la reconstrucción óptica 3D, longitudes de onda de emisión de filtro que van desde 500 hasta 580 nm se utilizaron con tiempos de adquisición de bin 16 min de 3-4 por filtro para maximizar la relación señal a ruido. Como parte de esta secuencia de adquisición de imágenes, una imagen de luz estructurada se obtuvo para definir un mapa de altura. Este mapa fue difusa luz de entrada de imágenes de tomografía (dlit) reconstrucciones algoritmos que se utilizan para formar una imagen en 3D óptica usando un no negativo mínimo optimización cuadrados 2. </li><li> Análisis de imágenes: Las regiones de interés se identificaron y cuantificaron utilizando el software Image estar (pinza). </li></ol> 5. RepresentanteResultados En este estudio, las bacterias no patógenas comensales E. coli K-12 MG1655 que expresa el operón luxABCDE fue IV administrada a ratones portadores de xenoinjertos de tumores sc 4T1. Señal bacteriana lux se detectó específicamente en los tumores de los ratones después de administración IV-(Figura 2). Recuperación cultivo de bacterias a partir de ratones de muestra valida la existencia de una relación lineal entre el número de bacterias viables y la cantidad de luz detectada (Figura 3). Imágenes in vivo de administración oral las bacterias comensales en el GIT se consigue también el uso de 3D ​​BLI. <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1highres.jpg"/> Figura 1. Protocolo de línea de tiempo. Tumores subcutáneos son inducidos en ratones, y bacterias administrado en el desarrollo del tumor (100 mm 3). Ratones vivos son BLI imaños en la administración de diferentes puntos de tiempo posteriores bacteriana (flechas muestran los tiempos típicos). <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Administración de E. coli MG1655 luxABCDE a ratones portadores de tumor. subcutáneos tumores 4T1 fueron inducidos en MF1 ratones nu / nu y E. coli MG1655 luxABCDE administrado en el desarrollo del tumor. Cada animal recibió 10 6 células inyectadas directamente en la vena lateral de la cola. Los ratones fueron imágenes a cuatro puntos de tiempo durante el estudio (puntos negros eje z e imágenes) con la subsiguiente recuperación de bacterias viables (cfu) de tumores de los ratones sacrificados de muestra (gráfico de barras). Aumento en el número de bacterias y la expresión génica en tumores específicamente plásmido se observó en el tiempo (ratón representante ilustrado por punto de tiempo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4318/4318fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Relación entre el número de bacterias intratumorales y bioluminiscencia. Bacterias viables en los tumores fueron enumerados por ex cultivo bacteriano vivo de tumores posteriores a BLI en varios puntos de tiempo después de la administración IV. Los valores de log del número de bacterias (ufc) en relación con las unidades in vivo bioluminesce se grafican. Se observó una correlación robusta entre la carga bacteriana y señales bacterianas bioluminiscencia se observa R 2 = 0,9717 1. <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. 3D Image IVIS del tracto gastrointestinal murino colonizados por E. coli MG1655. El tracto gastrointestinal de los ratones fue colonizada por la administración oral de 10 9 ufc de E. coli por tres días consecutivos. Una imagen muestra aislada de tomografía 3D del ratón colonizados se muestra.Imágenes en 3D muestran un atlas ratón digital del esqueleto para proporcionar un registro anatómica. E. coli MG1655 bioluminiscencia es visible en verde en la inferior, y púrpura a niveles más altos.

<ol><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Postgrad+Med%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for prostate cancer.</a> Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).</li>
<li>Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+targeting+with+systemically+administered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumour targeting with systemically administered bacteria.</a> Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).</li>
<li>Collins, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+cancer+immunotherapy%3A+which+vector+for+which+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy.</a> Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).</li>
<li>Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditions+required+for+tumor+colonization+by+intravenously+delivered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).</li>
<li>Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+as+vectors+for+gene+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Bacteria as vectors for gene therapy of cancer.</a> Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bifidobacteria+as+vehicles+for+delivery+of+agents+to+systemic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors.</a> Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).</li>
<li>van Pijkeren, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Listeria+monocytogenes-based+DNA+delivery+system+for+cancer+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+effective+antitumor+response+after+mucosal+bacterial+vector+mediated+DNA+vaccination+with+endogenous+prostate+cancer+specific+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen.</a> J. Urol. 186, 687-693 (2011).</li>
<li>Riedel, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+luciferase+tagging+system+for+Listeria+monocytogenes+allows+real-time+monitoring+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro.</a> Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeting+prodrug-activating+bacteria+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy.</a> Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).</li>
<li>Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+intestinal+colonization+by+Escherichia+coli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).</li>
<li>Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+Imaging+For+Gene+%26+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">PET Imaging For Gene & Cell Therapy.</a> Curr. Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Tangney, M., Francis, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optical+Imaging+in+Gene+%26+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy.</a> Curr. Gene Ther. , (2012).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En el contexto de la terapia génica, la utilización de agentes biológicos para la entrega de genes terapéuticos a los pacientes ha demostrado una gran promesa 3-5. Al igual que los virus, las propiedades biológicas innatas de bacterias permitir el suministro eficiente de ADN a células o tejidos, en particular en el contexto del cáncer. Se ha demostrado que las bacterias son naturalmente capaces de homing a los tumores por administración sistémica que resulta en niveles altos de replicación a nivel local, ya s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Línea celular 4T1 </td><td> ATCC </td><td> CRL-2539 </td><td> Mama singénico modelo de cáncer derivado de un surja espontáneamente BALB / c tumor mamario </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td> Dulbecco modificada de Eagle </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8537 </td><td> Phosphate Buffered Saline </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td> IVIS 100 para imágenes 2D; Spectrum IVIS para 3D. </td></tr><tr><td> Caldo Luria Miller (LB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2542 </td><td> Crecimiento medio para E. coli </td></tr&gt; <tr><td> Eritromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5389 </td><td> Antibiótico </td></tr><tr><td> Estreptomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9137 </td><td> Antibiótico </td></tr><tr><td> MF1nu/nu ratones </td><td> Harlan (UK) </td><td> 069 (nu) / 070 (nu / +) </td><td> HSD: atímicos Nude-Foxn1nu </td></tr><tr><td> Ratones Balb / c </td><td> Harlan (UK) </td><td> 066 </td><td> Haplotipo: H-2 d </td></tr><tr><td> Aguja Gavage </td><td> Vet tecnología Solutions (Reino Unido) </td><td> DE009 </td><td> 22G x 38 mm aguja sonda recta </td></tr><tr><td> Jeringa para inyección IV </td><td> BD Biosciences </td><td> 309309 a 1 ml </td><td> La insulina jeringa con 28 G x ½ pulgada micro-fina aguja intravenosa. </td></tr><tr><td> Jeringa para la inoculación del tumor </td><td> Braun </td><td> 9161376V </td><td> Omnifix 26 G x &amp;frac12; aguja pulgadas </td></tr></tbody></table>

imágenes bacteriana bioluminiscente<em&gt; en vivo</em

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Este video describe el uso de todo el cuerpo bioluminesce formación de imágenes (BLI) para el estudio del tráfico bacteriana en ratones vivos, con énfasis en el uso de bacterias en terapia génica y celular para el cáncer. Las bacterias presentes una clase de vector atractivo para la terapia del cáncer, que posee una capacidad natural para crecer preferentemente dentro de los tumores después de la administración sistémica. Las bacterias genéticamente para expresar el gen lux casete permiso BLI detección de las bacterias y al mismo tiempo sitios de tumor. La ubicación y los niveles de las bacterias dentro de los tumores con el tiempo puede ser fácilmente examinado, visualizado en dos o tres dimensiones. El método es aplicable a una amplia gama de especies bacterianas y tipos de tumores de xenoinjertos. En este artículo se describe el protocolo para el análisis de bacterias bioluminiscentes en ratones portadores de tumores subcutáneos. La visualización de las bacterias comensales en el tracto gastrointestinal (GIT) por BLI también se describe. Este potente y barato, imágenes en tiempo real representación estrategiats un método ideal para el estudio de las bacterias in vivo en el contexto de la investigación del cáncer, en terapia génica particular, y las enfermedades infecciosas. Este video muestra el procedimiento para el estudio de lux-etiquetados E. coli en ratones vivos, lo que demuestra la lectura espacial y temporal alcanzable BLI utilizar con el sistema IVIS.

En este artículo se describe la administración de<em&gt; Lux-etiquetado</em&gt; Bacterias a ratones y posteriores<em&gt; In vivo</em&gt; Análisis utilizando imágenes IVIS bioluminiscencia.

Imágenes bacteriana Bioluminiscente<em&gt; En Vivo</em

Este video describe el uso de la técnica de imagen de bioluminiscencia de cuerpo completo (BLI) para el estudio del tráfico bacteriano en ratones vivos, haciendo hincapié en el uso de...

Este vídeo describe el uso de la imagen bioluminiscente de cuerpo entero para el estudio del tráfico bacteriano en ratones vivos, con énfasis en la detección del crecimiento bacteriano dentro de xenoinjertos tumorales. Las bacterias representan una clase atractiva de vectores para la terapia contra el cáncer, ya que poseen la capacidad natural de crecer preferentemente dentro de los tumores tras la administración intravenosa, ya sea en el exterior o en el interior de las células tumorales. Las cepas bacterianas modificadas genéticamente para expresar el casete del gen lux facilitan la detección simultánea de las bacterias y de los tumores. El valor del monitoreo longitudinal no invasivo de cepas bacterianas in vivo es ampliamente reconocido, ya que reduce el uso de animales y genera datos estadísticamente más relevantes que los ensayos de punto final.Este procedimiento implica la inducción de tumores subcutáneos en ratones. Se permite que los tumores se desarrollen y se monitorean a lo largo del tiempo. Se administran bacterias y los ratones se someten a imágenes de bioluminiscencia en puntos de tiempo determinados para los experimentos descritos aquí.Se inducen tumores subcutáneos

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Métodos para obtener imágenes de bioluminiscencia de las infecciones bacterianas en los animales vivos se describen. Los patógenos son modificadas para expresar luciferasa permitiendo imágenes ópticas de todo el cuerpo de las infecciones en los animales vivos. Los modelos animales pueden ser infectados con agentes patógenos que expresan luciferasa y el curso de la enfermedad como resultado visualizado en tiempo real de imágenes de bioluminiscencia.

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Aquí describimos los métodos para construir, visualizar y cuantificar las reacciones bioluminiscentes de las enzimas luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla expresadas en células de cáncer de mama metastásico durante su crecimiento y metástasis. in vivo.

En vivo doble sustrato bioluminiscentes imagen

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Fuente: Wang, Y., et al. In Vivo Investigación de la terapia antimicrobiana de luz azul para infecciones por quemaduras multirresistentes a Acinetobacter baumannii mediante imágenes de bioluminiscencia. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo muestra el procedimiento para obtener imágenes de infecciones de quemaduras en ratones inoculados con Acinetobacter baumannii que portan un operón bioluminiscente. Demuestra cómo la oxidación del sustrato catalizada por luciferasa produce luz proporcional a la carga...

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Combinado de imágenes ópticas y μCT en un modelo de ratón de infección implante ortopédico, la utilización de una cepa bioluminiscente ingeniería de Staphylococcus aureus, siempre que la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente la dinámica de la infección bacteriana, así como la respuesta inflamatoria correspondiente y cambios anatómicos en la hueso.

Combinado<em&gt; En vivo</em&gt; Óptica y μCT imágenes para vigilar la infección, inflamación y Hueso anatomía en una infección de implantes ortopédicos en ratones

Las infecciones causadas por cepas bacterianas multirresistentes (MDR) se han convertido en una grave amenaza para la salud pública, lo que requiere el desarrollo de terapias alternativas. Presentamos un protocolo para evaluar la efectividad de la terapia antimicrobiana con luz azul (aBL) para las infecciones por MDR Acinetobacter baumannii en quemaduras de ratón mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia.

En Vivo Investigación de Terapia de luz azul antimicrobianos para multirresistente Acinetobacter baumannii infecciones de quemaduras El uso de bioluminiscencia Imaging

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Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

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In Situ Medición y correlación de la densidad celular y emisión de luz de bacterias bioluminiscentes

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de ratón con tumores para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia dual.

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El protocolo proporcionado aquí describe los pasos detallados para realizar estudios de eficacia de fármacos en un modelo bioluminiscente de infección por Trypanosoma cruzi , con un enfoque en la adquisición, análisis e interpretación de datos. También se proporcionan procedimientos de solución de problemas y control de calidad para minimizar los problemas técnicos.

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Descubre el seguimiento bacteriano en ratones vivos mediante imagen bioluminiscente. Este método permite monitorear el crecimiento de bacterias en xenoinjertos tumorales para desarrollar terapias oncológicas.

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